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문제 정의
- 본 연구에서는 12주간 김치에서 추출한 유산균 Lactobacillus plantarum 섭취가 피부의 산도 및 관련인자인 유리아미노산, 젖산 및 유리지방산의 함량을 변화시키는지 파악하였다. CJLP 군에서 12주차에 피부 산도가 대조군에 비해 개선되었다.
- 본 연구에서는 LDH의 mRNA 발현을 파악하지 않았으나 김치유산균 Lactobacillus plantarum의 섭취가 IL-10 과 TNF-α의 분비 변화와 더불어 세포의 PKA와 PKC 경로를 활성화시켜 간접적으로 LDH의 mRNA 전사 및 단백질 발현 증가를 통해 젖산의 생성을 증가시켰을 가능성을 제안한다.
- 흥미롭게도 In vitro 연구에서는 Lactobacillus plantarum이 쌀 발효에서 산도를 낮출 뿐 아니라, pH 2 ~ 3에서도 탁월한 생존 효과를 갖는 것으로 보고되었으나 섭취에 의한 피부 산도 개선 효능에 대한 연구 보고는 전무하다 [21,22]. 이에 본 연구는 피부 노화가 시작되는 20 ~ 30대 성인 남녀를 대상으로 김치에서 추출한 Lactobacillus plantarum 섭취가 피부 산도 및 표피의 유리아미노산, 젖산과 유리지방산의 함량 변화에 미치는 영향을 알아보고자 하였다.
제안 방법
- GC 분석 조건은 260°C detector (flameionization detector) port, 250°C injector port에서 oven 온도를 190°C로 5분간 유지시켰으며 4°C/min로 온도를 상승시켜 240°C에서 15분간 유지시켰다.
- 농도별 L(+)-Lactate Standard 및 추출액 15 μl를 96 well plate에 분주한 후 각 well에 Lactate Assay Buffer 35 μl와 젖산탈수소효소 (Lactate Dehydrogenase, LDH) 및 Nicotinamide Adenine Dinucleotide (NAD)가 함유된 Lactate Enzyme Mix 50 μl를 가하였다. Plate를 호일로 싸서 상온에서 30분간 방치하여, LDH에 의해 젖산이 피루브산(Pyruvic acid)으로 전환될 때 생성되는 NADH에 비례하여 환원되는 붉은색의 formazan의 함량을 Perkin Elmer 2030 Multilabel Reader (PerkinElmer Life and Analytical Sciences, Turku, Finland)을 이용하여 570 nm 파장에서 측정하였다 [25,26]. 젖산 함량은 단백질 정량과 함께 nmol/μg protein으로 표시하였다.
- Plate를 호일에 싸서 37°C에서 30 분간 방치하여 L-Amino Acid Oxidase 효소에 의해 유리 아미노산이 α-Keto Acid와 암모니아 (ammonia, NH3) 및 과산화수소 (hydrogen peroxide, H2O2)로 산화되고, 이어서 H2O2가 Colormetric Probe와 1:1 산화 반응하여 생성된 청색의 formazan의 함량을 Perkin Elmer 2030 Multilabel Reader (PerkinElmer Life and Analytical Sciences, Turku, Finland)을 이용하여 570 nm 파장에서 측정하였다.
- 농도별 L(+)-Lactate Standard 및 추출액 15 μl를 96 well plate에 분주한 후 각 well에 Lactate Assay Buffer 35 μl와 젖산탈수소효소 (Lactate Dehydrogenase, LDH) 및 Nicotinamide Adenine Dinucleotide (NAD)가 함유된 Lactate Enzyme Mix 50 μl를 가하였다.
- 농도별 L-Amino Acid Standard 및 추출액 30 μl를 96well plate에 분주한 후 각 well에 L-Amino Acid Assay Buffer를 20 μl를 가하고, 이어서 L-Amino Acid Oxidase가 함유된 L-Amino Acid Enzyme Mix 50 μl를 가하였다.
- 시료는 (주)제일제당에서 제공받았다. 무작위로 선정된 피험자에게 김치유산균 [CJLP Group: Lactobacillus plantarum CJLP55 1010 Colony Forming Unit (CFU) 함유 분말 9%, 말토덱스트린 45.5%, 분말 포도당 45.5%] 또는 위약 분말 [Placebo Group: 말토덱스트린 50%, 분말 포도당 50%]을 2 g/1회/1일 복용 방법으로 12주간 섭취하게 하였다. 연구 기간 동안 순응도는 매주 전화로 모니터링을 하였다.
- 세안 후 온도 18 ~ 26°C, 습도 26 ~ 53%가 유지된 공간에서 30분 동안 경과 후 동의한 피험자에 한하여 pH meter (PH905, Courage-Khazaka, Germany)를 이용하여 이마 부 위에 총 5회 측정해 평균값을 사용하였다.
- 5%] 또는 위약 분말 [Placebo Group: 말토덱스트린 50%, 분말 포도당 50%]을 2 g/1회/1일 복용 방법으로 12주간 섭취하게 하였다. 연구 기간 동안 순응도는 매주 전화로 모니터링을 하였다. 본 연구는 경희대학교 생명윤리 위원회 승인을 받았다 (승인번호 : KHSIRB 2018-016).
- 원형 테잎에 Methanol 10 mL를 가하고 상온에서 5분간 초음파 처리하여 테잎에서 각질층을 채취하였다. 원심분리 후 상층은 Lowry 방법을 응용하여 [23] 단백질을 정량하였으며, 하층은 기존에 제시된 방법으로 [24] 지질을 추출하였다. 추출된 상층 샘플 3 mL를 취하고 Cold trap/Vaccum pump/Modulspin 40 (speed vac)을 이용하여 증발시킨 후 1% SDS/phosphate buffer saline (PBS) 300 μl를 가하여 전처리 하였다.
- 이어서 Gas chromatograph (GC) (GC-17A, Shimazu, Japan)에 주입하고 SPB-225 fused silica capillary column (30 m × 0.25 mm × 0.15 μm: Supelco, Bellefonte, PA, USA)를 이용하여 각 유리지방산의 함량을 분석하였다.
- 전처리에서 얻어진 상층 추출액을 L-Amino Acid Quantitation Colorimetric/Fluorometric Kit (Biovision Co., South Milpitas Boulevard, CA, USA)을 이용하여 유리아미노산 함량을 측정하였다. 농도별 L-Amino Acid Standard 및 추출액 30 μl를 96well plate에 분주한 후 각 well에 L-Amino Acid Assay Buffer를 20 μl를 가하고, 이어서 L-Amino Acid Oxidase가 함유된 L-Amino Acid Enzyme Mix 50 μl를 가하였다.
- 전처리에서 얻어진 상층 추출액을 Lactate Colorimetric/ Fluorometric Assay Kit (Biovision Co., South Milpitas Boulevard, CA, USA)을 이용하여 젖산 함량을 분석하였다. 농도별 L(+)-Lactate Standard 및 추출액 15 μl를 96 well plate에 분주한 후 각 well에 Lactate Assay Buffer 35 μl와 젖산탈수소효소 (Lactate Dehydrogenase, LDH) 및 Nicotinamide Adenine Dinucleotide (NAD)가 함유된 Lactate Enzyme Mix 50 μl를 가하였다.
- 전처리에서 얻어진 하층의 지질 추출물을 folch 용액 (CHCl3:MeOH = 2:1, v/v)에 녹인 뒤 silica gel glass plates (10 × 10 cm; HX54710531, EMD Millpore Co., Germany) 에 점적하고, high performance thin-layer (HPTLC) 분석법을 응용하여 유리지방산을 분획하였다.
- , Germany) 에 점적하고, high performance thin-layer (HPTLC) 분석법을 응용하여 유리지방산을 분획하였다. 즉 유리지방산 (Free Fatty Acid, FFA)은 전개액 Hexane: Diethyl ether: Acete acid (7:3:0.1, v/v/v)을 9.5 cm까지 전개시켜 분획하였다 [27]. 분획된 유리지방산을 박층으로부터 긁어낸 후 Folch 용액에 녹여 추출하고 internal standard인 methyl C15:0 (Pentadecanoic, methyl, N-15-M, Nu-check, USA) 첨가 후 6% HCl을 함유한 Methanol을 가하여 지방산을 methylation 시켰다 [28].
대상 데이터
- 본 연구는 20 ~ 30대 건강한 성인 남녀 90명을 모집하여 동의를 얻은 후 진행하였고 12주간의 섭취 기간 동안 항생제 복용 및 피부과 시술을 받은 대상자를 제외한 최종 78명을 대상으로 실시하였다. 시료는 (주)제일제당에서 제공받았다.
- 본 연구는 20 ~ 30대 건강한 성인 남녀 90명을 모집하여 동의를 얻은 후 진행하였고 12주간의 섭취 기간 동안 항생제 복용 및 피부과 시술을 받은 대상자를 제외한 최종 78명을 대상으로 실시하였다. 시료는 (주)제일제당에서 제공받았다. 무작위로 선정된 피험자에게 김치유산균 [CJLP Group: Lactobacillus plantarum CJLP55 1010 Colony Forming Unit (CFU) 함유 분말 9%, 말토덱스트린 45.
- 최종 대상자 78명 (CJLP Group: n = 39명, 남자 17명, 여자 22명, 나이 25.38 ± 0.72; Placebo Group: n = 39명, 남자 26명, 여자 13명, 나이 24.62 ± 0.59)의 동의를 얻은 후 본 연구를 진행하였다.
데이터처리
- 0주를 기준으로 각 군의 피부 산도 및 유리아미노산, 젖산, 유리지방산 함량의 6주차 및 12주차의 변화는 non-paired student’s t-test로 p < 0.05 (*), p < 0.01 (**), p < 0.001 (***) 수준에서 검증하였다.
- 2) p-value for difference from 0 week within CJLP or Placebo groups by student's paired t-test.
- 3) p-value for difference between CJLP and Placebo groups by student's unpaired t-test.
- Differences between CJLP and Placebo groups were evaluated by Student's unpaired t-test (# p < 0.05).
- Differences between CJLP and Placebo groups were evaluated by unpaired Student’s t-test (# p < 0.05).
- 결과는 평균 (mean) ± 표준오차 (standard error; SEM, n = 39/Group)로 나타냈다.
- 군 간의 6주차 및 12주차의 percent change 또는 absolute change는 paired student’s t-test로 p < 0.05 (#) 수준에서 검증하였다.
성능/효과
- 유리지방산은 Phospholipase A2 (PLA2) 효소에 의한 인지질의 가수분해를 통해 생성되고 각질층의 피부 장벽 및 산도에 영향을 미치는 주요 인자로 파악되고 있다 [7]. 0 ~ 12주간의 비교 시, CJLP 군의 총 유리지방산 함량 및 PA와 SA의 개별 유리 지방산이 Placebo 군에 비해 유의적으로 감소하였다. 여드름 환자의 표피에서 중성지방 (triglyceride; TG)의 함량뿐 아니라 SA 및 Palmitoleic acid의 함량이 감소됨이 보고되어 있으나 [37] 본 연구에서는 김치유산균 섭취 후 총 유리지방산뿐 아니라 표피의 주요 개별 유리지방산으로 파악된 PA와 SA의 함량이 감소되는 것으로 파악되었다.
- 개별 유리지방산의 함량 분석 결과 Palmitic acid (PA) (C16:0) > Stearic acid (SA) (C18:0) > Palmitoleic acid (C16:1 n-9) > Oleic acid (C18:1 n-9) 순으로 파악되었는데, CJLP 군의 PA (C16:0) 및 SA (C18:0)은 0주차에 비해 12주차에 유의적으로 감소하였다 (PA: p = 0.026, SA: p = 0.028).
- 05로 0주차에 비해 6주차에 유의적으로 감소하였으나 12주차에는 유의적인 변화가 없었다. 그 결과 군간 비교 시 CJLP 군에서 12주차에 피부 산도가 유의적으로 감소한 것으로 나타났다 (p = 0.025) (Fig. 1). 12주차의 변화를 남녀 구분하여 보았을 경우 남성의 경우 0주차 5.
- 98%로 유의적인 변화가 없었다. 그러나 0 ~ 12주간의 CJLP 군 및 Placebo 군의 총 유리아미노산 함량은 모두 증가하는 양상을 나타내어 군간 비교 시 유의성이 나타나지 않았다 (Table 2).
- 피부 산도가 피부 건강에 미치는 중요성에 비해 관련 소재 연구가 미흡한 실정이나 한 동물실험에서 10주간 자외선 조사와 함께 병행된 1% 수준의 녹차 추출물의 식이 공급은 젖산 및 유리아미노산의 증가와 함께 자외선 조사에 의해 증가된 피부 산도를 정상대조군과 유사한 수준으로 감소시켜 피부 산도를 개선할 수 있는 소재로서의 개발 가능성을 보여주었다 [34]. 본 연구에서는 김치유산균 Lactobacillus plantarum을 12주간 섭취한 CJLP 군에서 피부 산도가 유의적으로 감소되었는데 이 결과는 김치유산균 Lactobacillus plantarum 식이 소재의 섭취에 의해서 산도가 개선될 수 있음을 의미한다.
- 이들 변화에 대한 군간 유의성 파악 결과 CJLP 군에서 12주차에 PA (C16:0) 및 SA (C18:0) 및 총 유리지방산 함량이 Placebo 군에 비해 유의적으로 감소하였다 (Fig. 2).
- CJLP 군에서 12주차에 피부 산도가 대조군에 비해 개선되었다. 표피의 유리아미노산 함량은 대조군에 비해 변화하지 않았으며, 총 유리지방산 및 Stearic acid (C18:0), Palmitic acid (C16:0)의 함량은 감소하였다. 그러나 CJLP 군에서 젖산의 함량은 대조군에 비해 12주차에 유의적으로 증가하였다.
후속연구
- 추후 동물실험을 통해 김치유산균 Lactobacillus plantarum 섭취에 의한 cytokine 및 PKA, PKC의 활성 변화에 대한 연구가 필요한 것으로 여겨진다. 또한 함량이 절대적으로 큰 유리지방산의 감소에도 불구하고 PA의 1/10 수준인 젖산의 함량 증가에 의해 피부 산도가 감소하는지 심도 있는 연구가 필요한 것으로 여겨진다.
- 본 연구에서는 LDH의 mRNA 발현을 파악하지 않았으나 김치유산균 Lactobacillus plantarum의 섭취가 IL-10 과 TNF-α의 분비 변화와 더불어 세포의 PKA와 PKC 경로를 활성화시켜 간접적으로 LDH의 mRNA 전사 및 단백질 발현 증가를 통해 젖산의 생성을 증가시켰을 가능성을 제안한다. 추후 동물실험을 통해 김치유산균 Lactobacillus plantarum 섭취에 의한 cytokine 및 PKA, PKC의 활성 변화에 대한 연구가 필요한 것으로 여겨진다. 또한 함량이 절대적으로 큰 유리지방산의 감소에도 불구하고 PA의 1/10 수준인 젖산의 함량 증가에 의해 피부 산도가 감소하는지 심도 있는 연구가 필요한 것으로 여겨진다.
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