[논문]연잎, 연자육, 연자방 에탄올 추출물의 항염증 활성

이은주; 서유미; 김용현; 정정욱; 성화정; 손호용; 박종이; 김종식

doi:10.5352/jls.2019.29.4.436

연잎, 연자육, 연자방 에탄올 추출물의 항염증 활성
Anti-inflammatory Activities of Ethanol Extracts from Leaf, Seed, and Seedpod of Nelumbo nucifera 원문보기

생명과학회지 = Journal of life science, v.29 no.4 = no.228, 2019년, pp.436 - 441

이은주 (국립안동대학교 생명과학과) , 서유미 (국립안동대학교 생명과학과) , 김용현 (국립안동대학교 생명과학과) , 정정욱 (국립안동대학교 생명과학과) , 성화정 (국립안동대학교 식품영양학과) , 손호용 (국립안동대학교 식품영양학과) , 박종이 (경북바이오산업 연구원) , 김종식 (국립안동대학교 생명과학과)

초록
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연은 아시아 국가에서 음식과 약재로 널리 사용되는 재료이다. 본 연구에서는 연의 잎(leaf, NL), 자육(seed, NS), 자방(seedpod, NSP)으로부터 에탄올 추출물을 제조하고 이들의 항염증 활성과 작용기전을 규명하였다. 이들의 항염증 활성을 연구하기 위하여 LPS로 자극된 RAW 264.7 세포에서 nitric oxide (NO) 생산을 측정하였다. NL, NS, NSP는 세포 생존율에 영향을 주지 않으면서, 농도의존적으로 NO의 생산을 현저하게 저해하였으며, iNOS 및 COX-2와 같은 pro-inflammatory 중재자들의 단백질 발현을 감소시켰다. 또한, NL, NS, NSP는 MAPKs 단백질의 인신화를 감소시키고 $NF-{\kappa}B$ p65의 핵으로의 이동을 저해함으로써, 세 추출물에 의한 항염증 활성은 MAPKs 경로와 $NF-{\kappa}B$ 경로를 조절함으로써 이루어짐을 제시한다. 게다가, ROS의 생성이 세 추출물에 의해서 모두 저해되었으며, HO-1의 발현과 HO-1의 전사조절인자인 Nrf2의 핵으로의 이동이 증가되었다. 결론적으로, 이러한 연구 결과는 연의 다양한 부위의 추출물인 NL, NS 그리고 NSP는 항염증 활성을 가지고 있으며, MAPKs, $NF-{\kappa}B$, Nrf2/HO-1 등 다양한 신호경로를 통해 조절할 수 있음을 제시한다.

Abstract ▼ AI-Helper

Nelumbo nucifera, also known as sacred lotus, has mainly been used as a food throughout the Asian countries. In the present study, we prepared ethanol extracts from leaf (NL), seed (NS), and seedpod (NSP) of Nelumbo nucifera and investigated their anti-inflammatory activities in mouse macrophage RAW 264.7 cells. To evaluate the anti-inflammatory activities of NL, NS, and NSP, nitric oxide (NO) production was measured in LPS-stimulated RAW 264.7 cells. NL, NS, and NSP significantly reduced NO production in a dose-dependent manner without affecting cell viabilities. NL, NS, and NSP dramatically decreased the protein expression of pro-inflammatory genes such as iNOS and COX-2. NL, NS, and NSP also suppressed phosphorylation of MAPKs and the nuclear translocation of $NF-{\kappa}B$ p65 indicating they have their anti-inflammatory activities via regulating mitogen-activated protein kinases (MAPKs) and nuclear factor kappa B ($NF-{\kappa}B$) pathways. In addition, we analyzed the production of reactive oxygen species (ROS) by the treatment of NL, NS, and NSP. All extracts reduced ROS production in a dose-dependent manner. And also, they increased heme oxygenase-1 (HO-1) protein expression and the nuclear translocation of nuclear respiratory factor 2 (Nrf2). In conclusion, our results suggest that Nelumbo nucifera has its anti-inflammatory activity via regulating MAPKs, $NF-{\kappa}B$, and Nrf2/HO-1 pathways.

주제어

표/그림 (5)

그림 Fig. 1. Effects of leaf (NL), seed (NS) and seedpod (NSP) extracts of Nelumbo nucifera on nitric oxide (NO) production and cell viability in LPS-stimulated RAW264.7 macrophage.
그림 Fig. 2. Down-regulation of iNOS and COX-2 proteins by the treatment of NL, NS and NSP.
그림 Fig. 3. Inhibition of phosphorylation of MAPKs and nuclear translocation of NF-κB p65 by the treatment of NL, NS and NSP.
그림 Fig. 4. ROS scavenging effects of NL, NS, and NSP extracts.
그림 Fig. 5. Up-regulation of HO-1 via increased nuclear translocation of Nrf2 by NL, NS, and NSP treatment.

AI 본문요약
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문제 정의

따라서, 본 연구는 LPS로 염증 유도된 RAW 264.7 마우스 대식세포를 이용하여 연잎, 연자육, 연자방 에탄올 추출물의 항염증 활성 및 그 작용기전에 대해 다양한 신호경로를 중심으로 연구하였다.
5B). 이러한 연구결과는 NL, NS, NSP는 Nrf2/HO-1 경로에 의해 항산화 및 항염증 활성을 조절함을 제시해 주는 것이다. 이러한 결과와 유사하게 다양한 천연물 유래 생리활성물질에 의한 항염증 활성이 Nrf2/HO-1 경로에 의해 조절될 수 있음이 보고되었다[5, 10]

제안 방법

CellTiter 96® AQueous One Solution Cell Proliferation Assay kit (Promega, Madison, WI, USA)를 이용하여, 각 추출물의 세포독성을 측정하였다.
LPS에 의해 염증 유도된 마우스 대식세포 RAW 264.7 세포 주에서 연잎(NL), 연자육(NS), 연자방(NSP) 에탄올 추출물에 의한 NO 생성 수준을 측정 하였다. 96-well plate의 각 well에 RAW 264.
연잎(NL), 연자육(NS), 연자방(NSP) 추출물에 의해 MAPKs 신호경로에 염증반응이 조절되는지 확인하기 위하여 추출물 처리 후 MAPKs 발현과 인산화 분석을 수행하였다. NL, NS, NSP를 0.5 mg/ml의 농도로 RAW 264.7 세포에 4시간 동안 처리한 후 LPS로 15분 동안 자극하여 p38, ERK1/2와 JNK 총 단백질과 각 MAPK의 인산화의 변화를 분석하였다. Western blot 분석 결과 0.
4B). NL, NS, NSP에 의한 ROS 생성억제 현상이 항산화 활성의 주요한 경로 단백질인 hemeoxygenase-1 (HO-1)과 이의 전사조절인자인 Nrf2 단백 질에 의한 것인지 확인하였다. 그 결과, NL, NS, NSP 처리에 의해 HO-1의 발현이 현저하게 증가됨을 확인하였다(Fig.
이후 세포 배양액을 모두 제거한 후 25 μM 농도가 되도록 DCF-DA (Sigma, USA)를 phenol-free DMEM (Gibco, USA)에 희석하여 세포주에 처리하고 45분간 반응시켰다. 그 다음 새포주로부터 배양액을 모두 제거하고 새 phenol-free DMEM 를 분주하고 10분간 후, Tecan Infinite F200 pro plate reader (Austria)를 사용하여 excitation: 510 nm, emission: 595 nm에서 흡광도를 측정하였다. ROS의 측정은 독립적인 3개의 well 에서 수행되었으며, 통계 분석은 Sigma plot을 이용하여 mean ± SD 값으로 나타내었다.
다양한 연 부위 중 연잎(NL), 연자육(NS), 및 연자방(NSP) 시료에 대해 에탄올 추출물을 각각 제조하였다. 먼저 에탄올 추출물을 제조하기 위하여 연 부위별 시료에 각각 10배의 95% ethanol을 첨가한 후 실온에서 24시간씩 3회 반복 추출하였다.
또한, 염증 유전자 발현 조절에 중요한 전사조절인자인 NF-κB p65의 세포질에서 발현과 활성화된 NF-κB p-p65의 핵 속으로의 이동을 분석하였다.
다양한 연 부위 중 연잎(NL), 연자육(NS), 및 연자방(NSP) 시료에 대해 에탄올 추출물을 각각 제조하였다. 먼저 에탄올 추출물을 제조하기 위하여 연 부위별 시료에 각각 10배의 95% ethanol을 첨가한 후 실온에서 24시간씩 3회 반복 추출하였다. 추출액은 filter paper (Whatman No.
7 세포 주에 20 μl의 MTS 용액을 처리하여 37℃, 5% CO₂배양기에 4시간 동안 반응시키고, Tecan Infinite M200 plate reader (Tecan Austria GmbH, Austria)를 사용하여 480 nm에서 흡광도를 측정하였다. 세포생존율 분석은 독립적인 4개의 well에서 수행되었다.
연잎(NL), 연자육(NS), 연자방(NSP) 에탄올 추출물에 의한 pro-inflammatory 유전자인 iNOS와 COX-2의 단백질의 발현 분석을 수행하였다. 즉, LPS로 활성화된 RAW 264.
연잎(NL), 연자육(NS), 연자방(NSP) 에탄올 추출물이 LPS로 활성화된 RAW 264.7 세포에서 nitric oxide (NO) 생산과 세포성장에 미치는 영향을 연구하였다. LPS로 활성화된 RAW 264.
연잎(NL), 연자육(NS), 연자방(NSP) 에탄올 추출물이 ROS 생성에 미치는 영향을 확인하기 위하여 DCF-DA assay를 수행하였다. 96-well plate의 각 well에 RAW 264.
연잎(NL), 연자육(NS), 연자방(NSP) 추출물에 의해 MAPKs 신호경로에 염증반응이 조절되는지 확인하기 위하여 추출물 처리 후 MAPKs 발현과 인산화 분석을 수행하였다. NL, NS, NSP를 0.
연잎(NL), 연자육(NS), 연자방(NSP) 추출물이 ROS 생성에 미치는 영향을 확인하기 위하여 LPS로 자극된 RAW 264.7 세포에 각 추출물을 0.25, 0.5, 그리고 1 mg/ml의 농도로 처리한 후 ROS 생성을 측정하였다. 그 결과, Fig.
세포주 배양은 10% Fetal Bovine Serum (FBS, Gibco, Grand Island, NY, USA), 1% penicillin 및 streptomycin (Wel Gene, Korea)이 첨가된 Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM, Gibco)를 사용하였으며, 세포배양은 37℃, 5% CO₂ 조건의 배양기에서 실시하였다. 염증 반응은 Gram 음성 세균의 외막 구조물인 lipopolysaccharide (LPS, Sigma, St. Louis, MO, USA)를 이용해 유도하였다.
연잎(NL), 연자육(NS), 연자방(NSP) 에탄올 추출물에 의한 pro-inflammatory 유전자인 iNOS와 COX-2의 단백질의 발현 분석을 수행하였다. 즉, LPS로 활성화된 RAW 264.7 세포주에 각각 0.5 mg/ml의 NL, NS, NSP를 처리한 후 염증 유전자인 iNOS와 COX-2 단백질의 발현을 분석하였다(Fig. 2). 그 결과, iNOS 단백질의 발현은 NL, NS, NSP에 의해 모두 발현이 현저하게 감소하였다.
Sonication 된 cell lysate는 15분 간 3,000 rpm에서 원심분리하고 상층액을 취하여 사용하였다. 핵 추출은 Nuclear Extract kit(Active Motif, Carlsbad, CA, USA)를 이용하여 제조사의 매뉴얼에 따라 수행하였다. 단백질은 Bradford assay(Bio-Rad, Hercules, CA, USA) 방법을 이용하여 정량하고, -20℃에 보관하며 사용하였다.

대상 데이터

p-Erk1/2, JNK, p-JNK, NF-κB p65, NF-κB p-p65, HO-1, Nrf2에 대한 항체는 모두 Cell signaling사(USA)에서 구입하였으며, Actin 항체 및 Lamin A/C 항체와 2차 항체는 모두 Santa Cruz 사(Santa Cruz, CA, USA)로부터 구입하였다.
마우스 대식세포 RAW 264.7 세포주는 American Type Culture Collection (ATCC, Fredrick, MD, USA)에서 구입하였다. 세포주 배양은 10% Fetal Bovine Serum (FBS, Gibco, Grand Island, NY, USA), 1% penicillin 및 streptomycin (Wel Gene, Korea)이 첨가된 Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM, Gibco)를 사용하였으며, 세포배양은 37℃, 5% CO₂ 조건의 배양기에서 실시하였다.
단백질은 Bradford assay(Bio-Rad, Hercules, CA, USA) 방법을 이용하여 정량하고, -20℃에 보관하며 사용하였다. 본 실험에서 사용된 항체 중 iNOS, COX-2, p38, p-p38, Erk1/2. p-Erk1/2, JNK, p-JNK, NF-κB p65, NF-κB p-p65, HO-1, Nrf2에 대한 항체는 모두 Cell signaling사(USA)에서 구입하였으며, Actin 항체 및 Lamin A/C 항체와 2차 항체는 모두 Santa Cruz 사(Santa Cruz, CA, USA)로부터 구입하였다.
세포주 배양은 10% Fetal Bovine Serum (FBS, Gibco, Grand Island, NY, USA), 1% penicillin 및 streptomycin (Wel Gene, Korea)이 첨가된 Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM, Gibco)를 사용하였으며, 세포배양은 37℃, 5% CO₂ 조건의 배양기에서 실시하였다.
1A). 한편, 양성대조구로는 RAW 264.7 세포에서 NO 생산을 저해하는 것으로 알려진 레스베라트롤(resveratrol, RES)을 사용하였다[21]. 한편, 같은 조건에서 세포생존율 변화를 측정한 결과 처리한 NL, NS, NSP, RES 모두 세포 생존율에는 큰 영향을 주지 않은 것으로 확인되었다(Fig.

데이터처리

NO 생성 분석은 독립적인 4개의 well에서 수행되었으며, 통계 분석은 Sigma plot을 이용하여 mean ± SD 값으로 나타내었다.
ROS의 측정은 독립적인 3개의 well 에서 수행되었으며, 통계 분석은 Sigma plot을 이용하여 mean ± SD 값으로 나타내었다.
모든 실험은 최소 3회 이상 실시하였으며, 실험결과는 평균 ± 표준편차로 나타내었고, 각 실험결과의 유의성 검토는 대조 구와 비교하여 Student’s t-test에 의해 판정하였으며 p 값이 0.05 미만일 때 유의성이 있다고 판단하였다.

이론/모형

핵 추출은 Nuclear Extract kit(Active Motif, Carlsbad, CA, USA)를 이용하여 제조사의 매뉴얼에 따라 수행하였다. 단백질은 Bradford assay(Bio-Rad, Hercules, CA, USA) 방법을 이용하여 정량하고, -20℃에 보관하며 사용하였다. 본 실험에서 사용된 항체 중 iNOS, COX-2, p38, p-p38, Erk1/2.

성능/효과

7 세포에서 nitric oxide (NO) 생산과 세포성장에 미치는 영향을 연구하였다. LPS로 활성화된 RAW 264.7 세포주에 0.25, 0.5, 1.0 mg/ml의 각 시료를 각각 처리한 결과, 처리한 NL, NS, NSP 농도의존적으로 NO의 생산이 감소하는 것을 확인하였다(Fig. 1A). 한편, 양성대조구로는 RAW 264.
그 결과, Fig. 3B에서 보는 바와 같이, 세포질에서의 NF-κB p65의 발현은 LPS만 처리한 대조구에 비해 NL, NS, NSP 처리 군에서 NF-kB p65의 발현이 감소하였으며, 대조구에 비해 NF-κB p-p65의 핵 속으로의 이동이 NL, NS, NSP 처리군에서 현저하게 감소함을 확인하였다.
5, 그리고 1 mg/ml의 농도로 처리한 후 ROS 생성을 측정하였다. 그 결과, Fig. 4A에서 보는 바와 같이 대조구에 비해 처리한 추출물의 농도의존적으로 ROS 생성이 감소됨을 확인하였다. 이러한 조건에서 세포생존율에 미치는 영향은 매우 미미 했다(Fig.
NL, NS, NSP에 의한 ROS 생성억제 현상이 항산화 활성의 주요한 경로 단백질인 hemeoxygenase-1 (HO-1)과 이의 전사조절인자인 Nrf2 단백 질에 의한 것인지 확인하였다. 그 결과, NL, NS, NSP 처리에 의해 HO-1의 발현이 현저하게 증가됨을 확인하였다(Fig. 5A). 또한, HO-1 유전자의 전사조절인사인 Nrf2의 핵 속으로의 이동도 NL, NS, NSP 처리군에서 현저하게 증가됨을 확인하였다(Fig.
2). 그 결과, iNOS 단백질의 발현은 NL, NS, NSP에 의해 모두 발현이 현저하게 감소하였다. 대조구로 사용한 RES에 의해서도 iNOS 단백질 발현이 현저하게 감소하였다.
대조구로 사용한 RES에 의해서도 iNOS 단백질 발현이 현저하게 감소하였다. 그러나, COX-2 단백질의 경우 NL과 NSP의 처리에 의해서 현저하게 발현이 감소되었으나, NS와 RES에 의해서는 약하게 감소됨을 확인하였다(Fig. 2). Kaewkroek등은 강황 추출물과 함유 성분들이 항염증 활성을 가지며, iNOS와 COX-2의 발현을 억제하는 것으로 보고한바 있다[13].
1B). 따라서, NL, NS, NSP는 LPS로 자극된 RAW 264.7 세포에서 세포 생존율에는 영향을 미치지 않으면서 NO의 생산을 농도의존적으로 저해함을 확인하였다.
5A). 또한, HO-1 유전자의 전사조절인사인 Nrf2의 핵 속으로의 이동도 NL, NS, NSP 처리군에서 현저하게 증가됨을 확인하였다(Fig. 5B). 이러한 연구결과는 NL, NS, NSP는 Nrf2/HO-1 경로에 의해 항산화 및 항염증 활성을 조절함을 제시해 주는 것이다.
3A). 이러한 연구 결과는 NL, NS, NSP가 MAPK 신호전달경로를 억제함으로써 LPS로 유도된 RAW264.7 세포에서 염증반응을 억제한다는 사실을 시사한다. 또한, 염증 유전자 발현 조절에 중요한 전사조절인자인 NF-κB p65의 세포질에서 발현과 활성화된 NF-κB p-p65의 핵 속으로의 이동을 분석하였다.
종합적으로, 이러한 연구결과들은 연(Nelumbo nucifera)의 다양한 부위 중 연잎(leaf), 연자육(seed), 연자방(seedpod)의 에탄올 추출물은 항염증 활성을 가지고 있으며, 이러한 활성은 MAPKs, NF-κB, 그리고 Nrf2/HO-1 등 다양한 경로에 의해 조절됨을 제시한다.
7 세포에서 NO 생산을 저해하는 것으로 알려진 레스베라트롤(resveratrol, RES)을 사용하였다[21]. 한편, 같은 조건에서 세포생존율 변화를 측정한 결과 처리한 NL, NS, NSP, RES 모두 세포 생존율에는 큰 영향을 주지 않은 것으로 확인되었다(Fig. 1B). 따라서, NL, NS, NSP는 LPS로 자극된 RAW 264.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	대식세포가 여러 신호 전달 경로를 활성화시키면서, 어떤 유전자들을 발현시키는가?	대식세포는 Toll-like receptor 4 (TLR4)라고 불리는 pat-tern recognition receptor를 통해 LPS를 인식하고, 이는 mitogen-activated protein kinase (MAPK) family를 포함하여 여러 신호전달 경로를 활성화시키는 것으로 알려져 있다. 또한, 활성화된 MAPKs는 전사 조절인자인 nuclear factor of kappaB (NF-κB)의 전좌를 유도하며, 그 결과 iNOS 또는 COX-2 등과 같은 pro-inflammatory 유전자의 발현으로 이어진다[6, 10, 16].
	염증은 무엇인가?	염증은 독성물질, 상해, 감염 등의 유해한 자극으로부터 숙주를 보호하기 위한 병리학적 반응의 대표적인 특징으로, 다양한 면역세포와 매개물질이 관여하는 복잡한 과정이다. 그러나, 만성적이고 과한 염증상태가 지속되면 오히려 섬유화[23], 퇴행성 뇌 질환[22], 아토피[15], 장 질환[6] 등과 같은 다양한 질병으로 발달할 수 있으며, 심지어 암의 발생에 있어서 대표적인 원인으로 지목된다[9, 17].
	염증상태가 지속되면 어떤 질병이 발생할 수 있는가?	염증은 독성물질, 상해, 감염 등의 유해한 자극으로부터 숙주를 보호하기 위한 병리학적 반응의 대표적인 특징으로, 다양한 면역세포와 매개물질이 관여하는 복잡한 과정이다. 그러나, 만성적이고 과한 염증상태가 지속되면 오히려 섬유화[23], 퇴행성 뇌 질환[22], 아토피[15], 장 질환[6] 등과 같은 다양한 질병으로 발달할 수 있으며, 심지어 암의 발생에 있어서 대표적인 원인으로 지목된다[9, 17]. 이로 인해, 현재 염증을 조절하고 그 기전을 밝히기 위한 연구가 활발히 진행되고 있다.

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표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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