[논문]형광 발현 암세포 탐지를 위한 맞춤형 검출시스템 개발

조경래; 서정혁; 최세운

doi:10.6109/jkiice.2019.23.3.261

형광 발현 암세포 탐지를 위한 맞춤형 검출시스템 개발
Design of a customizable fluorescence detection system for fluorescently labeled tumor cells 원문보기

한국정보통신학회논문지 = Journal of the Korea Institute of Information and Communication Engineering, v.23 no.3, 2019년, pp.261 - 266

조경래 (Department of Medical IT Convergence Engineering, Kumoh National Institute of Technology) , 서정혁 (Department of Medical IT Convergence Engineering, Kumoh National Institute of Technology) , 최세운 (Department of Medical IT Convergence Engineering, Kumoh National Institute of Technology)

초록
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유동 세포 분석법은 세포나 입자에 대하여 정밀하고 다양한 광학적 특성을 제공해주는 전기적 탐지 기술이다. 형광 처리된 세포나 미립자에 특정한 파장의 빛을 가함으로써 발생 되는 광 산란과 형광 방출을 통해 세포의 크기와 입상도를 포함한 다차원적인 정보를 제공해주는 유동 세포 분석법은 생체 의학 분야 또는 생물 물리학 분야에서 중요한 역할을 수행한다. 그러나 유동 세포 분석법은 고가이며 장비 설치에 있어 적절한 공간이 필요하고 형광 염료 선택에 제한적이라는 단점을 가지고 있다. 따라서 본 논문에서는, 상용화된 유동 세포 분석에 사용되는 고가의 레이저와 운영시스템 대신 발광 다이오드, 마이크로 컨트롤러와 광 검출기를 사용한 저가의 형광세포 측정 시스템을 개발하여 사용자가 원하는 형광 염료에 대한 자유도를 높였다. 또한, 3D 프린터를 사용하여 모듈별 소형화 및 경량화를 통한 사용자 맞춤형 제작이 가능하도록 하였다. 그 결과, 형광처리 한 세포의 양에 변화를 주어 발광도를 측정하였을 때, 높은 선형성이 보임을 확인할 수 있었다.

Abstract ▼ AI-Helper

Flow cytometry is an electrical detection system that provides precise and diverse optical properties to cells and micro particles. Flow cytometry, which provides multidimensional information including cell size and granularity through light scattering and fluorescence emission generated by the induction of light of a specific wavelength to the fluorescently treated cells or micro particles, plays an important role in biomedical and biophysical fields. However, it has some drawbacks such as high cost, size of the instrument and limitation in selecting fluorescent dyes. Therefore, in this paper, a low cost compact fluorescent detection system is developed using light-emitting diode and microcontroller. The proposed fluorescence detection system has a replaceable the light source/fluorescence filter/photodetector and constructed by 3D printer, so that the user can design a customized system according to the selected fluorescent dyes. The fluorescence intensity was measured by varying the number of fluorescently labeled cells, and the measured intensities showed a high linearity within the tested concentration ranges.

주제어

표/그림 (9)

그림 Fig. 1 Schematic design of a general FCM
그림 Fig. 2 Types of light scattering from a single cell.
그림 Fig. 3 Calcein AM spectra (top) and fluorescence image of calcein AM-stained HeLa cells (bottom)
그림 Fig. 4 Proposed fluorescence detection system. Constant current module (left), main module (middle) and display module (right)
그림 Fig. 5 Proposed constant current module (top) and its design (bottom)
그림 Fig. 6 Schematic design of the main module
그림 Fig. 7 Optical filter booklet (top) and selected excitation with emission filters (bottom)
그림 Fig. 8 The experimental results of the emitted light intensities of unstained (control) and stained HeLa cells with different photodiode sensitivities and various filter sets. (a) No excitation filter with #389 emission filter, (b) #74 excitation filter with #389 emission filter, (c) #369 excitation filter with #389 emission filter
표 Table. 1 Total cost of proposed system

AI 본문요약
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문제 정의

본 논문에서는 저가의 LED와 마이크로 컨트롤러를 활용하여 저렴한 소형 형광 탐지 시스템을 설계하였다. 제안된 시스템은 휴대 또는 이동이 가능하며, 광원과 형광 필터, 광 검출기의 교체가 용이하도록 3D 프린터로 설계되었다.

제안 방법

3D 프린터 (Cubicon DP-310F, Cubicon Inc., Korea)를 통해 메인 모듈의 구조물은 광다이오드와 렌즈의 장착이 쉽고 자유로운 교체가 가능하도록 제작되었으며, 검정색 ABS 플라스틱 필라멘트를 사용하여 불필요한 빛의 산란을 방지하였다. 뿐만 아니라, 유리 큐벳의 각 면의 평행한 위치에 광학필터의 슬롯을 두어 형광 염료에 따라 다른 형광 필터를 선택적으로 사용할 수 있으며 빛의 경로를 제어할 수 있도록 제작하였다.
HeLa 세포 (n = 6)는 형광처리를 한 실험군과 형광처리를 하지 않은 대조군으로 분류한 뒤 측정하였다. 실험은 동일한 이차 형광 필터(#389)에 일차 형광 필터 (#369 와 #74)와 부하 저항을 각각 교체하며 형광의 세기를 측정하였다.
이렇게 만들어진 여섯 가지 실험 군 샘플은 실온의 암실에서 동일한 조건으로 형광이 측정되었다. 각각의 세포 수마다 6회씩 형광이 측정되었으며, 동일한 조건의 형광처리를 하지 않은 대조 군 샘플과 각각 그 값을 비교하였다.
또한, FCM은 다차원적인 광학적 데이터를 제공하므로, 형광처리를 한 세포나 입자의 수를 측정하는 등의 단순한 데이터만 얻고자 하는 사용자에게 있어서 불필요한 데이터를 제공할 수 있으며, 이는 측정시간의 지연 및 사용금액의 증가 등을 요구하게 된다. 따라서, 본 연구에서는 상용화된 발광다이오드(light-emitting diode; LED)와 마이크로컨트롤러를 활용하여 저가이며 소형인 형광측정시스템을 설계하였다. 제안된 시스템은 3D 프린터를 이용하여 출력할 수 있으므로 사용 목적에 따라 다양하게 제작할 수 있다는 장점이 있으며, 또한 형광 필터와 광원, 광 검출기의 교체가 가능하게 제작되어 다양한 형광 염료에 대한 활용이 가능하다.
, Korea)를 통해 메인 모듈의 구조물은 광다이오드와 렌즈의 장착이 쉽고 자유로운 교체가 가능하도록 제작되었으며, 검정색 ABS 플라스틱 필라멘트를 사용하여 불필요한 빛의 산란을 방지하였다. 뿐만 아니라, 유리 큐벳의 각 면의 평행한 위치에 광학필터의 슬롯을 두어 형광 염료에 따라 다른 형광 필터를 선택적으로 사용할 수 있으며 빛의 경로를 제어할 수 있도록 제작하였다.
HeLa 세포 (n = 6)는 형광처리를 한 실험군과 형광처리를 하지 않은 대조군으로 분류한 뒤 측정하였다. 실험은 동일한 이차 형광 필터(#389)에 일차 형광 필터 (#369 와 #74)와 부하 저항을 각각 교체하며 형광의 세기를 측정하였다. 형광을 측정하기 전, LED의 출력의 안정성을 위하여 30분 전 정전류 모듈을 예열하였으며, 암실에서 실온의 조건으로 실험을 진행하였다.
본 논문에서는 저가의 LED와 마이크로 컨트롤러를 활용하여 저렴한 소형 형광 탐지 시스템을 설계하였다. 제안된 시스템은 휴대 또는 이동이 가능하며, 광원과 형광 필터, 광 검출기의 교체가 용이하도록 3D 프린터로 설계되었다. 제안된 시스템을 통해 형광처리를 한 HeLa 세포와 형광처리를 하지 않은 세포의 형광 강도를 측정 한 결과, 전체적으로 세포 수와 비례한 높은 선형성 (r²≻ 0.
형광 처리된 HeLa 세포는 여섯 가지의 다른 세포 수 (1,2,3,4,5,6 × 106 cells) 로 준비하여 유리 큐벳에 위치시키고, 유리 큐벳의 내부에 자석 교반기가 회전하게 하여 세포가 샘플 내에서 일정한 속도로 이동하게 하였다.
그림 7과 같이 일차 광학 필터로 Tahitian Blue (#369, 470 nm)와 Night Blue (#74, 480 nm)를 사용하였으며, 이차 광학 필터로는 Chroma Green (#389, 500 nm)를 사용하여 원하는 파장대의 빛을 선택적으로 획득할 수 있도록 하였다. 형광 필터는 고가의 광학필터 대신, 필터 책자 (filter booklets, Edmund Optics, USA)를 사용하여 필터의 선택이 용이하도록 하였다. 형광 처리된 HeLa 세포는 여섯 가지의 다른 세포 수 (1,2,3,4,5,6 × 10⁶cells) 로 준비하여 유리 큐벳에 위치시키고, 유리 큐벳의 내부에 자석 교반기가 회전하게 하여 세포가 샘플 내에서 일정한 속도로 이동하게 하였다.
실험은 동일한 이차 형광 필터(#389)에 일차 형광 필터 (#369 와 #74)와 부하 저항을 각각 교체하며 형광의 세기를 측정하였다. 형광을 측정하기 전, LED의 출력의 안정성을 위하여 30분 전 정전류 모듈을 예열하였으며, 암실에서 실온의 조건으로 실험을 진행하였다. 형광처리를 한 실험군과 형광처리를 하지 않은 대조군의 형광의 세기의 차이를 그림 8과 같이 그래프로 나타내었다.

대상 데이터

HeLa 세포 (한국 세포주 은행, 대한민국)는 37°C와 5 %의 이산화탄소를 포함한 환경의 배양기에서 증식시켰다.
그림 7과 같이 일차 광학 필터로 Tahitian Blue (#369, 470 nm)와 Night Blue (#74, 480 nm)를 사용하였으며, 이차 광학 필터로는 Chroma Green (#389, 500 nm)를 사용하여 원하는 파장대의 빛을 선택적으로 획득할 수 있도록 하였다. 형광 필터는 고가의 광학필터 대신, 필터 책자 (filter booklets, Edmund Optics, USA)를 사용하여 필터의 선택이 용이하도록 하였다.

성능/효과

Calcein AM은 1uM/ml의 농도로 HeLa 세포와 30분 간 담지 하면 형광물질이 세포막을 통해 세포의 내부로 들어가게 되어 녹색 형광을 나타내는 calcein으로 변환된다. calcein으로 변환된 calcein AM은 세포막을 통과하지 못하기 때문에 살아있는 HeLa 세포에 축적되어 그림 3과 같이 490 nm 파장의 빛에서 형광 반응을 보이는 것을 확인하였다.
시스템의 성능을 평가하기 위하여 calcein-AM으로 형광 처리된 자궁경부암 세포 (Human cervical cancer cells; HeLa cells)의 FSC를 각각 다른 세포 수와 조건으로 측정하였고, 그 결과, 제안된 시스템을 통하여 획득된 FSC는 세포 수와 비례한 선형성 ( r2 > 0.9)을 보였다.
제안된 시스템을 통해 형광처리를 한 HeLa 세포와 형광처리를 하지 않은 세포의 형광 강도를 측정 한 결과, 전체적으로 세포 수와 비례한 높은 선형성 (r2 ≻ 0.9)을 확인할 수 있었다.
형광의 차이는 세포 수와 비례하여 높은 선형성 (r2 ≻ 0.9) 을 보였으며, 특히 높은 투과율을 가지고 있는 일차 형광 필터 (#389, 470 nm)와 높은 부하저항 (390 KΩ)이 연결된 조건에서 형광의 변화는 준비된 세포의 농도에 가장 민감한 변화를 보였다.

후속연구

또한, 제안된 형광측정 시스템을 이용하여 형광을 측정하였을 때, 역으로 형광을 발현하는 세포 또는 미세입자의 농도측정 역시 가능하게 된다. 따라서, 제안된 본 장비는 고가이며 이동이 불가능하며, 사용이 제한적인 기존의 FCM을 대체할 수 있는 장비로 활용이 가능할 것으로 판단되며, 다양한 형광 염료 및 인간 질환 세포의 검출을 위한 활용 가능성 증대와 검출 정확도의 향상을 위한 시스템의 최적화에 관련된 후속연구가 진행될 예정이다.
따라서, 본 연구에서는 상용화된 발광다이오드(light-emitting diode; LED)와 마이크로컨트롤러를 활용하여 저가이며 소형인 형광측정시스템을 설계하였다. 제안된 시스템은 3D 프린터를 이용하여 출력할 수 있으므로 사용 목적에 따라 다양하게 제작할 수 있다는 장점이 있으며, 또한 형광 필터와 광원, 광 검출기의 교체가 가능하게 제작되어 다양한 형광 염료에 대한 활용이 가능하다. 그리고, 광원의 입사 방향과 평행하거나 수직인 면에 필터 슬롯을 두어 빛의 경로를 자유롭게 유도할 수 있게 하였다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	유동 세포 분석법은 어떤 방식으로 정보를 제공하는가?	유동 세포 분석법은 세포나 입자에 대하여 정밀하고 다양한 광학적 특성을 제공해주는 전기적 탐지 기술이다. 형광 처리된 세포나 미립자에 특정한 파장의 빛을 가함으로써 발생 되는 광 산란과 형광 방출을 통해 세포의 크기와 입상도를 포함한 다차원적인 정보를 제공해주는 유동 세포 분석법은 생체 의학 분야 또는 생물 물리학 분야에서 중요한 역할을 수행한다. 그러나 유동 세포 분석법은 고가이며 장비 설치에 있어 적절한 공간이 필요하고 형광 염료 선택에 제한적이라는 단점을 가지고 있다.
	유동 세포 분석법은 무엇인가?	유동 세포 분석법 (Flow cytometry; FCM)은 흐르는 유체 안의 형광 처리한 세포나 미생물, 핵 및 염색체와 같은 단일 입자에 특정한 파장의 빛을 인가하였을 때 발 현하는 특정 파장의 발광도를 측정하여 세포 또는 미세 입자의 개수를 세거나 분류가 가능한 전기적 탐지 기술이다 [1]. FCM을 이용하면 형광 처리된 세포나 미세입자의 광 산란과 형광 방출의 특징을 측정하여 크기 및 입상도를 포함한 다차원적 정밀분석이 가능하며, 지난 50년간의 기술발전을 통해 최대 14가지 이상의 광학적 분석데이터가 동시 측정이 가능하게 되었다 [2].
	사용이 제한적인 기존의 FCM을 대체하는 시스템은?	본 논문에서는 저가의 LED와 마이크로 컨트롤러를 활용하여 저렴한 소형 형광 탐지 시스템을 설계하였다. 제안된 시스템은 휴대 또는 이동이 가능하며, 광원과 형 광 필터, 광 검출기의 교체가 용이하도록 3D 프린터로 설계되었다.

참고문헌 (8)

Y. Chen, A. A. Nawaz, Y. Zhao, P. H. Huang, J. P. McCoy, S. .J. Levine, L. Wang, and T. J. Huang, "Standing surface acoustic wave (SSAW)-based microfluidic cytometer," Lab on a Chip, vol. 14, no. 5, pp. 916-923, Mar. 2014.

상세보기
R. Lacroix, S. Robert, P. Poncelet, and F. Dignat-George, "Overcoming Limitations of Microparticle Measurement by Flow Cytometry," Seminars Thrombosis Hemostasis, vol. 36, no. 8, pp. 807-818, Nov. 2010.
V. Pospichalova, J. Svoboda, Z. Dave, A. Kotrbova, K. Kaiser, D. Klemova, L. Ilkovics, A. Hampl, I. Crha, E, Jandakova, L. Minar, V. Weinberger, and V. Bryja, "Simplified protocol for flow cytometry analysis of fluorescently labeled exosomes and microvesicles using dedicated flow cytometer," The Journal of Extracellular Vesicles, vol. 4, no. 1, 25530, Mar. 2015.
S. Choe, K. Park, C. Park, J. Ryu, and H. Choi, "Combinational light emitting diode-high frequency focused ultrasound treatment for HeLa cell," Computer Assisted Surgery, vol. 22, pp. 79-85, Dec. 2017.

상세보기
M. J. Wilkerson, "Principles and applications of flow cytometry and cell sorting in companion animal medicine," Veterinary Clinics of North America: Small Animal Practice, vol. 42, no. 1, pp. 53-71, Jan. 2012.

상세보기
S. Cointe, C. Judicone, S. Robert, M. J. Mooberry, P. Poncelet, M. Wauben, R. Nieuwland, N. S. Key, F. DignatGeorge, and R. Lacroix, "Standardization of microparticle enumeration across different flow cytometry platforms: results of a multicenter collaborative workshop," Journal of Thrombosis and Haemostasis, vol. 15, no. 1, pp. 187-193, Jan. 2017.

상세보기
K. Cho, and S. Choe, "Development of low cost module for proliferation control of cancer cells using LED and its therapeutic effect," Journal of the Korea Information and Communication Engineering, vol. 22, no. 9, pp. 1237-1242, Sep. 2018.
K. Cho, and S. Choe, "Basic study on proliferation control of cancer cells using combined ultrasound and LED therapeutic module," Journal of the Korea Information and Communication Engineering, vol. 22, no. 8, pp. 1107-1113, Aug. 2018.

저자의 다른 논문 :

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표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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