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문제 정의
- LFE 및 LLE, LLE with CR가 RAW264.7 세포에서 iNOS와 COX-2 단백질의 발현 억제를 통하여 NO와 염증성 사이토카인의 생성을 억제하였는지 알아보기 위하여 western blot을 수행하였다. 그 결과, Fig.
- RAW264.7 세포에서 LFE 및 LLE, LLE with CR 추출물들의 실험결과를 바탕으로 LFE 추출물보다 LLE, LLE with CR 추출물의 항염증 효과가 우수하였으므로 구기엽 추출물만을 이용하여 LPS로 염증을 유발한 동물모델에서 추출물들의 항염증 효과를 확인하고자 하였다. 실험의 protocol은 BALB/c mouse에 내독소 LPS를 주입한 후 실험동물의 혈장에서 TNF-α, IFN-γ, IL-6의 생성이 증가하였다고 보고한 Ko 등 [18]와 Cho 등 [19]의 연구에 기초하였다.
- 구기자 나무의 열매와 잎, 클로로필 제거 잎의 에탄올 추출물들의 항염 효능을 확인하여 항염 기능성 소재로의 적용 가능성을 알아보고자 하였다. 효능 측정은 세포단위와 동물실험을 통하여 실시하였다.
- 본 연구에서는 구기엽의 효능평가가 주요 목적이었으므로 구기엽 추출물의 항염 효능을 동물모델에서 확인하였다. 그 결과, 구기엽 추출물 투여 후 LPS 투여군과 추출물을 투여한 군에서 약 5%의 유의한 체중 감소를 보였는데 이는 LPS 투여에 따른 급성 염증 반응에 의한 것으로 사료된다.
- 본 연구에서는 천연 소재이며 항염 활성을 갖는 기능성 소재로 구기엽의 활용 가능성을 탐색하고 구기자와 비교, 검토하고자 하였다. 아울러 식품이나 화장품 소재로 사용할 때 불안정하고 제품의 색상을 어둡게 하는 문제가 있는 구기엽의 클로로필을 제거한 시료의 활성도 비교 검토하였다.
제안 방법
- 0.5% normal melting agarose (NMA)가 미리 도포된 comet slide (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA) 위에 전혈 5 μL와 75 μL 0.75% low melting agarose (LMA)을 혼합한 현탁액을 분주하고 cover glass로 덮어 4°C의 암소에서 10분간 응고시켰다.
- DNA 손상정도를 측정하기 위해 20 μg/mL ethidium bromide로 형광 염색한 후 광학현미경 (light microscope DM 2000, Leica Microsystems, Wetzlar, Germany)으로 관찰하였으며, Komet 5.5 image analyzing system (Andor, Nottingham, UK)를 사용하여 분석하였다.
- LLE 및 LLE with CR 추출물들이 염증반응으로 인한 림프구 DNA 손상을 억제시킬 수 있는지 확인하기 위해 comet assay를 실시하였다 (Table 2). 광학현미경으로 염색한 세포핵의 형태를 확인하였을 때 LLE 및 LLE with CR를 투여하고 LPS만 투여한 동물의 림프구 핵은 추출물을 처리하지 않고 LPS만 처리한 양성대조군에 비해 DNA 손상이 유의하게 적었다.
- LPS로 염증반응을 유도한 실험동물의 혈청에서 염증성 사이토카인의 분비량을 확인하였다. 혈청 내의 TNF-α, IL-6 및 IL-1β의 분비량은 위의 세포주 실험에서와 동일한 방법을 사용하여 측정하였다.
- RAW264.7 세포를 1 × 105 cells/mL의 농도로 96-well plate에 분주하고 24시간 동안 배양한 후 농도별 추출물 (31.25, 62.5, 125, 250, 500, 1,000 μg/mL)과 1 μg/mL 농도의 LPS (Sigma-Aldrich Co.)를 처리하여 24시간 배양하였다.
- RAW264.7 세포를 2.5× 105 cell/mL 농도로 6-well plate에 분주하고 24시간 동안 배양한 후 농도별 추출물 (125, 250, 500, 1,000 μg/mL)과 LPS (1 μg/mL)를 처리하여 24시간 배양하였다.
- RAW264.7 세포를 4 × 105 cells/mL의 농도로 48-well plate에 분주하고 24시간 동안 배양한 후 농도별 추출물(31.25, 62.5, 125, 250, 500, 1,000 μg/mL)과 1 μg/mL 농도의 LPS를 처리하여 24시간 배양하였다.
- RAW264.7 세포에서 LFE 및 LLE, LLE with CR 추출물의 항염증 효과를 확인하기 위해서 추출물과 LPS를 동시에 24시간 동안 처리한 세포에서 NO 생성량을 측정하였다 (Fig. 2). NO 생성량은 LPS 처리군에서 33.
- RAW264.7 세포에서는 LPS와 동시에 추출물 (LFE, LLE, LLE with CR)을 처리한 세포에서 NO와 TNF-α, IL-6, IL-1β 생성량 및 iNOS와 COX-2의 발현을 측정하였고, 동물실험에서는 7일간 추출물들 (LLE, LLE with CR)을 경구투여한 BALB/c mice에 LPS를 투여하여 염증을 유도한 후 혈청의 TNF-α, IL-6, IL-1β 농도와 DNA fragmentation을 측정하였다.
- 각 추출물들의 세포독성을 알아보기 위하여 water soluble tetrazolium salts (WST)를 사용하여 cell proliferation을 측정하였다. RAW264.
- 건조 구기자 및 구기엽을 각각 100 g씩 계량하여 중량의 8배수가 되도록 100% 주정을 가하여 70°C에서 3시간 동안 3회 반복 교반 추출하였다.
- 정상대조군과 LPS 투여군에는 멸균한 PBS를 각각 100 μL/mouse 투여하였고, LLE군에는 구기엽 추출물, LLE with CR군에는 클로로필을 제거한 구기엽 추출물을 각각 체중 kg당 200 mg의 농도로 PBS에 녹여 100 μL/mouse씩 7일간 경구투여 하였다. 경구투여 후 12시간 절식시킨 실험동물에 정상대조군에는 PBS를, LPS군과 실험군에는 LPS를 체중 kg당 5 mg 농도로 복강주사한 8시간 후에 희생하였다. 실험동물의 하대정맥으로부터 채혈한 혈액의 일부는 전혈 상태로 comet assay에 사용하고 나머지 혈액은 4°C, 3,000 rpm에서 10분간 원심분리 하여 혈청을 분리하였다.
- 또한 본 실험에서는 클로로필에 의한 간섭효과를 배제하기 위해 구기엽에 함유된 클로로필을 제거한 시료도 제조하였다. 구기엽에 함유된 클로로필은 구기엽 주정추출물에 100% 클로로포름 (Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA)을 가하여 클로로필을 침전시키고, charcoal column을 사용하여 1차로 색소를 제거한 후 silica gel column chromatography를 사용하여 최종적으로 클로로필을 제거하였다. 시료는 구기자 추출물 (LFE), 구기엽 추출물 (LLE), 클로로필을 제거한 구기엽 추출물 (LLE with CR)으로 구분하였다.
- , Tokyo, Japan)로 감압 농축하였다. 또한 본 실험에서는 클로로필에 의한 간섭효과를 배제하기 위해 구기엽에 함유된 클로로필을 제거한 시료도 제조하였다. 구기엽에 함유된 클로로필은 구기엽 주정추출물에 100% 클로로포름 (Sigma-Aldrich Co.
- )를 처리하여 24시간 배양하였다. 배양 후 EZ-Cytox WST assay reagent (Dogenbio Co., Ltd., Seoul, Korea)을 첨가한 후, ELISA reader (Microplate absorbance spectrophotometer, Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA)를 이용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. 실험군의 세포 생존율은 대조군의 세포 생존율 대비의 백분율 (%)로 나타내었다.
- 본 연구에서는 구기자, 구기엽과 클로로필을 제거한 구기엽 추출물들의 항염증 효과를 확인하고 LPS로 염증을 유도한 RAW264.7 대식세포에서 구기자와 구기엽 추출물의 항염증 효과를 비교한 후 효능이 더 높은 추출물의 항염증 효과를 동물모델에서 확인하였다.
- 본 실험에서는 8주령의 BALB/c계 수컷 mouse 12마리를 (주)중앙실험동물 (Seoul, Korea)로부터 분양 받아 온도 22 ± 2°C, 습도 55 ± 5%로 자동 조절되는 micro ventilation caging system에서 1주간 적응시킨 후 실험에 사용하였다. 사육 기간 동안 일반 고형사료와 물은 제한없이 공급하였고, 동물실험 전과 후에 실험동물의 체중을 측정하였다. 평균체중 24.
- 일정량의 세포배양액을 취하여 동량의 Griess reagent (Promega, Madison, WI, USA)과 혼합하여 반응시킨 후 ELISA reader를 이용하여 550 nm에서 흡광도를 측정하였다. 세포로부터 생성된 NO의 함량은 sodium nitrite (NaNO2)를 사용하여 작성한 표준곡선을 이용하여 산출하였다. 세포배양액 내의 TNF-α와 IL-6의 생성량은 mouse ELISA kit (BD Biosciences, San Diego, CA, USA)를 사용하여, IL-1β의 생성량은 mouse ELISA kit (R&D systems, Minneapolis, MN, USA)를 사용하여 제시된 방법에 따라 처리한 다음, ELISA reader로 450 nm에서 흡광도를 측정한 후 각 검량곡선을 바탕으로 염증성 사이토카인들의 생성량을 산출하였다.
- 세포배양액 내의 TNF-α와 IL-6의 생성량은 mouse ELISA kit (BD Biosciences, San Diego, CA, USA)를 사용하여, IL-1β의 생성량은 mouse ELISA kit (R&D systems, Minneapolis, MN, USA)를 사용하여 제시된 방법에 따라 처리한 다음, ELISA reader로 450 nm에서 흡광도를 측정한 후 각 검량곡선을 바탕으로 염증성 사이토카인들의 생성량을 산출하였다.
- Louis, MO, USA)을 가하여 클로로필을 침전시키고, charcoal column을 사용하여 1차로 색소를 제거한 후 silica gel column chromatography를 사용하여 최종적으로 클로로필을 제거하였다. 시료는 구기자 추출물 (LFE), 구기엽 추출물 (LLE), 클로로필을 제거한 구기엽 추출물 (LLE with CR)으로 구분하였다. 모든 시료는 -20°C에 보관하면서 실험에 사용하였다.
- 본 연구에서는 천연 소재이며 항염 활성을 갖는 기능성 소재로 구기엽의 활용 가능성을 탐색하고 구기자와 비교, 검토하고자 하였다. 아울러 식품이나 화장품 소재로 사용할 때 불안정하고 제품의 색상을 어둡게 하는 문제가 있는 구기엽의 클로로필을 제거한 시료의 활성도 비교 검토하였다.
- 염증반응으로 산화적 스트레스를 유발시킨 mouse에서 림프구의 DNA 손상을 확인하기 위해 comet assay를 실시하였다. 실험방법은 선행연구인 Tice 등 [20]의 방법을 참고하여 수행하였다.
- )를 1:2,000의 비율로 희석하여 상온에서 1시간 반응시킨 후 TBS-T로 3회 세척하였다. 이후 Ezwestlumi-plus (ATTO Co., Tokyo, Japan)를 처리한 membrane의 단백질 밴드를 Chemiluminescent Imaging System (LuminoGraphⅡ, ATTO Co.)을 이용하여 가시화하였고, band intensity의 정량화는 CS Analyzer 4 (ATTO Co.)를 이용하였다.
- 정상대조군과 LPS 투여군에는 멸균한 PBS를 각각 100 μL/mouse 투여하였고, LLE군에는 구기엽 추출물, LLE with CR군에는 클로로필을 제거한 구기엽 추출물을 각각 체중 kg당 200 mg의 농도로 PBS에 녹여 100 μL/mouse씩 7일간 경구투여 하였다.
- 추출물들이 RAW264.7 세포생존율에 미치는 영향을 알아보기 위해서 WST assay를 수행하였다. 모든 추출물을 31.
- 평균체중 24.70 ± 1.44 g인 실험동물은 군당 3마리씩 정상대조군 (PBS군), LPS 투여군, 실험군 (LLE군, LLE with CR군)으로 분류하여 실험하였다.
- 혈청 내의 TNF-α, IL-6 및 IL-1β의 분비량은 위의 세포주 실험에서와 동일한 방법을 사용하여 측정하였다.
- 구기자 나무의 열매와 잎, 클로로필 제거 잎의 에탄올 추출물들의 항염 효능을 확인하여 항염 기능성 소재로의 적용 가능성을 알아보고자 하였다. 효능 측정은 세포단위와 동물실험을 통하여 실시하였다. RAW264.
대상 데이터
- RAW264.7 세포의 배양액은 10% fetal bovine serum (FBS; Hyclone, Mordialloc, Victoria, Australia)과 1% penicillin-streptomycin (Gibco, Grand Island, NY, USA)을 첨가한 Dulbecco’s modified Eagle medium (DMEM; Gibco)을 사용하였으며, 세포 배양은 37°C, 5% CO2조건의 배양기 (BB15, Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA)에서 실시하였다.
- iNOS, COX-2의 발현량을 확인하기 위한 1차 항체로는 anti-rabbit iNOS, COX-2 (Cell Signaling Technology Inc., Beverly, MA, USA)를 사용하였고 1:1,000의 비율로 희석하여 4°C에서 12시간 정치한 후 tris buffered saline Tween-20 (TBS-T)로 3회 세척하였다.
- 본 실험에 사용된 세포는 RAW264.7 대식세포주로서 한국세포주은행 (Korean Cell Line Bank, Seoul, Korea)에서 분양받아 사용하였다. RAW264.
- 본 실험에 사용한 구기자와 구기엽은 중국 북서부의 Ningxia Hui 자치구에서 재배된 영하구기자 (Lycium barbarum L.)의 열매와 어린잎으로 구기자는 9 ~ 10월에, 구기엽은 3~5월에 수확하여 건조한 것을 Zaokang Goji Berry Inc. (Yinchuan, Ningxia, China)로부터 구입하여 사용하였다. 건조 구기자 및 구기엽을 각각 100 g씩 계량하여 중량의 8배수가 되도록 100% 주정을 가하여 70°C에서 3시간 동안 3회 반복 교반 추출하였다.
- 본 실험에서는 8주령의 BALB/c계 수컷 mouse 12마리를 (주)중앙실험동물 (Seoul, Korea)로부터 분양 받아 온도 22 ± 2°C, 습도 55 ± 5%로 자동 조절되는 micro ventilation caging system에서 1주간 적응시킨 후 실험에 사용하였다.
- DNA 손상정도는 핵으로부터 이동해서 생긴 꼬리 부분에서 떨어져 나간 DNA 비율 (tail DNA), DNA 파편의 길이 (tail length, TL), 그리고 tail DNA와 tail length로부터 산출된 tail moment (TM)으로 나타내었다. 실험동물의 slide당 50개의 DNA를 무작위로 선택하여 관찰하였다.
데이터처리
- 3) Means with different letters (a-b) are significantly different by Duncan’s multiple range test (p < 0.05).
- 각 군 간의 평균값에 대한 유의성은 신뢰수준 95% (p < 0.05)에서 one-way ANOVA test를 실시하고 유의한 차이를 검증한 후 사후분석으로 Duncan’s multiple range test를 사용하여 검증하였다.
- 05)에서 one-way ANOVA test를 실시하고 유의한 차이를 검증한 후 사후분석으로 Duncan’s multiple range test를 사용하여 검증하였다. 동물실험에서 실험 전후 체중의 차이는 paired t-test로 신뢰수준 95%에서 검증하였다.
- 실험 결과의 통계처리는 SPSS program (statistical package for social sciences; ver. 24, IBM Corporation, New York, NY, USA)을 이용하여 분석하였고 평균± 표준편차 (mean ± SD)로 나타내었다.
이론/모형
- LFE 및 LLE, LLE with CR 추출물들이 세포질 내에 생성되는 iNOS, COX-2의 발현에 미치는 영향을 알아보기 위하여 western blot을 실시하였다. RAW264.
- 염증반응으로 산화적 스트레스를 유발시킨 mouse에서 림프구의 DNA 손상을 확인하기 위해 comet assay를 실시하였다. 실험방법은 선행연구인 Tice 등 [20]의 방법을 참고하여 수행하였다. 0.
- 실험의 protocol은 BALB/c mouse에 내독소 LPS를 주입한 후 실험동물의 혈장에서 TNF-α, IFN-γ, IL-6의 생성이 증가하였다고 보고한 Ko 등 [18]와 Cho 등 [19]의 연구에 기초하였다.
성능/효과
- 1,000 μg/mL에서 LPS 처리군 대비 LFE군은 약 51%, LLE군은 74.8%, LLE with CR군은 77.9%의 저해율을 보였다 (LFE 58.4 ng/mL, LLE 28.8 ng/mL, LLE with CR 26.3 ng/mL).
- 1,000 μg/mL에서는 LPS 처리군 대비 LFE군은 약 6.4%, LLE군은 83%, LLE with CR군은 68.2%의 저해율을 보였다 (LFE 192.6 ng/mL, LLE군 41.3 ng/mL, LLE with CR군 65.5 ng/mL).
- BALB/c mice 동물모델에서 구기엽 추출물들의 항염 효능을 측정한 결과, 혈청 TNF-α, IL-6, IL-1β의 농도는 구기엽 추출물 및 클로로필 제거 구기엽 추출물 투여군에서 감소하였으며 그 효과는 클로로필 제거 구기엽군에서 더 크게 나타났다.
- IL-1β 생성에 미치는 효과는 LFE군에 비해 LLE군이 월등히 컸고 LLE with CR군은 LLE군에 비해 억제 효과가 1,000 μg/mL에서 약 2배 정도 낮았다.
- LFE 및 LLE with CR를 1,000 μg/mL로 처리했을 때 IL-1β 생성량이 LPS 단독 처리군 대비 각각 26%, 53.1% 저해율을 보였고 (LFE 131 pg/mL, LLE with CR 83 pg/mL), LLE군의 경우는 IL-1β 생성을 LPS를 처리하지 않은 군 수준까지 감소시켰다.
- 7 세포에서는 거의 발현되지 않았지만 LPS 처리군에서는 LPS 자극에 의하여 현저하게 증가함을 확인하였다. LFE군 및 LLE군, LLE with CR군은 LPS에 의해 증가한 iNOS 단백질의 발현을 각각 65%, 95%, 99% 감소시켰고, COX-2 단백질 발현에서 LPS군 대비 LFE군은 86%, LLE군은 75%, LLE with CR군은 99%의 저해율을 보여 iNOS 단백질 발현의 감소와 유사한 경향을 나타내었다.
- LFE를 처리한 군에서는 31.25 μg/mL 농도에서부터 NO 생성이 유의하게 저해되었으며 (p < 0.05) 1,000 μg/mL 농도에서는 13.37 μM로서, LPS 단독 처리군에 비해 약 60.3% 저해율을 보였다.
- LLE 투여군의 tail DNA 8.42%, tail length 20.23 μm, tail moment 2.29였고, LLE with CR 투여군에서는 tail DNA 8.57%, tail length 14.77 μm, tail moment 1.93으로 나타났다.
- LLE과 LLE with CR를 처리한 군은 각각 250 μg/mL, 62.5 μg/mL 농도에서부터 농도 의존적으로 NO 생성이 유의하게 저해되었으며, 두 시료 모두 1,000 μg/mL 농도에서 LPS 단독 처리군 대비 약 75%의 저해율을 보였다 (LLE군 8.48 μM, LLE with CR군 8.40 μM, p < 0.05).
- LPS 투여 8시간 경과 후 혈청 TNF-α 농도는 LPS 투여군에서 202.05 pg/mL로 정상대조군에 비해 약 200배 정도 증가하여 염증 반응이 잘 유도되었음을 알 수 있었다.
- LPS와 추출물을 처리한 세포로부터 생성된 NO와 TNF-α, IL-6, IL-1β는 모두 유의하게 억제되었고 구기자추출물에 비하여 구기엽 추출물들의 영향이 더 크게 나타났다 (p < 0.05).
- NO는 체내 방어기능, 혈관확장, 신호전달 등 다양한 생리기능을 가지고 있으며, iNOS는 L-arginine을 L-citrulline으로 전환하면서 NO를 생성하고 이는 다양한 병리작용을 나타낸다 [6]. NO 및 염증성 사이토카인의 생성 억제가 iNOS, COX-2의 단백질 발현과 관련이 있는지 확인한 결과, 구기자 및 구기엽 추출물이 iNOS와 COX-2의 발현에 뚜렷한 억제 효과를 보였다. 이러한 결과는 구기자 및 구기엽 추출물 처리가 iNOS와 COX-2 단백질 발현의 억제를 통하여 NO와 염증성 사이토카인인 TNF-α와 인터루킨들의 생성을 억제함으로써 항염 효능을 나타내는 것으로 볼 수 있다.
- NO 생성 억제 효과는 저농도에서는 구기자 추출물이 구기엽 추출물에 비해 높은 경향을 보여주었으나 1,000 μg/mL의 고농도에서는 LLE with CR군> LLE군> LFE군 순으로 나타났다.
- NO 생성량은 LPS 처리군에서 33.68 μM, LPS를 처리하지 않은 군에서 0.86 μM로 약 39배 정도 NO 생성이 증가한 것으로 보아 LPS에 의해 염증반응이 잘 유도된 것을 알 수 있었다.
- RAW264.7 세포에 LPS와 구기자 및 구기엽 추출물을 동시에 처리한 후, 주요 염증매개물질인 NO, TNF-α, IL-6, IL-1β 생성과 이와 관련된 iNOS, COX-2의 단백질 발현을 측정한 결과, 모든 추출물이 NO, TNF-α, IL-6, IL-1β의 생성을 효과적으로 저해하고 단백질 발현을 억제함을 확인하였다.
- RAW264.7 세포에 처리한 추출물들은 모두 1,000 μg/mL의 농도까지 세포증식능에 영향을 주지 않아 안전한 것으로 확인되었다.
- TNF-α 생성량은 LPS 처리 군에서 119.1 ng/mL로 아무것도 처리하지 않은 정상세포 군의 18.7 ng/mL에 비해 약 6배 정도 높아졌으며, LFE 및 LLE, LLE with CR를 LPS와 동시에 처리한 군에서는 31.25 μg/mL부터 농도 의존적으로 유의하게 TNF-α의 생성이 억제되었음을 확인하였다 (p < 0.05).
- Tail DNA, tail length, tail moment의 모든 지표에서 LPS 단독 투여군에 비해 LLE 및 LLE with CR 투여군의 값이 유의하게 감소하였다 (p < 0.05).
- LLE 및 LLE with CR 추출물들이 염증반응으로 인한 림프구 DNA 손상을 억제시킬 수 있는지 확인하기 위해 comet assay를 실시하였다 (Table 2). 광학현미경으로 염색한 세포핵의 형태를 확인하였을 때 LLE 및 LLE with CR를 투여하고 LPS만 투여한 동물의 림프구 핵은 추출물을 처리하지 않고 LPS만 처리한 양성대조군에 비해 DNA 손상이 유의하게 적었다. Tail DNA, tail length, tail moment의 모든 지표에서 LPS 단독 투여군에 비해 LLE 및 LLE with CR 투여군의 값이 유의하게 감소하였다 (p < 0.
- 7 세포에서 iNOS와 COX-2 단백질의 발현 억제를 통하여 NO와 염증성 사이토카인의 생성을 억제하였는지 알아보기 위하여 western blot을 수행하였다. 그 결과, Fig. 4에 보이는 것처럼 iNOS와 COX-2의 발현량이 LPS를 처리하지 않은 RAW264.7 세포에서는 거의 발현되지 않았지만 LPS 처리군에서는 LPS 자극에 의하여 현저하게 증가함을 확인하였다. LFE군 및 LLE군, LLE with CR군은 LPS에 의해 증가한 iNOS 단백질의 발현을 각각 65%, 95%, 99% 감소시켰고, COX-2 단백질 발현에서 LPS군 대비 LFE군은 86%, LLE군은 75%, LLE with CR군은 99%의 저해율을 보여 iNOS 단백질 발현의 감소와 유사한 경향을 나타내었다.
- 본 연구에서는 구기엽의 효능평가가 주요 목적이었으므로 구기엽 추출물의 항염 효능을 동물모델에서 확인하였다. 그 결과, 구기엽 추출물 투여 후 LPS 투여군과 추출물을 투여한 군에서 약 5%의 유의한 체중 감소를 보였는데 이는 LPS 투여에 따른 급성 염증 반응에 의한 것으로 사료된다. 또한 LPS와 함께 구기엽 추출물을 7일간 투여한 군들에서 LPS 단독 투여군에 비하여 모든 염증 지표가 감소하여 구기엽 추출물들의 보호 효과를 보여주었다.
- 천연물 소재들의 항산화 및 항염 활성은 함유하고 있는 항산화 물질에 의해 나타나게 되는데 구기자는 다당류와 플라보노이드 및 폴리페놀성 물질을 함유하고 있고 [22,27], 구기엽에도 폴리페놀 계열인 rutin 등의 플라보노이드를 다량 함유하고 있는 것으로 보고되었다 [12,22]. 다당류와 플라보노이드 및 폴리페놀성 물질은 항산화 및 항염 활성의 주요 요인으로 [27-29], 본 연구에서 확인한 구기자 및 구기엽의 뛰어난 항염 효능은 플라보노이드 및 폴리페놀성 화합물에 의한 것으로 사료된다.
- 또한 IL-6 생성량은 LPS 처리 군에서 205.8 ng/mL, LPS를 처리하지 않은 군에서 0.5 ng/mL로 유의하게 증가하였으며, LFE 및 LLE, LLE with CR를 처리하였을 경우에 LFE군은 250 μg/mL 농도부터, LLE군과 LLE with CR군은 62.5 μg/mL농도에서부터 유의하게 감소하기 시작하여 이후 농도 의존적으로 감소하였다 (p < 0.05).
- 그 결과, 구기엽 추출물 투여 후 LPS 투여군과 추출물을 투여한 군에서 약 5%의 유의한 체중 감소를 보였는데 이는 LPS 투여에 따른 급성 염증 반응에 의한 것으로 사료된다. 또한 LPS와 함께 구기엽 추출물을 7일간 투여한 군들에서 LPS 단독 투여군에 비하여 모든 염증 지표가 감소하여 구기엽 추출물들의 보호 효과를 보여주었다. 이러한 BALB/c mouse 동물모델에서 혈청 염증성 사이토카인 수준의 감소는 RAW264.
- 7 세포에서 NO와 TNF-α, IL-6, IL-1β 생성을 억제하고 iNOS 및 COX-2의 발현을 저해시켰으며 구기자에 비해서도 그 효과는 낮지 않았다. 또한 구기엽 추출물들 모두 LPS로 염증반응을 유도한 BALB/c 동물모델에서 뛰어난 항염증 및 세포보호 효과를 나타내었다. 따라서 구기엽 추출물과 클로로필 제거 구기엽 추출물들은 항염활성을 보이는 천연소재로서 활용 가능하며 원료 표준화에 대한 연구를 수행한다면 구기자 나무의 부가가치를 높일 수 있을 것이다.
- 또한 세포의 iNOS와 COX-2의 단백질 발현도 구기자< 구기엽< 클로로필 제거 구기엽의 순으로 억제됨을 확인할 수 있었다.
- 모든 추출물을 31.25 ~ 1,000 μg/mL의 농도로 24시간 동안 세포에 처리한 결과, 대식세포의 생존율은 대조군과 유의한 차이를 보이지 않았으므로 세포 독성이 없는 것으로 확인되었다 (Fig. 1).
- 본 연구결과, 구기엽 추출물은 LPS로 처리한 RAW264.7 세포에서 NO와 TNF-α, IL-6, IL-1β 생성을 억제하고 iNOS 및 COX-2의 발현을 저해시켰으며 구기자에 비해서도 그 효과는 낮지 않았다.
- 본 연구에서도 구기자 및 구기엽 추출물을 대식세포에 처리했을 때 1,000 μg/mL까지 세포 독성이 없는 것을 확인하였으며, 클로로포름을 이용하여 클로로필을 제거한 구기엽도 같은 농도까지 세포 증식률에 영향이 없는 것을 확인하였다.
- 이러한 화학적 구조는 항산화 활성을 결정하는 중요한 요인이고, 클로로필 제거 후에 금속 킬레이션 능력을 가진 화합물이 농축되어 항산화 활성이 더 높아진 것으로 보고 있다. 본 연구에서도 클로로필을 제거하는 과정에서 항산화활성이 더 높은 폴리페놀성 화합물들이 농축되었을 것으로 생각되며, 구기엽 자체의 생리 활성과 함께 클로로필을 제거하면서 높아지는 항산화 활성으로 인해 클로로필을 제거한 구기엽 추출물이 더 뛰어난 항염 효능 및 세포 보호 효과를 보인 것으로 생각된다.
- 수율은 각각 20.5%와 16.4%였으며 클로로필 함량은 각각 1194.6 μg/kg과 1.7 μg/kg, 총 폴리페놀 함량은 각각 140.5 mg gallic acid equivalent (GAE)/extract g과 312.9 mg GAE/extract g이었다.
- 정상대조군의 체중 변화는 없었고, LPS를 투여한 단독 투여군, LLE 투여군, LLE with CR 투여군에서 각각 4.4%, 4.9%, 6.1% 정도의 체중 감소를 보였다 (p < 0.05).
- 추출물이 IL-1β 생성량에 미치는 영향은 LPS를 처리한 군에서 IL-1β 생성량이 177 pg/mL로 증가하였으나, LFE군, LLE군은 31.25 μg/mL에서부터, LLE with CR군은 62.5 μg/mL농도에서부터 IL-1β 생성이 유의하게 감소하였다 (p < 0.05).
- 혈청 IL-1β 농도를 측정한 결과, 구기엽 추출물을 투여했을 때 혈청 IL-1β의 생성량이 LPS 단독 투여군 대비 LLE 투여군은 19.4%, LLE with CR 투여군은 32.8% 낮아지는 경향을 보였으나 유의한 차이는 아니였다 (LPS 단독 투여군 44.28 pg/mL LLE 투여군 35.67 pg/mL, LLE with CR 투여군 29.76 pg/mL).
- 혈청 IL-6 농도는 LPS 투여군에서 8.37 ng/mL로 정상대조군에 비해 유의하게 증가 하고 있었으나, LLE 투여군은 6.39 ng/mL로 약 23.7%의 감소경향을 보여주었고, LLE with CR 투여군에서는 1.48 ng/mL로서 약 82.3%의 유의한 저해율을 보였다 (p < 0.05).
- 혈청 TNF-α의 농도를 LPS 단독 투여군과 비교했을 때, LLE군과 LLE with CR군에서 각각 23.1%, 61.1% 저해됨을 확인하였다 (LLE 투여군 155.29 pg/mL, LLE with CR 투여군 78.6 pg/mL).
후속연구
- 또한 구기엽 추출물들 모두 LPS로 염증반응을 유도한 BALB/c 동물모델에서 뛰어난 항염증 및 세포보호 효과를 나타내었다. 따라서 구기엽 추출물과 클로로필 제거 구기엽 추출물들은 항염활성을 보이는 천연소재로서 활용 가능하며 원료 표준화에 대한 연구를 수행한다면 구기자 나무의 부가가치를 높일 수 있을 것이다.
- 구기엽 추출물둘은 DNA 손상보호효과를 유의하게 보였으나 두 군 간에는 차이가 없었다. 따라서 구기엽 추출물과 클로로필 제거 구기엽 추출물은 항염효능을 가진 천연 소재로 활용되어 기능성 식품 및 화장품 개발에서 활용될 수 있으므로 구기자나무의 부가가치를 높일 수 있을 것으로 생각된다.
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