[논문]열처리된 브로콜리 추출물의 항염증 효과

김현경

doi:10.17703/jcct.2019.05.2.397

열처리된 브로콜리 추출물의 항염증 효과
The Anti-inflammatory Effects of Heat-treated Broccoli Extract 원문보기

Journal of the convergence on culture technology : JCCT = 문화기술의 융합, v.5 no.2, 2019년, pp.397 - 404

초록
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본 연구는 인체에 유익한 효능을 지니고 부작용없이 장기간 안전하게 사용할 수 있으며 간보호 및 간기능 개선에 탁월한 효능을 갖는 가열 브로콜리 추출물을 연구하기 위해 수행되었다. 열처리된 브로콜리 추출물은 세포 독성을 나타내지 않으므로 안전하게 사용할 수 있었다. 약제에 의한 간손상 동물모델 (APAP)에서 수행 한 실험에서, 열처리된 양배추 추출물은 간손상 마커인 AST 및 ALT를 효과적으로 감소시킴으로써 간보호 및 간기능 개선 효과를 나타냄을 알 수 있었고, 이는 열처리된 브로콜리 추출물이 간질환을 예방하거나 치료하기 위한 약학적 추출물로서 효과적이라는 것을 시사한다. 특히, 열처리된 브로콜리 추출물은 간손상을 동반한 급성염증 반응에 관여하는 염증 매개체 iNOS 및 COX-2 및 염증 유발성 사이토카인 $IL-1{\beta}$의 발현을 감소시킴으로써 간염 염증을 치료하는데 효과적이라고 할 수 있다.

Abstract ▼ AI-Helper

This study was carried out to investigate the heat-treated broccoli extraction which have a beneficial effect on the human body and which can be used safely for a long period of time without adverse side effects and also have excellent effects of protecting liver and improving liver function. The heat-treated broccoli extract does not show cytotoxicity, and thus can be used safely. In an experiment performed on an animal model with liver injury induced by a drug (APAP), it could be seen that the heat-treated cabbage extract exhibited the effects of protecting liver and improving liver function by effectively reducing AST and ALT which are liver injury markers, indicating that the heat-treated brocoli extract is effective as a pharmaceutical extraction for preventing or treating liver disease. In particular, the heat-treated broccoli extract was effective in treating inflammation of the liver by reducing the expression of the inflammatory mediators iNOS and COX-2 and the proinflammatory cytokine $IL-1{\beta}$, which are involved in acute inflammatory reactions accompanying liver injury.

주제어

표/그림 (7)

표 표 1. RT_PCR에 의한 사이토카인 발현 측정 Table 1. Measurement of cytokine expression by RT-PCR
그림 그림 1. 브로콜리 추출물의 세포독성 (cell Viability) 평가 Figure 1. Cell viability assay in RAW 264.7 cells treated with broccoli extracts.
그림 그림 2. 마우스의 혈청에서 (A) Superoxide Dismutase (SOD), (B) 글루타티온 퍼 옥시 다제 (GPx) 및 (C) 카탈라아제 활성 (CAT) 측정 Figure 2. (A) Superoxide dismutase (SOD), (B) glutathione peroxidase (GPx) and (C) catalase activity (CAT) in the serum of mice. € indicates p < 0.05 as compared to the control group, *** indicates p < 0.001 compared to acetaminophen, and # indicates p < 0.01 as compared to the positive control, NAC.
그림 그림 3. 마우스의 혈청에서 8-Oxo-2'-dexoxyguanosine (8-OHdG) 수준 Figure 3. 8-Oxo-2’-dexoxyguanosine (8-OHdG) levels in the serum of mice. #indicates p < 0.05 as compared to the control group, *** indicates p < 0.001 compared to acetaminophen, and # indicates p < 0.01 as compared to the positive control, NAC.
그림 그림 4. 혈청에서 (A) Alanine aminotransferase (ALT) and (B) aspartate transaminase (AST) 레벨 측정 Figure 4. Figure. 1. (A) Alanine aminotransferase (ALT) and (B) aspartate transaminase (AST) levels in the serum. $ indicates p < 0.05 as compared to the control group, *** indicates p < 0.001 compared to acetaminophen, and # indicates p < 0.01 as compared to the positive control, NAC.
그림 그림 5. 혈청에서 (A) Alanine aminotransferase (ALT) and (B) aspartate transaminase (AST) 레벨 측정 Figure 5. Figure. 1. (A) Alanine aminotransferase (ALT) and (B) aspartate transaminase (AST) levels in the serum. $ indicates p < 0.05 as compared to the control group, *** indicates p < 0.001 compared to acetaminophen, and # indicates p < 0.01 as compared to the positive control, NAC.
그림 그림 6. 간 조직의 Hematoxylin & Eosin 염색 Figure 6.. Hematoxylin & Eosin (H&E) staining of sections of the liver of mice in group (A) control, (B) acetaminophen, (C) NAC, (D) cabbage. Images were taken at a magnification of 400x under a microscope.

AI 본문요약
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문제 정의

또한 레몬의 2배에 해당하는 비타민C를 함유하고 있으며, 베타카로틴, 비타민 B1, 비타민B2, 비타민 E, 칼륨과 칼슘 등을 풍부하게 함유하고 있다. 따라서 본 연구에서는 브로콜리 추출물이 약물(APAP)로 유발된 간손상 동물모델을 대상으로 한 실험에서 간기능 검사의 지표인 AST와 ALT를 효과적으로 감소시키는 간보호 및 간기능 개선 효능을 알아보고자 하였다.
본 연구는 인체에 대한 부수적인 유용한 효과와 함께 부작용 없이 장기간 안전하게 사용할 수 있으면서도 브로콜리의 항염증 활성을 증가시키기 위한 가공공정을 포함하여 의약품이나 화장품 및 식품 분야에 활용할 수 있는 항염증 추출물을 제공하는 것을 목적으로 한다. 본연구 결과는 100～150℃에서 열처리된 브로콜리의 추출물을 유효성분으로 포함하는 염증 질환의 예방 및 치료 추출물에 관한 것이다.
본 연구는 인체에 대한 부수적인 유용한 효과와 함께 부작용 없이 장기간 안전하게 사용할 수 있으면서도 브로콜리의 항염증 활성을 증가시키기 위한 가공공정을 포함하여 의약품이나 화장품 및 식품 분야에 활용할 수 있는 항염증 추출물을 제공하는 것을 목적으로 한다. 본연구 결과는 100～150℃에서 열처리된 브로콜리의 추출물을 유효성분으로 포함하는 염증 질환의 예방 및 치료 추출물에 관한 것이다. 열처리는 브로콜리에 열을 가하는 것으로, 온도가 너무 낮은 경우에는 열처리로 인한 항염증 효능의 증가 효과가 미미하였으며, 온도가 너무 높아 지면 탄화가 일어난다.

제안 방법

7. 간조직에서 Hematoxylin & Eosin (H&E) 간 조직을 안락사 후에 마우스로부터 수확하고 파라핀으로 H & E 염색을 실시하였다.
촉매를 1 : 1000로 희석하여 Superoxide dismutase(SOD) 활성(Cu/Zn, Mn 및FeSOD)을 측정하였다. CATase 활성은 4-amino-3-hydrazino-5-mercapto-1,2,4-triazole (Purpald) 및 Glutathione peroxidase(GPx)분석은 glutathione(GSH) 및 oxidized glutathione(GSSG), GPx 글루타티온(GSH)및 산화 된 글루타티온 (GSSG)의 존재 하에서 수행되었고, GPx 활성은 다른 NADPH 수준(1:20의 표본 희석) 흡광도의 차이를 측정하였다.
5 ㎝ 정도의 크기로 절단하여 동결건조하였다. 동결건조된 시료를 10 kg/㎠ 이상의 압력에서도 견딜 수 있도록 고안, 제작된 열처리장치(Jisco, Seoul,Korea)의 내부 구획 용기에 넣고, 외부 구획의 용기에는 물을 넣어 140～150℃에서 6시간 열처리하였다. 상기 장치는 시료는 물에 직접적으로 접촉하지 않으면서, 외부 구획의 용기에 담긴 물로 인하여 직접적인 열전달에 의한 시료의 탄화를 방지할 수 있다.
7 세포는 한국 세포주 은행으로 부터 분양받았으며, 5% fetal bovine serum (FBS)과100IU/mL penicillin과 100㎍/mL streptomycn (P/S)이 첨가된 Dulbecco's Modified Eagle's Medium(DMEM)을 사용하여 37℃, 5% CO2 환경에서 배양하여사용하였다. 분주된 세포에 제조예 또는 비교예에서 제조한 브로콜리 추출물을 125, 250, 500 또는 1,000㎍/㎖의 농도로 가하여 24시간 처리한 후 MTS assay 방법을 이용하여, 세포생존율을 측정하였다[4, 5].
브로콜리 추출물의 항염증 활성을 전염증성 매개체인iNOS및 COX-2와 전염증성 사이토카인(TNF-α, IL-1β 및 IL-6)의발현에 미치는 영향으로 평가하였다.
세포 독성을 측정하기 위해 96 well plate에 RAW 264.7 세포를 5 ×103 cells/100μL의 농도로 분주하였다.
양성대조군과 시료투여군에 마지막으로 시료를 경구투여한 2시간 후 정상군을 제외한 모든 군에 간독성 유발을 위한 APAP를 400 ㎎/㎏의 농도로 정맥투여 하였다. 시료투여 24시간 후 꼬리 정맥을 통해 채혈하고,채취한 혈액으로부터 기질과 효소반응을 이용한 assay kit(Asan Pharm a-nceutical)를 사용하여 혈중ALT와 AST 레벨을 측정하였다[7].
실험기간동안 물과 사료는 자유급 이하였다. 실험군은 6마리씩 정상군(무처리군), 음성대조군(APAP만 처리),양성대조군(APAP+NAC의 처리) 및 시료투여군(APAP+ 브로콜리추출물 처리)으로 나누었다. 양성대조군에는 각각 APAP에 의한 간독성을 치료하는 효과가 있는 것으로 알려진 NAC 75 mg/kg씩을 매일 7일간 경구투여하였으며, 시료투여군에는 Figure 1에서 제조한 열처리된 브로콜리 추출물을 500 mg/kg씩을 경구투여하였다.
양성대조군에는 각각 APAP에 의한 간독성을 치료하는 효과가 있는 것으로 알려진 NAC 75 mg/kg씩을 매일 7일간 경구투여하였으며, 시료투여군에는 Figure 1에서 제조한 열처리된 브로콜리 추출물을 500 mg/kg씩을 경구투여하였다. 양성대조군과 시료투여군에 마지막으로 시료를 경구투여한 2시간 후 정상군을 제외한 모든 군에 간독성 유발을 위한 APAP를 400 ㎎/㎏의 농도로 정맥투여 하였다. 시료투여 24시간 후 꼬리 정맥을 통해 채혈하고,채취한 혈액으로부터 기질과 효소반응을 이용한 assay kit(Asan Pharm a-nceutical)를 사용하여 혈중ALT와 AST 레벨을 측정하였다[7].
실험군은 6마리씩 정상군(무처리군), 음성대조군(APAP만 처리),양성대조군(APAP+NAC의 처리) 및 시료투여군(APAP+ 브로콜리추출물 처리)으로 나누었다. 양성대조군에는 각각 APAP에 의한 간독성을 치료하는 효과가 있는 것으로 알려진 NAC 75 mg/kg씩을 매일 7일간 경구투여하였으며, 시료투여군에는 Figure 1에서 제조한 열처리된 브로콜리 추출물을 500 mg/kg씩을 경구투여하였다. 양성대조군과 시료투여군에 마지막으로 시료를 경구투여한 2시간 후 정상군을 제외한 모든 군에 간독성 유발을 위한 APAP를 400 ㎎/㎏의 농도로 정맥투여 하였다.
이를 위하여, 6웰플레이트에 RAW 264.7 세포를 5 × 105 cells/100μL의 농도로 분주한 후, 0.1 ㎍/㎖의 LPS를 처리하였다.
LPS 처리 30분 후 브로콜리 추출물(BE) 또는열처리된 브로콜리 추출물(HBE)을 1 ㎎/㎖의 농도로 처리하여 18시간 배양하였다. 이후, TRIzol 시약(Invitrogen)을 이용하여 제조사의 매뉴얼에 따라 RNA를 추출하고, 하기 표 1의 프라이머를 사용하여 qRT-PCR에 의해 전염증성 매개체 및 사이토카인의 발현을 측정하였다. GAPDH는 로딩 컨트롤로 사용하였다[8, 9]
으로 구성되었다. 전체 간 조직을 균질화 완충액 20mL에서 균질화 시킨 다음, 간 중량 대비 10 % 균질 액을 제조 하였다. 4 ℃에서 1,500 rpm, 30 분간 원심 분리 한 후,상등액을 분리하여 추가 분석까지 -80 ℃에서 보관 하였다.
모든 항산화 효소의 활성은 특정 효소 분석 키트를사용하여 분석되었습니다. 촉매를 1 : 1000로 희석하여 Superoxide dismutase(SOD) 활성(Cu/Zn, Mn 및FeSOD)을 측정하였다. CATase 활성은 4-amino-3-hydrazino-5-mercapto-1,2,4-triazole (Purpald) 및 Glutathione peroxidase(GPx)분석은 glutathione(GSH) 및 oxidized glutathione(GSSG), GPx 글루타티온(GSH)및 산화 된 글루타티온 (GSSG)의 존재 하에서 수행되었고, GPx 활성은 다른 NADPH 수준(1:20의 표본 희석) 흡광도의 차이를 측정하였다.

대상 데이터

8-OHdG 측정 및 생화학적 분석을 위해, isoflurane 호흡 마취하에 마우스로부터 혈액 샘플을 수집하고 혈청 튜브에 담근다. 8-OHdG 측정키트(Cayman chemical,Michigan, USA)를 8-OhdG 수준 측정에 사용하였다. 8-OHdG의 함량은 8-OHdG 단일 클론 항체에 대한 8-OhdG 및 AChE enzyme-labeled 8-OHdG의 경쟁에 기초하여 측정 하였다[6].
RAW 264.7 세포는 한국 세포주 은행으로 부터 분양받았으며, 5% fetal bovine serum (FBS)과100IU/mL penicillin과 100㎍/mL streptomycn (P/S)이 첨가된 Dulbecco's Modified Eagle's Medium(DMEM)을 사용하여 37℃, 5% CO2 환경에서 배양하여사용하였다.
브로콜리는 농수산물 시장에서 구입하여 세척한 후 0.5 ㎝× 0.5㎝× 0.5 ㎝ 정도의 크기로 절단하여 동결건조하였다.
생후 6～8 주령된 체중 19~22 g의 웅성 BALB/c 마우스를 동양 바이오테크놀로지(경기도)로부터 구입하여 무특이 병원체 시설에서 일정한 조건(온도:21±2℃, 상대습도: 60±10%, 명암: 12시간 light/dark cycle)으로 일주일간 순화시킨 후 사용하였다.

이론/모형

8-OHdG 측정키트(Cayman chemical,Michigan, USA)를 8-OhdG 수준 측정에 사용하였다. 8-OHdG의 함량은 8-OHdG 단일 클론 항체에 대한 8-OhdG 및 AChE enzyme-labeled 8-OHdG의 경쟁에 기초하여 측정 하였다[6].

성능/효과

Figure. 3에서 볼 수 있듯이, APAP 산화 스트레스 군에 대해 극도로 증가 된 8-OHdG 값은 열처리된 브로콜리 추출물이 APAP 및 양성 대조군인NAC 군과 비교할 때 유의하게 감소하였다. 그림 3.
전염증 매개체인 COX-2나 다른 전염증 사이토카인인IL-6와 TNF-α에 대해서도 열처리하지 않은 브로콜리추출물에 비해 열처리된 브로콜리 추출물의 발현 저해 효과가 더욱 우수하였다. 본 연구결과 열처리된 브로콜리의 추출물은 세포독성을 나타내지 않아 안전하게 사용할 수 있으며, 약물(APAP)에 의해 유발된 급성 간염 동물 모델을 대상으로 한 실험에서 AST와 ALT를 효과적으로 감소시킴을 추가적으로 확인할 수 있었다.
열처리된 브로콜리 추출물은 LPS의 자극에 의해증가된 전염증성 매개체인 iNOS와 COX-2의 발현을 저해하였으며, 생 양배추 추출물보다는 열처리된 양배추 추출물의 저해 효과가 더욱 우수하였다(Figure 5)
열처리는 브로콜리에 열을 가하는 것으로, 온도가 너무 낮은 경우에는 열처리로 인한 항염증 효능의 증가 효과가 미미하였으며, 온도가 너무 높아 지면 탄화가 일어난다. 열처리에 의해 브로콜리는 추출물의 수율이 다소 증가하였으며, 브로콜리 추출물의 경우에는 LPS 자극에 의해 증가된 전염증 매개체인 iNOS의 발현이 44% 수준으로 감소한 것에 비하여, 열처리된 브로콜리 추출물은 24%까지 감소하였다. 전염증사이토카인의 일종인 IL-1β의 발현 역시 브로콜리 추출물에 의해 52%로 감소하였으나, 열처리된 브로콜리 추출물의 처리에 의해서는 24%로 감소하여 열처리에 의해 항염증 활성이 현저하게 증가함을 확인할 수 있었다.
전염증 매개체인 COX-2나 다른 전염증 사이토카인인IL-6와 TNF-α에 대해서도 열처리하지 않은 브로콜리추출물에 비해 열처리된 브로콜리 추출물의 발현 저해 효과가 더욱 우수하였다.
전염증사이토카인의 일종인 IL-1β의 발현 역시 브로콜리 추출물에 의해 52%로 감소하였으나, 열처리된 브로콜리 추출물의 처리에 의해서는 24%로 감소하여 열처리에 의해 항염증 활성이 현저하게 증가함을 확인할 수 있었다.
Figure 4은 각각 혈중 ALT와 AST 레벨의 측정 결과로, 열처리된 브로콜리 추출물은 APAP에 의한 간손상에 효과적임을 확인할 수 있었다 (Figure4). 특히 열처리된 브로콜리 추출물은 AST의 발현에 미치는 영향이 현저하여, 급성 간손상에 더욱 효과적임을 확인할 수 있었다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	비스테로이드계 염증질환제의 문제점은 무엇인가?	염증이나 통증을 조절하는 약물 중 가장 흔히 사용되는 약물인 비스테로이드계 염증질환제(nonsteroidalantiinflammatory drugs, NSAIDs)는 체내에 PG를 생성하는 COX(cyclooxygenase)를 저해함으로써 약리작용을 나타낸다. 그러나 염증 반응에 관여하는 PG류의 생성에 관여하는 COX-2 이외에, COX-1 역시 저해하기 때문에 위장관 장해나 출혈 등의 부작용도 함께 나타나게 된다. 따라서 부작용이 없고 염증관련 유전자 및/또는 관련물질의 활성억제 등을 선택적으로 할 수 있는 새로운 염증예방/치료제의 개발이 요구되고 있다.
	염증 질환의 특징은 무엇인가?	염증 질환은 감염, 외상, 면역학적 반응을 포함한 인체 내의 반응이다. 발열, 홍조, 부종, 통증 등의 급성 염증 증후가 있으며, 염증과정의 후반에는 염증부위로의 백혈구의 이동 및 사이토카인, 분해효소, 생활성 지질 중간체, 일과성 반응성 산소종, 림프구의 생성과 같은 세포 내 변화가 일어난다. 염증반응의 화학매개물중 prostaglandins(PG)과 nitric oxide(NO)는 발암 및 염증의 진행과정에 중요한 매개물질로 알려져 있다.
	NOS는 신체에 어떠한 영향을 미치는가?	이 중 COX-1은 정상상태에서 위장관 점막과 혈소판, 신장에서 세포 보호 작용과 조절 작용에 관여하는PG류 생성에 관여하는 효소인데 반해, COX-2는 정상 세포에서는 그 농도가 매우 낮으나 염증관련세포에서 여러 자극(cytokine, endotoxin, mitogen)에 의해 유도 발현되어 통증이나 염증에 관여하는 PG류 생성에 관여한다. Nitric oxide synthase(NOS)는 혈관의 긴장도(vasculartone), 신경전달(neurotransmission), 세균 및 암세포의 사멸과 항상성 조절에 관여한다. 신경성NOS(Neuronal NOS)와 내피성 NOS(endothelial NOS)는 정상적인 상태에서 존재하는 반면, iNOS(NOStype2)는 LPS, 사이토카인 등에 의해 유도 발현된다.

참고문헌 (9)

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저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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