식품 중 철클로로필린나트륨의 HPLC 및 LC/MS 최적 분석법과 타당성 검증 The Optimization and Verification of an Analytical Method for Sodium Iron Chlorophyllin in Foods Using HPLC and LC/MS원문보기
본 연구는 현재 우리나라에서 착색료로 사용허가 되어 있지만 아직 분석법이 개발되지 않은 철클로로필린나트륨의 최적 분석법을 개발하기 위하여 진행되었다. 철클로로필린나트륨은 HPLC-PDA (390 nm), Inertsil ODS-2 column, 1% 초산을 함유한 메탄올-물(80:20, v/v)을 이동상으로 분석할 때 가장 우수한 분리능과 재현성을 나타내었다. UPLC/MS를 통하여 철클로로필린나트륨의 주유도체를 확인한 결과 철 클로린 e4(Fe-chlorin e4)와 철 이소클로린 e4(Fe-isochlorin e4)가 피크의 주요 구성성분임을 확인하였다. 최적 분석법의 타당성을 확보하기 위해 직선성, 검출한계, 정량한계, 정확도, 정밀도, 회수율 분석을 실시하였다. 검량선의 $R^2$은 0.9999, 검출한계는 0.1 mg/kg, 정량한계는 0.3 mg/kg로 나타나 직선성, 검출 한계, 정량한계가 모두 우수하였다. 정확도는 일내분석 93.9~100.8%, 일간분석 99.3~104.95%로 나타났고, 정밀도는 일내분석 2.0~5.4%, 일간분석 4.6~7.7%로 나타났다. 회수율은 수용성 식품(캔디)과 지용성 식품(샐러드드레싱)에서 각각 93.3~104.4%(RSD 0.3~4.3%)과 82.6~114.9%(RSD 1.2~2.0%)로 나타나 국제표준화 기구(ISO)의 기준에 적합하였다. 본 연구는 식품 중 함유된 철클로로필린나트륨을 분석하고 그 유도체를 확인한 결과로 향후 공인분석 방법으로 활용 가치가 클 것으로 기대된다.
본 연구는 현재 우리나라에서 착색료로 사용허가 되어 있지만 아직 분석법이 개발되지 않은 철클로로필린나트륨의 최적 분석법을 개발하기 위하여 진행되었다. 철클로로필린나트륨은 HPLC-PDA (390 nm), Inertsil ODS-2 column, 1% 초산을 함유한 메탄올-물(80:20, v/v)을 이동상으로 분석할 때 가장 우수한 분리능과 재현성을 나타내었다. UPLC/MS를 통하여 철클로로필린나트륨의 주유도체를 확인한 결과 철 클로린 e4(Fe-chlorin e4)와 철 이소클로린 e4(Fe-isochlorin e4)가 피크의 주요 구성성분임을 확인하였다. 최적 분석법의 타당성을 확보하기 위해 직선성, 검출한계, 정량한계, 정확도, 정밀도, 회수율 분석을 실시하였다. 검량선의 $R^2$은 0.9999, 검출한계는 0.1 mg/kg, 정량한계는 0.3 mg/kg로 나타나 직선성, 검출 한계, 정량한계가 모두 우수하였다. 정확도는 일내분석 93.9~100.8%, 일간분석 99.3~104.95%로 나타났고, 정밀도는 일내분석 2.0~5.4%, 일간분석 4.6~7.7%로 나타났다. 회수율은 수용성 식품(캔디)과 지용성 식품(샐러드드레싱)에서 각각 93.3~104.4%(RSD 0.3~4.3%)과 82.6~114.9%(RSD 1.2~2.0%)로 나타나 국제표준화 기구(ISO)의 기준에 적합하였다. 본 연구는 식품 중 함유된 철클로로필린나트륨을 분석하고 그 유도체를 확인한 결과로 향후 공인분석 방법으로 활용 가치가 클 것으로 기대된다.
An optimized analytical method for sodium iron chloriphyllin in foods was established and verified by using high performance liquid chromatography with attached diode array detection. An Inertsil ODS-2 column and methanol-water (80:20 containing 1% acetate) as a mobile phase were employed. The limit...
An optimized analytical method for sodium iron chloriphyllin in foods was established and verified by using high performance liquid chromatography with attached diode array detection. An Inertsil ODS-2 column and methanol-water (80:20 containing 1% acetate) as a mobile phase were employed. The limit of detection and quantitation of sodium iron chloriphyllin were 0.1 and 0.3 mg/kg, respectively, and the linearity of calibration curve was excellent ($R^2=0.9999$). The accuracy and precision were 93.9~104.95% and 2.0~7.7% in both inter-day and intra-day tests. Recoveries for candy and salad dressing were ranged between 93 and 104% (relative standard deviation, (RSD) 0.3~4.3%), and between 83 and 115% (RSD 1.2~2.0%), respectively. Liquid chromatography mass spectrometry was used to verify the main components of sodium iron chlorophyllin which were Fe-isochlorin e4 and Fe-chlorin e4.
An optimized analytical method for sodium iron chloriphyllin in foods was established and verified by using high performance liquid chromatography with attached diode array detection. An Inertsil ODS-2 column and methanol-water (80:20 containing 1% acetate) as a mobile phase were employed. The limit of detection and quantitation of sodium iron chloriphyllin were 0.1 and 0.3 mg/kg, respectively, and the linearity of calibration curve was excellent ($R^2=0.9999$). The accuracy and precision were 93.9~104.95% and 2.0~7.7% in both inter-day and intra-day tests. Recoveries for candy and salad dressing were ranged between 93 and 104% (relative standard deviation, (RSD) 0.3~4.3%), and between 83 and 115% (RSD 1.2~2.0%), respectively. Liquid chromatography mass spectrometry was used to verify the main components of sodium iron chlorophyllin which were Fe-isochlorin e4 and Fe-chlorin e4.
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문제 정의
이에 본 연구에서는 철클로로필린나트륨 분석법에 대한 선행 연구를 토대로 기기분석 조건과 전처리법 등을 검토하여 최적의 HPLC 기기분석 조건 및 전처리 방법을 확립할 뿐만 아니라, 직선성, 검출한계, 정량한계, 정확성, 정밀성, 회수율 등을 수행하여 확립된 분석법의 타당성을 평가하고자 하였다. 또한, 철클로로필린나트륨을 구성하는 주요유도체를 분석하기 위해 LC/MS 분석법을 확립하고자 하였다. 본 연구의 결과는 향후 철클로로필린나트륨의 공인분석 방법으로 활용되거나 식품첨가물의 효율적인 안전관리에 기초자료로 이용될 수 있을 것이다.
이에 본 연구에서는 철클로로필린나트륨 분석법에 대한 선행 연구를 토대로 기기분석 조건과 전처리법 등을 검토하여 최적의 HPLC 기기분석 조건 및 전처리 방법을 확립할 뿐만 아니라, 직선성, 검출한계, 정량한계, 정확성, 정밀성, 회수율 등을 수행하여 확립된 분석법의 타당성을 평가하고자 하였다. 또한, 철클로로필린나트륨을 구성하는 주요유도체를 분석하기 위해 LC/MS 분석법을 확립하고자 하였다.
제안 방법
30, 60, 120, 180 μg/mL 4가지 농도의 시험용액을 하루에 5반복 측정하고(일내분석), 한편으로는 10, 25, 50, 100, 300, 500 μg/mL 6가지 농도의 시험용액을 하루에 1회씩 3일 동안 측정하여(일간분석), 이 결과들의 평균과 표준편차를 산출하였다.
시판 철클로로필린나트륨(Wako, Japan)에 순도 실험 결과를 적용하여 10, 25, 50, 100, 300, 500 μg/mL 농도로 제조한 후 표준용액으로 사용하였다. Table 1의 조건으로 HPLC 분석을 수행한 후 각 농도별 피크면적을 이용하여 수량 재기 선을 작성하고 직선의 기울기(R2)를 구하여 직선성을 검토하였다. 또한 5, 10, 25 μg/mL로 제조된 표준용액으로부터 구한 검량선의 기울기와 중간농도(10 μg/mL)를 7회 분석하여 얻은 표준편차를 이용하여 식(2)의 방법으로 검출한계(LOD)와 정량한계 (LOQ)를 산출하였다16).
또한 5, 10, 25 μg/mL로 제조된 표준용액으로부터 구한 검량선의 기울기와 중간농도(10 μg/mL)를 7회 분석하여 얻은 표준편차를 이용하여 식(2)의 방법으로 검출한계(LOD)와 정량한계 (LOQ)를 산출하였다16).
또한 지용성 식품 중 함유되어 있는 철클로로필린나트륨을 추출하기 위해 철클로로필린나트륨이 첨가되지 않은 샐러드드레싱에 상기의 농도와 같이 철클로로필린나트륨을 첨가한 후 코티티의 전처리법을 변형한 전처리법 4와전처리법 5 그리고 Chong 등14)의 방법인 전처리법 6을 비교하였다. Table 3의 결과를 보면, 에테르:석유 에테르(1:1,v/v)로 유지 제거 후 색소를 추출하는 전처리법 4는 모든 농도에서 정량한계 이하로 나타났는데 이는 에테르가 유지뿐만 아니라 철클로로필린나트륨도 함께 용출하여 유지제거 과정에서 색소를 모두 손실하기 때문에 나타난 결과이었다.
이동상으로는 메탄올, 물, 초산 등을 이용하여 각 이동상 조성을 달리한 예비실험 결과를 토대로 메탄올과 물(80:20, v/v, 1% 초산)로 결정하였다. 또한 철클로로필린나트륨의 최대 흡수파장을 확인하기 위하여 HPLC-PDA를 이용하여 전 파장 스캔을 수행한 후390-396 nm가 최대 흡수부 임을 확인하였다. 철클로로필린나트륨 분석 조건은 Table 1과 같다.
7%이었다. 본 연구에서 수행한 모든 분석에서(검량선 및 회수율 측정 등)철클로로필린나트륨 농도는 이 순도를 적용한 값으로 표준화(calibration)하여 사용하였다.
수용성 식품 중 함유되어 있는 철클로로필린나트륨을 추출하기 위해서 색소를 함유하지 않은 백색의 캔디에 농도가 10, 50, 100 mg/kg이 되도록 철클로로필린나트륨을 첨가한 후 3가지 전처리법을 비교하였다. Table 3에서 보듯이 전처리법 1(변형된 Scotter 등의 방법)은 모든 농도에서 정량한계 이하로 나타났고, 전처리법 2(변형된 Yasuda 등12)의방법)는 10 mg/kg에서는 정량한계 이하이지만 50, 100 mg/kg에서는 29.
시판 철클로로필린나트륨(Wako, Japan)에 순도 실험 결과를 적용하여 10, 25, 50, 100, 300, 500 μg/mL 농도로 제조한 후 표준용액으로 사용하였다.
식품 중에 함유된 철클로로필린나트륨을 정량하기 위해서 HPLC Agilent Technologies 1260 infinity (Agilent, SantaClara, CA, USA), Agilent 1260 photodiode-array (PDA)(Agilent, Santa Clara, CA, USA), Inertsil ODS-2column(5 μm, 4.6 × 250 mm, GL Sciences, Shinjuku, Japan)을사용하였다.
.식품 중에 함유된 철클로로필린나트륨의 최적 전처리법을확립하기 위하여 동클로로필린류 추출법을 일부 수정한 방법을 이용하여 각 전처리법을 비교해 보았다14).
6 mm × 250, GL Science, Shinjuku,Japan)으로 선정하였다. 이동상으로는 메탄올, 물, 초산 등을 이용하여 각 이동상 조성을 달리한 예비실험 결과를 토대로 메탄올과 물(80:20, v/v, 1% 초산)로 결정하였다. 또한 철클로로필린나트륨의 최대 흡수파장을 확인하기 위하여 HPLC-PDA를 이용하여 전 파장 스캔을 수행한 후390-396 nm가 최대 흡수부 임을 확인하였다.
철클로로필린나트륨은 일반시약(commercial grade)으로만 판매되고 있기 때문에, 철클로로필린나트륨(commercialgrade) 시약을 구매한 후(Wako, Osaka, Japan), 식품첨가물공전 방법에 따라 순도를 측정하였다. 철클로로필린나트륨 1g을 정밀히 달아 1 M 인산버퍼(pH 7.5)를 이용하여100,000배 희석하고, 분광광도계(vision, Seoul, Korea)를 이용하여 398 nm에서 흡광도를 측정하였다. 식(1)의 방법으로 철클로로필린나트륨의 순도를 산출 한 후 이를 적용하여 10, 25, 50, 100, 300, 500 μg/mL 농도로 제조한 시액을 표준시액으로 사용하였다3,9,10).
철클로로필린나트륨 분석에 관한 선행연구2,3,8)를 검토하여 예비실험을 한 후, 본 연구에 사용할 분석 기기와 컬럼을 HPLC-PDA (Agilent, Santa Clara, CA, USA)와Inertsil ODS-2 컬럼(4.6 mm × 250, GL Science, Shinjuku,Japan)으로 선정하였다.
철클로로필린나트륨을 구성하는 유도체와 구조 확인을 위해 UPLC-MS (Waters, USA)와 UPLC BEH C18 column(2.1 i.d. × 100 mm, Waters, USA)을 이용하여 Table 2의 조건으로 분석하였다.
철클로로필린나트륨을 함유하는 식품에 본 연구에서 개발한 분석법의 적용 가능 여부를 확인하기 위하여 철클로로필린나트륨 사용대상 식품 75건을 국내외에서 구매하고,HPLC 및 LC-MS를 사용하여 분석하였다.
최적 분석법의 정확도(accuracy), 정밀도(precision) 측정을 위해 다양한 농도로 조제한 시험용액으로 일내 분석과 일간 분석을 수행하였다. 30, 60, 120, 180 μg/mL 4가지 농도의 시험용액을 하루에 5반복 측정하고(일내분석), 한편으로는 10, 25, 50, 100, 300, 500 μg/mL 6가지 농도의 시험용액을 하루에 1회씩 3일 동안 측정하여(일간분석), 이 결과들의 평균과 표준편차를 산출하였다.
샐러드드레싱 등 지용성 식품에 함유된 철클로로필린나트륨을 추출하기 위해서는 먼저 유기 용매를 이용하여 유지를 제거한 후 철클로로필린나트륨을 추출하였다. 코티티시험연구원에서 보고된 방법13)을 참고하여 변형 전처리법 4,변형 전처리법 5와 Chong 등14)의 방법인 전처리법 6을 비교하였다(Fig. 2). 기기분석용 최종 추출액이 연하게 착색된경우에는 질소농축을 한 후 HPLC용 시험용액으로 사용하였다.
회수율(recovery)은 수용성 식품과 지용성 식품 매트릭스(캔디, 샐러드드레싱)에철클로로필린나트륨 표준용액을 3가지 농도(10, 50, 100 μg/mL)로 각각 첨가한 후 분석한 측정값과 이론값을 비교하여 산출하였다.
대상 데이터
(Seoul, Korea), 헥산(hexane), 에틸 에테르(Ethylether), 석유 에테르(petroleum ether)는 Daejung Chemical Inc.(Goryeong, Korea)로부터 구매하여 사용하였다. 또한, 전처리 과정에서 Oasis HLB 6 cc(200 mg) cartridge (Waters,Santry.
순도 시험용 인산버퍼(Phosphatebuffer)는 Sigma Aldrich Co.(St. Louis, Mo, USA)에서 구매하였고, HPLC 용매 제조용 물(water), 메탄올(methanol), 아세톤(aceton), 아세토나이트릴(acetonitrile)은 SamchunChemical Co. (Seoul, Korea)에서 구매하였으며, 초산(aceticacid)은 Avantor (Center Valley. PA, USA) 제품을 사용하였다. 철클로로필린나트륨의 전처리에 사용된 에틸아세테이트(ethyl acetate)와 0.
철클로로필린나트륨은 Wako(Osaka, Japan)에서 구입하였으며, 표준품으로 사용하기 위해 식품첨가물 공전의 순도 시험법에 따라 순도를 확인한 후, 국제 식품첨가물 전문가 위원회(JECFA)에서 권고한 방법으로 농도 표준화를 하여 실험에 사용하였다9,10). 순도 시험용 인산버퍼(Phosphatebuffer)는 Sigma Aldrich Co.
데이터처리
본 연구에서 수행한 철클로로필린나트륨의 모든 분석 결과는 엑셀(Excel 2010, Microsoft, USA)을 이용하여 산술평균, 표준오차, 표준편차, 상대 표준편차(RSD %) 등을 산출하였다.
이론/모형
수용성 식품에 함유된 철클로로필린나트륨 추출을 위해서는 변형된 Scotter 등11)의 방법(전처리법 1), 변형된 Yasuda등12)의 방법(전처리법 2), Chong 등14)의 방법(전처리법3)을비교하였다. 각 전처리법의 과정은 Fig.
철클로로필린나트륨은 일반시약(commercial grade)으로만 판매되고 있기 때문에, 철클로로필린나트륨(commercialgrade) 시약을 구매한 후(Wako, Osaka, Japan), 식품첨가물공전 방법에 따라 순도를 측정하였다. 철클로로필린나트륨 1g을 정밀히 달아 1 M 인산버퍼(pH 7.
성능/효과
18(최대 흡수 파장 393 nm)이었다. 3.26분에 검출되는 피크는 철클로린 e4(Fe-chlorin e4)로서 분자량은 604.17이고(최대 흡수 파장 396 nm), 3.46분에 검출되는 피크는 철이소클로린 e4(Fe-isochlorin e4)로서 분자량 606.19(최대 흡수 파장 392 nm)의 철클로로필린나트륨 유도체로 확인되었다. 그러나 철클로린 e6는 그 함량이 미량인 것으로 나타나, 철클로로필린나트륨의 주요 유도체는 철클로린 e4와 철이소클로린 e4의 두 종류이며,392~396 nm에서 최대 흡수부를 갖는다는 것을 알 수 있었다.
최적 분석법의 타당성을 검증하기 위하여 검량선의 직선성, 검출한계, 정량한계, 정확도, 정밀도, 회수율을 검토하였다. 검량선의 R2는 0.9999, 검출한계는 0.1 mg/kg, 정량한계는 0.3 mg/kg, 분리능은 6.5, 선택성은 2.1로 매우 우수한 결과를 나타내었다(Table 4). 정확도와 정밀도는 일내 분석에서 각각 93.
국내·외 철클로로필린나트륨 사용대상 식품(과실 및 채소 저장품, 껌류, 캔디류, 완두콩 통조림, 음료류, 조미식품 등) 총 75종을 구매하여 철 클로로필린나트륨을 분석한 결과 국내 식품 72종에서는 철클로로필린나트륨이 검출되지 않아 우리나라에서는 철클로로필린나트륨이 거의 사용되지 않는 것으로 나타났다.
19(최대 흡수 파장 392 nm)의 철클로로필린나트륨 유도체로 확인되었다. 그러나 철클로린 e6는 그 함량이 미량인 것으로 나타나, 철클로로필린나트륨의 주요 유도체는 철클로린 e4와 철이소클로린 e4의 두 종류이며,392~396 nm에서 최대 흡수부를 갖는다는 것을 알 수 있었다.
이는 염산을 첨가할 때 금속로로필린나트륨의카르복실 그룹에 전자이탈을 방지하여 적절한 시간을 확보할 수 있었다는 선행연구17)와 유사한 결과이다. 또한 철클로로필린나트륨을 200~700 nm의 범위에서 측정해본 결과 390~396 nm에서 최대 흡수부를 나타내었다.
Table 3의 결과를 보면, 에테르:석유 에테르(1:1,v/v)로 유지 제거 후 색소를 추출하는 전처리법 4는 모든 농도에서 정량한계 이하로 나타났는데 이는 에테르가 유지뿐만 아니라 철클로로필린나트륨도 함께 용출하여 유지제거 과정에서 색소를 모두 손실하기 때문에 나타난 결과이었다. 반면, 헥산으로 유지를 제거하는 전처리법 5와 전처리법 6은 회수율이 각각 63.9~74.3%(RSD 1.2~2.0%)와82.6~114.9%(RSD 4.4~9.8%)로 나타났다. 전처리법 6에서는 전처리법 5에서 사용한 HLB 카트리지 대신 층 분리법을 이용하여 헥산층을 제거하고 착색된 물층의 철클로로필린나트륨을 추출함으로써 회수율을 향상시킬 수 있었다.
을 참고하여 다양한 칼럼, 이동상 조성, 최대 흡수 파장 등을 검토해본 결과 HPLC-PDA (Agilent, Santa Clara, CA, USA)를 이용하여 Table 1의 조건으로 분석할 때, 가장 우수한 분리능과머무름 시간을 나타내었다. 이동상으로 사용된 메탄올:물(80:20, v/v)에 초산의 함유량을 달리하여 비교해본 결과 초산을 1% 이상 첨가할 경우 피크가 너무 빨리 나오면서 다른 피크들과 겹치는 현상이 발생하였으며 1% 미만 넣을 경우에는 피크에 테일링이 나타나 선택성이 감소되었다. 초산을 1% 정도 함유할 때 분리능과 선택성은 각각6.
4와 같이 나타났다. 이상의 결과로 본 연구에서 확립한 철클로로필린나트륨의 HPLC 방법과 LC/MS 방법이 실제로 시판 식품 중에 함유된 철클로로필린나트륨 분석에 적용 가능하다는 것을 확인할 수 있었다.
이상의 결과에서 수용성 식품에 함유된 철클로로필린나트륨을 추출하기 위해서는 시료를 0.1 N 염산과 메탄올 각 5 mL씩을첨가하여 초음파 추출한 후 0.2 μm PVDF membrane filter로 여과하는 전처리법 3이 가장 좋은 방법임을 알 수 있었다.
1로 매우 우수한 결과를 나타내었다(Table 4). 정확도와 정밀도는 일내 분석에서 각각 93.9~100.8%, 2.0~5.4%와 일간 분석에서 99.3~104.95%, 4.6~7.7%로 나타났다(Table 4). 국제표준화 기구19)에서는 일내분석과 일간분석의 정밀도를 각각 20% 이하, 30%이하로 권고하고 있으므로 본 연구 결과는 그 타당성이 검증되었다.
철클로로필린나트륨의 기존분석법들2,3,8)을 참고하여 다양한 칼럼, 이동상 조성, 최대 흡수 파장 등을 검토해본 결과 HPLC-PDA (Agilent, Santa Clara, CA, USA)를 이용하여 Table 1의 조건으로 분석할 때, 가장 우수한 분리능과머무름 시간을 나타내었다. 이동상으로 사용된 메탄올:물(80:20, v/v)에 초산의 함유량을 달리하여 비교해본 결과 초산을 1% 이상 첨가할 경우 피크가 너무 빨리 나오면서 다른 피크들과 겹치는 현상이 발생하였으며 1% 미만 넣을 경우에는 피크에 테일링이 나타나 선택성이 감소되었다.
이동상으로 사용된 메탄올:물(80:20, v/v)에 초산의 함유량을 달리하여 비교해본 결과 초산을 1% 이상 첨가할 경우 피크가 너무 빨리 나오면서 다른 피크들과 겹치는 현상이 발생하였으며 1% 미만 넣을 경우에는 피크에 테일링이 나타나 선택성이 감소되었다. 초산을 1% 정도 함유할 때 분리능과 선택성은 각각6.5와 2.1을 나타내었으며, 적절한 머무름 시간을 확보할수 있었다. 이는 염산을 첨가할 때 금속로로필린나트륨의카르복실 그룹에 전자이탈을 방지하여 적절한 시간을 확보할 수 있었다는 선행연구17)와 유사한 결과이다.
후속연구
또한, 철클로로필린나트륨을 구성하는 주요유도체를 분석하기 위해 LC/MS 분석법을 확립하고자 하였다. 본 연구의 결과는 향후 철클로로필린나트륨의 공인분석 방법으로 활용되거나 식품첨가물의 효율적인 안전관리에 기초자료로 이용될 수 있을 것이다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
식품 중 착색료의 특징은 무엇인가?
착색료는 식품의 제조·가공 중에 발생하는 품질 저하를 방지하고 식품에 색을 부여하여 외관을 향상시킬 목적으로 사용되고 있으며, 주로 음료류, 빙과류, 과자류, 젤리류, 통조림, 유제품, 식육제품 등에 사용되고 있다1).
식품 중 클로로필린나트륨 분석을 할 수 있는 방법은 무엇인가?
4와 같이 나타났다. 이상의 결과로 본 연구에서 확립한 철클로로필린나트륨의 HPLC 방법과 LC/MS 방법이 실제로 시판 식품 중에 함유된 철클로로필린나트륨 분석에 적용 가능하다는 것을 확인할 수 있었다.
철클로로필린나트륨 분석에 적합한 HPLC 조건은 무엇인가?
6 mm × 250, GL Science, Shinjuku,Japan)으로 선정하였다. 이동상으로는 메탄올, 물, 초산 등을 이용하여 각 이동상 조성을 달리한 예비실험 결과를 토대로 메탄올과 물(80:20, v/v, 1% 초산)로 결정하였다. 또한 철클로로필린나트륨의 최대 흡수파장을 확인하기 위하여 HPLC-PDA를 이용하여 전 파장 스캔을 수행한 후390-396 nm가 최대 흡수부 임을 확인하였다. 철클로로필린나트륨 분석 조건은 Table 1과 같다.
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