[논문]소나무 침엽에서 분리된 3종의 국내 미기록 내생균

박혁; 엄안흠

doi:10.4489/kjm.20190005

소나무 침엽에서 분리된 3종의 국내 미기록 내생균
Three Unreported Endophytic Fungi Isolated from Conifer Leaves of Pinus densiflora in Korea 원문보기

한국균학회지 = The Korean journal of mycology, v.47 no.1, 2019년, pp.35 - 42

박혁 (한국교원대학교 생물교육과) , 엄안흠 (한국교원대학교 생물교육과)

초록
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본 연구에서는 전북 부안군에 서식하는 소나무의 침엽에서 내생균을 분리하였다. 분리된 균주는 internal transcribed spacer 영역, rDNA의 large subunit 영역, beta-tubulin 영역의 DNA 염기서열을 분석하여 동정하였다. 연구 과정에서 3종의 국내 미기록 내생균 균주를 확인하였으며, 확인된 종은 Paracamarosporiumhawaiiense, Tubakia dryina, Zasmidiumfructigenum이다. 확인된 미기록 균주의 형태적 특성 및 계통적 분석의 결과에 대해 서술하였다.

Abstract ▼ AI-Helper

We isolated endophytic fungi from the conifer leaves of Pinus densiflora inhabiting Buan-gun, Jeollabuk-do, Korea. We identified the isolated fungal strains based on phylogenetic analysis performed using the nucleotide sequences of the internal transcribed spacer, large subunit, and beta-tubulin. We confirmed the presence of three novel endophytic fungi in Korea, namely Paracamarosporium hawaiiense, Tubakia dryina, and Zasmidium fructigenum. In this report, we described the morphological characteristics of these fungal strains and the results of their phylogenetic analysis.

주제어

표/그림 (6)

표 Table 1. Morphological characteristics of fungal strains isolated from Pinus densifora.
표 Table 2. List of fungal species used in phylogenetic analysis with the GenBank accession numbers
그림 Fig. 1. Colonies of Paracamarosporium hawaiiense 16B647 grown for 7 days on potato dextrose agar (A) and malt extract agar (E), conidia (D, H). Colonies of Tubakia dryina (16B554) grown for 7 days on PDA (B) and MEA (F), conidiophore and conidia (I, J). Colonies of Zasmidium fructigenum (16B210) grown for 7 days on PDA (C) and MEA (G), conidiophore and conidia (K, L). (scale bars =10 μm).
그림 Fig. 2. Neighbor-joining phylogenetic tree based on a concatenated alignment of internal transcribed spacer and large subunit sequences. Phaeosphaeria pontiformis was used as an outgroup. Numbers on branches indicate bootstrap values (1,000 replicates). Fungal strain isolated in this study is in bold.
그림 Fig. 3. Neighbor-joining phylogenetic tree based on a concatenated alignment of internal transcribed spacer, large subunit and beta-tubulin sequences. Xylaria hypoxylon was used as an outgroup. Numbers on branches indicate bootstrap values (1,000 replicates). Fungal strain isolated in this study is in bold.
그림 Fig. 4. Neighbor-joining phylogenetic tree based on a concatenated alignment of internal transcribed spacer and large subunit sequences. Xylaria hypoxylon was used as an outgroup. Numbers on branches indicate bootstrap values (1,000 replicates). Fungal strain isolated in this study is in bold.

AI 본문요약
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문제 정의

이렇게 분비되는 2차 대사산물 중 Alternaria속의 균류에서 분비되는 alternariol [4], Taxus속의 식물 잎에 공생하는 내생균이 분비하는 taxol [5] 등 항암 혹은 항균 작용을 하는 물질들이 확인됨으로써 내생균에 대한 연구의 가치는 점차 증가하고 있다. 본 연구에서는 전북 부안의 계화산 소나무 침엽에서 내생균을 분리하였으며, 그 과정에서 확인된 국내 미기록종 3종 의 형태적, 분자생물학적 특성에 대해 보고하고자 한다.
연구 과정에서 3종의 국내 미기록 내생균 균주를 확인하였으며, 확인된 종은 Paracamarosporiumhawaiiense, Tubakia dryina, Zasmidiumfructigenum이다. 확인된 미기록 균주의 형태적 특성 및 계통적 분석의 결과에 대해 서술하였다.

제안 방법

5% agarose gel에 20분간 loading하여 각각 단편의 크기를 확인한 후 염기서열 분석을 의뢰하였다(SolGent, Daejeon, Korea). DNA 염기서열은 미국국립생물정보센터(NCBI)에서 BLAST하여 유사도를 확인하고, MEGA7 프로그램[9]을 이용하여 두 영역 혹은 세 영역의 염기서열을 연쇄 시켜 neighbor-joinning 방식으로 계통수를 작성하였으며 분석에 이용된 참고 서열들은 Table 2에 나타내었다. 확인된 미기록종 균주는 국립생물자원관(NIBR)에 기탁하였으며, BLAST 결과 및 계통 수 작성에 이용된 염기서열은 NCBI의 GenBank에 등록하였다.
PCR반응의 annealing 단계에서 ITS영역은 50°C, LSU영역은 44°C, TUB 영역은 55°C로 설정하였다. PCR이 끝난 DNA는 1.5% agarose gel에 20분간 loading하여 각각 단편의 크기를 확인한 후 염기서열 분석을 의뢰하였다(SolGent, Daejeon, Korea). DNA 염기서열은 미국국립생물정보센터(NCBI)에서 BLAST하여 유사도를 확인하고, MEGA7 프로그램[9]을 이용하여 두 영역 혹은 세 영역의 염기서열을 연쇄 시켜 neighbor-joinning 방식으로 계통수를 작성하였으며 분석에 이용된 참고 서열들은 Table 2에 나타내었다.
배지를 25°C에서 3일 이상 배양하면서 치상된 식물체에서 균사가 뻗어 나오면 메스를 이용하여 새로운 PDA배지로 계대 배양하였으며, 순수 분리된 균주는 PDA배지와 더불어 malt extract agar (MEA)배지에서 7일간 배양하여 해부현미경 및 광학현미경 상에서 형태적 특성을 관찰하였다(Table 1).
시료의 채집은 2016년 4월 전북 부안군에 위치한 계화산 부근(N35°47'18", E126°37'56")에서 진행되었다. 병증이 나타나지 않은 건강한 소나무 침엽을 채취하여 24시간 이내에 실험실로 운반하였으며, 실험실에서 곧바로 표면살균을 진행하였다. 표면살균은 1%의 NaClO 용액에서 1분, 70% EtOH에서 2분을 차례로 진행하였으며, 표면살균된 잎을 적당한 크기로 등분하여 potato dextrose agar (PDA)배지에 치상하였다.
본 연구에서는 전북 부안군에 서식하는 소나무의 침엽에서 내생균을 분리하였다. 분리된 균주는 internaltranscribed spacer 영역, rDNA의 large subunit 영역, beta-tubulin 영역의 DNA 염기서열을 분석하여 동정하였다. 연구 과정에서 3종의 국내 미기록 내생균 균주를 확인하였으며, 확인된 종은 Paracamarosporiumhawaiiense, Tubakia dryina, Zasmidiumfructigenum이다.
병증이 나타나지 않은 건강한 소나무 침엽을 채취하여 24시간 이내에 실험실로 운반하였으며, 실험실에서 곧바로 표면살균을 진행하였다. 표면살균은 1%의 NaClO 용액에서 1분, 70% EtOH에서 2분을 차례로 진행하였으며, 표면살균된 잎을 적당한 크기로 등분하여 potato dextrose agar (PDA)배지에 치상하였다. 배지를 25°C에서 3일 이상 배양하면서 치상된 식물체에서 균사가 뻗어 나오면 메스를 이용하여 새로운 PDA배지로 계대 배양하였으며, 순수 분리된 균주는 PDA배지와 더불어 malt extract agar (MEA)배지에서 7일간 배양하여 해부현미경 및 광학현미경 상에서 형태적 특성을 관찰하였다(Table 1).
배지를 25°C에서 3일 이상 배양하면서 치상된 식물체에서 균사가 뻗어 나오면 메스를 이용하여 새로운 PDA배지로 계대 배양하였으며, 순수 분리된 균주는 PDA배지와 더불어 malt extract agar (MEA)배지에서 7일간 배양하여 해부현미경 및 광학현미경 상에서 형태적 특성을 관찰하였다(Table 1). 형태적으로 분류된 균주의 동정을 위해 DNeasy plant mini kit (Qiagen, Germantown, MD, USA)의 protocol에 따라 균사에서 DNA를 추출한 뒤, rDNA의 5.8S 지역을 포함하는 internal transcribed spacer (ITS)영역을 균류 특이적인 primer인 ITS1F와 ITS4 [6]를 이용하여 증폭하였으며, 더 정확한 동정을 위하여 rDNA의 large subunit (LSU)영역을 primerLR0R과 LR16 [7]을 이용하여 증폭하였고, beta-tublin (TUB) 영역을 primer Bt2a와 Bt2b [8]를 이용하여 증폭하였다. PCR반응의 annealing 단계에서 ITS영역은 50°C, LSU영역은 44°C, TUB 영역은 55°C로 설정하였다.

대상 데이터

본 연구에서는 전북 부안군에 서식하는 소나무의 침엽에서 내생균을 분리하였다. 분리된 균주는 internaltranscribed spacer 영역, rDNA의 large subunit 영역, beta-tubulin 영역의 DNA 염기서열을 분석하여 동정하였다.
시료의 채집은 2016년 4월 전북 부안군에 위치한 계화산 부근(N35°47'18", E126°37'56")에서 진행되었다.
DNA 염기서열은 미국국립생물정보센터(NCBI)에서 BLAST하여 유사도를 확인하고, MEGA7 프로그램[9]을 이용하여 두 영역 혹은 세 영역의 염기서열을 연쇄 시켜 neighbor-joinning 방식으로 계통수를 작성하였으며 분석에 이용된 참고 서열들은 Table 2에 나타내었다. 확인된 미기록종 균주는 국립생물자원관(NIBR)에 기탁하였으며, BLAST 결과 및 계통 수 작성에 이용된 염기서열은 NCBI의 GenBank에 등록하였다.

성능/효과

주로 밤나무 혹은 떡갈나무등 참나무과의 잎에서 내생균으로 분리된 기록들이 존재하며[19, 20], isosclerone, 6-hydroxymellein 등의 여러 가지 식물독성 대사산물을 생성하는 것으로 알려져 있으며[21], 특히 isosclerone의 경우 인간 유방암 세포의 증식을 억제하는 효과가 있는 물질로 보고되어 있다[12]. ITS 영역과 LSU 영역, TUB 영역의 DNA 염기서열 분석 결과 ITS 영역은 T. dryina KR362909.1과 99%의 일치도를, LSU 영역은 T. dryina MH872665.1과 100%의 일치도를 보였고, TUB 영역은 T. dryina MG592149.1과 97%의 일치도를 보였으며 모두 같은 계통을 형성하였다(Fig. 3).
본 연구에서는 갈색 타원형의 투명한 분생자가 관찰되었으며, 이것은 원 기재문에 기록된 분생자의 특성과 일치하였다[14]. ITS 영역과 LSU 영역의 DNA 염기서열 분석 결과 ITS 영역은 P. hawaiiense JN198395.1과 99%의 일치도를, LSU 영역은 P. hawaiiense JX496140.1과 99%의 일치도를 보였으며 모두 같은 계통을 형성하였다(Fig. 2).
연한 갈색의 원통형 분생자가 분지되어 형성되는 것이 특징이며[22], 본 연구에서 확인된 분생자도 같은 형태를 이루는 것을 확인하였다. ITS 영역과 LSU 영역의 DNA 염기서열 분석 결과 ITS 영역은 Z. fructigenumKP896060.1과 99%의 일치도를, LSU 영역은 Z. fructigenumKP895927.1과 99% 의 일치도를 보였으며 모두 같은 계통을 형성하였다(Fig. 4).
분리된 균주는 internaltranscribed spacer 영역, rDNA의 large subunit 영역, beta-tubulin 영역의 DNA 염기서열을 분석하여 동정하였다. 연구 과정에서 3종의 국내 미기록 내생균 균주를 확인하였으며, 확인된 종은 Paracamarosporiumhawaiiense, Tubakia dryina, Zasmidiumfructigenum이다. 확인된 미기록 균주의 형태적 특성 및 계통적 분석의 결과에 대해 서술하였다.
최근에 파나마의 맹그로브 식물인 Laguncularia racemose 잎에서 Zasmidium에 속하는 균주가 내생균으로 분리되었으며, 균주에서 추출된 물질이 당뇨병 치료에 이용되는 α-Glucosidase inhibitor로써 작용한다는 연구결과가 존재한다 [23]. 연한 갈색의 원통형 분생자가 분지되어 형성되는 것이 특징이며[22], 본 연구에서 확인된 분생자도 같은 형태를 이루는 것을 확인하였다. ITS 영역과 LSU 영역의 DNA 염기서열 분석 결과 ITS 영역은 Z.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	내생균이란 무엇인가?	식물과 공생하는 균류인 내생균(endophytic fungi)은 식물체의 조직 내에 감염되지만 병증을 일으키지 않고 살아가는 균류를 지칭한다[1]. 내생균은 식물체 내에서 2차 대사산물을 분비함으로써 숙주 식물이 환경스트레스에 저항성을 가질 수 있게 하며[2], 초식곤충 등 포식자에 대한 화학적인 방어를 제공하기도 한다[3].
	내생균은 어떤 기능을 가지고 있는가?	식물과 공생하는 균류인 내생균(endophytic fungi)은 식물체의 조직 내에 감염되지만 병증을 일으키지 않고 살아가는 균류를 지칭한다[1]. 내생균은 식물체 내에서 2차 대사산물을 분비함으로써 숙주 식물이 환경스트레스에 저항성을 가질 수 있게 하며[2], 초식곤충 등 포식자에 대한 화학적인 방어를 제공하기도 한다[3]. 이렇게 분비되는 2차 대사산물 중 Alternaria속의 균류에서 분비되는 alternariol [4], Taxus속의 식물 잎에 공생하는 내생균이 분비하는 taxol [5] 등 항암 혹은 항균 작용을 하는 물질들이 확인됨으로써 내생균에 대한 연구의 가치는 점차 증가하고 있다.
	본 연구에서 소나무의 침엽에서 내생균으로 불리되 균주는 어떤 영역으로 나눠 DNA 염기서열을 분석하였는가?	본 연구에서는 전북 부안군에 서식하는 소나무의 침엽에서 내생균을 분리하였다. 분리된 균주는 internal transcribed spacer 영역, rDNA의 large subunit 영역, beta-tubulin 영역의 DNA 염기서열을 분석하여 동정하였다. 연구 과정에서 3종의 국내 미기록 내생균 균주를 확인하였으며, 확인된 종은 Paracamarosporiumhawaiiense, Tubakia dryina, Zasmidiumfructigenum이다.

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표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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