$\require{mediawiki-texvc}$

연합인증

연합인증 가입 기관의 연구자들은 소속기관의 인증정보(ID와 암호)를 이용해 다른 대학, 연구기관, 서비스 공급자의 다양한 온라인 자원과 연구 데이터를 이용할 수 있습니다.

이는 여행자가 자국에서 발행 받은 여권으로 세계 각국을 자유롭게 여행할 수 있는 것과 같습니다.

연합인증으로 이용이 가능한 서비스는 NTIS, DataON, Edison, Kafe, Webinar 등이 있습니다.

한번의 인증절차만으로 연합인증 가입 서비스에 추가 로그인 없이 이용이 가능합니다.

다만, 연합인증을 위해서는 최초 1회만 인증 절차가 필요합니다. (회원이 아닐 경우 회원 가입이 필요합니다.)

연합인증 절차는 다음과 같습니다.

최초이용시에는
ScienceON에 로그인 → 연합인증 서비스 접속 → 로그인 (본인 확인 또는 회원가입) → 서비스 이용

그 이후에는
ScienceON 로그인 → 연합인증 서비스 접속 → 서비스 이용

연합인증을 활용하시면 KISTI가 제공하는 다양한 서비스를 편리하게 이용하실 수 있습니다.

육회와 육사시미에 접종된 Salmonella Typhimurium와 Listeria monocytogenes 검출을 위한 Loop-mediated isothermal amplification와 식품공전의 배지 시험법, real-time PCR의 검출 성능 비교

Comparison of Loop-mediated Isothermal Amplification and Korea Standard Food Codex (KFSC) Method for Detection of Salmonella Typhimurium, Listeria monocytogenes Artificially Inoculated in Yuk-hwe and Yuk-sashimi

한국식품위생안전성학회지 = Journal of food hygiene and safety, v.34 no.3, 2019년, pp.277 - 282  

곽승해 (국민대학교 식품영양학과) ,  이소영 (국민대학교 식품영양학과) ,  김진희 (국민대학교 식품영양학과) ,  오세욱 (국민대학교 식품영양학과)

초록
AI-Helper 아이콘AI-Helper

본 연구에서는 한국 전통 식품에서 Salmonella Typhimurium와 Listeria monocytogenes의 검출에 대하여 LAMP에 기반한 3M Molecular Detection Assay 2 (3M MDA 2)와 식품공전에 등재된 분리배지, real-time PCR의 검출 성능을 비교하고자 하였다. 육회와 육사시미에 $10^0-10^4CFU/25g$의 수준으로 S. Typhimurium와 L. monocytogenes을 각각 접종하였다. Citrobacter freundii와 Listeria innocua는 S. Typhimurium와 L. monocytogene의 검출에 영향을 주는 균으로 사용하였다. S. Typhimurium와 L. monocytogenes만 $10^0-10^4CFU/25g$ 수준으로 접종한 모든 시료에서는 분리배지, real-time PCR과 LAMP에서 양성으로 검출되었다. C. freundii와 L. innocua를 같이 접종한 경우에서 부분적으로 양성이 나타났다. 육회와 육사시미에 대하여 real-time PCR 보다 3M MDA 2가 더 검출효율이 높음을 알 수 있었다. 분리배지가 가장 검출효율이 높았지만 3M MDA 2와 큰 차이가 없었다. 배지를 사용하는 방법은 최소 일주일의 시간이 소요되고 PCR의 경우 inhibitor의 영향을 많이 받아 정확한 검출이 어려운 점이 있다. 그러나 LAMP에 기반한 3M MDA 2는 enrichment 후 다음 날 간단한 protocol을 통해 25분 이내로 샘플의 양성 반응을 확인할 수 있어 식중독균에 대해 신속하고 정확한 검출이 가능한 것으로 판단되었다.

Abstract AI-Helper 아이콘AI-Helper

The object of this study is to compare the performance of the 3M Molecular Detection Assay 2 (3M MDA 2) and the Korea Standard Food Codex (KSFC) Method (i.e., isolation media and real-time PCR) in detecting Salmonella Typhimurium and Listeria monocytogenes in traditional Korean foods. Yuk-hwe and Yu...

주제어

AI 본문요약
AI-Helper 아이콘 AI-Helper

* AI 자동 식별 결과로 적합하지 않은 문장이 있을 수 있으니, 이용에 유의하시기 바랍니다.

제안 방법

  • L. monocytogenes을 육회와 육사사미에 100–104 CFU/25 g의 농도별로 접종하여 3M MDA 2 – Listeria와 식품공전의 분리배지와 real-time PCR로 검출 실험을 실시하였다(Table 2).
  • Real-time PCR을 위한 반응물의 조성은 SensiFAST Probe Hi-ROX mix (Bioline,London, UK) 13 µL, 400 nM 정방향 및 역방향 primer,100 nM probe와 DNA 주형 2 µL로 구성하여 총 20 µL가되도록 하였다. Real-time PCR은 StepOne Plus real-timePCR systems (Applied Biosystems, Foster, CA, USA)을 이용하여 수행하였다.
  • Real-time PCR을 위한 반응물의 조성은 SensiFAST Probe Hi-ROX mix (Bioline,London, UK) 13 µL, 400 nM 정방향 및 역방향 primer,100 nM probe와 DNA 주형 2 µL로 구성하여 총 20 µL가되도록 하였다.
  • S. Typhimurium, L. monocytogenes가 접종된 시료들은 각각 225 mL의 BPW와 LEB를 넣어 37oC에서 24시간동안 증균배양을 진행하였다. Stomaching한 후에 균질액1 mL을 PrepMan Ultra Sample Preparation Reagent(Applied Biosystems, Foster city, CA, USA)를 이용하여 DNA를 추출하였고, 최종 elution volume을 100 µL로 하였다.
  • S. Typhimurium와 L. monocytogenes을 검출하기 위하여 각각 225 mL의 BPW와 LEB를 넣고 37oC에서 24시간동안 증균배양 시킨 후, 각각의 선택배지인 xylose-lysinedeoxycholate agar (XLD; Oxoid, Hampshire, UK)와 Listeria selective agar base (Oxford formulation, Oxoid, Hampshire,UK)에 도말하여 확인하였다. 도말 후 37oC에서 24시간 배양하고 XLD, Oxford 배지에서 검은색 집락을 분리하여 생화학적 확인시험을 통해 양성유무를 확인하였다.
  • S. Typhimurium을 육회와 육사사미에 농도별로 접종한 후 3M MDA 2 – Salmonella를 이용하여 검출하였으며 성능비교를 위하여 우리나라 식품공전방법 중 분리배지와 real-time PCR로 동시에 분석하였다(Table 1).
  • monocytogenes 균 배양액을 각각 1 mL씩 접종하였다. S. Typhimurium을 접종한 시료에는 225 mL의 buffered peptone water (BPW; Oxoid, Basingstoke, Hampshire,UK)를 넣고 L. monocytogenes을 접종한 시료에는 각각 225 mL의 Listeria enrichment broth (LEB; Oxoid,Basingstoke, Hampshire, UK)와 3M Demi-Fraser broth(3M DFB; 3M Food Safety, St. Paul, MN)를 넣어 30초간 stomaching을 하였다. 결과적으로 S.
  • Paul, MN, USA)를 사용하였다. S.Typhimurium와 L. monocytogenes을 접종한 시료에 각각 225 mL의 BPW와 3M DFB를 넣고 37oC에서 24시간동안증균배양하였다. 제조사의 지침에 따라 접종된 식품 균질액 20 µL를 3M Molecular Detection Assay kits (3M Food Safety, St.
  • Stomaching한 후에 균질액1 mL을 PrepMan Ultra Sample Preparation Reagent(Applied Biosystems, Foster city, CA, USA)를 이용하여 DNA를 추출하였고, 최종 elution volume을 100 µL로 하였다.
  • Typhimurium과L. monocytogenes의 검출에 대하여 식품공전에 등재된 분리배지와 real-time PCR 그리고 LAMP를 이용하여 검출성능을 비교하고자 하였다.
  • 각각 시료 25 g에 S. Typhimurium을 100 CFU/25 g수준으로 접종하고 S. Typhimurium와 유사한 O 항원을 가진 C.freundii를 102 CFU/25 g수준으로 접종하였다. 같은 방법으로 시료 25 g에 L.
  • freundii를 102 CFU/25 g수준으로 접종하였다. 같은 방법으로 시료 25 g에 L. monocytogenes을 100 CFU/25 g수준으로 접종하고 L. innocua를 102 CFU/25 g수준으로 접종하였다. 또한 시료 25 g에 S.
  • 그리고 LAMP (3M MDS 2)방법과 식품공전 상의 분리배지와 real–time PCR을 이용하여 분석하였다.
  • monocytogenes을 검출하기 위하여 각각 225 mL의 BPW와 LEB를 넣고 37oC에서 24시간동안 증균배양 시킨 후, 각각의 선택배지인 xylose-lysinedeoxycholate agar (XLD; Oxoid, Hampshire, UK)와 Listeria selective agar base (Oxford formulation, Oxoid, Hampshire,UK)에 도말하여 확인하였다. 도말 후 37oC에서 24시간 배양하고 XLD, Oxford 배지에서 검은색 집락을 분리하여 생화학적 확인시험을 통해 양성유무를 확인하였다.
  • freundii가 존재할 때 두 가지 균은 유전적으로 유사한 O antigen을 가지므로 6개의 primer가 target region에 붙는 인식 반응이 정확히 이루어지지 않아 3M MDA 2 검출 결과에 영향을 미칠 수 있다. 따라서 S. Typhimurium을 100 CFU/25 g수준으로 접종하고 C. freundii를 102 CFU/25 g수준으로 접종한 후 분리배지,real-time PCR과 3M MDA 2으로 검출하였다. S.
  • monocytogenes보다 높은 수준으로 존재할 때 마찬가지로 6개의 primer가 target region에 붙는 인식 반응이 정확히 이루어지지 않아 3M MDA 2 검출 결과에 영향을 미칠 수 있다. 따라서 시료에 L. monocytogenes을 100 CFU/25 g수준으로 접종하고 L. innocua를 102 CFU/25 g수준으로 접종하여 분리배지, real-time PCR과 3M MDA 2를 이용한 검출실험을 실시하였다. 그 결과 분리배지에서 가장검출이 잘 되었으며 L.
  • 또 식품 균질액을 넣지 않은 lysis 용액 20 µL를 reagent control과 negative control tube에 분주해 양성, 음성 대조구로 설정하였다.
  • innocua를 102 CFU/25 g수준으로 접종하였다. 또한 시료 25 g에 S. Typhimurium와 L. monocytogenes만을 100CFU/25 g으로 접종한 처리구를 대조구로 설정하였으며 분리배지, real-time PCR 및 3M MDA 2를 이용하여 검출하였다. 각각의 처리구들을 10번씩 반복하여 실험하였으며 양성으로 검출된 결과만을 표로 나타내었다.
  • 분리배지와 real-time PCR, LAMP의 검출 한계는 100 CFU/25 g으로 확인하였으므로 S. Typhimurium와 L.monocytogenes와 경쟁적으로 생장하는 균이 있는 상태에서 검출효율을 비교하였다(Table 3). S.
  • 제조사의 지침에 따라 접종된 식품 균질액 20 µL를 3M Molecular Detection Assay kits (3M Food Safety, St. Paul, MN, USA)의 lysis tube에 넣고 100oC에서 15분 동안 열처리 하였다.
  • Stomaching한 후에 균질액1 mL을 PrepMan Ultra Sample Preparation Reagent(Applied Biosystems, Foster city, CA, USA)를 이용하여 DNA를 추출하였고, 최종 elution volume을 100 µL로 하였다. 추출한 DNA는 PCR primer와 반응 온도에 따라 realtime PCR 분석을 진행하였다. Real-time PCR을 위한 반응물의 조성은 SensiFAST Probe Hi-ROX mix (Bioline,London, UK) 13 µL, 400 nM 정방향 및 역방향 primer,100 nM probe와 DNA 주형 2 µL로 구성하여 총 20 µL가되도록 하였다.

대상 데이터

  • 2019년 1월 2회에 걸쳐 육회는 서울시 종로구에 위치한 음식점에서 구매하였고 소고기를 채썰어 양념에 무쳐진 상태에서 실험에 사용하였으며 육사시미는 원료 부위를 성북구 대형마트에서 사서 직접 얇게 저민 후에 사용하였다. 시료에 균을 접종하기 위하여 25 g씩 멸균 비닐백(Whirl-pak, 1930 cm; Nasco, Fort Atkinson, WI, USA)에 넣고 100 –104 CFU/mL수준으로 배양한 S.
  • S. Typhimurium (ATCC 19585), L. monocytogenes(ATCC 7644), Citrobacter freundii (KCTC 2359), L.innocua (KCTC 3586)는 한국미생물자원센터(Korean Collection for Type Cultures, KCTC, Jeollabukdo, Korea)에서 분양 받아 -80oC에서 glycerol stock (v/v)에 보관하여 사용하였다. 모든 균주는 tryptic soy broth (Difco, Franklin Lakes, NJ, USA) 10 mL에 0.

이론/모형

  • Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) 검출 방법으로 3M Molecular Detection Assay 2 (3M MDA 2;3M Food Safety, St. Paul, MN, USA)를 사용하였다. S.
본문요약 정보가 도움이 되었나요?

질의응답

핵심어 질문 논문에서 추출한 답변
Salmonella란 무엇인가? Salmonella spp.는 그람 음성, 통성혐기성 균이며 세균성 식중독의 원인인 대표적인 병원균으로 주로 사람이나 동물의 장에서 서식하여 분변을 통해 식품에 오염된다. Salmonellosis는 Salmonella에 의해 전 세계적으로 가장 빈번하게 발생하는 질환이며 Salmonella를 가진 사람이나 동물, 달걀 등에 의해 다른 식품으로 오염될 수 있다 1).
육회가 식중독 감염 위험이 큰 식품인 이유는? 육회는 소고기를 채를 썰어서 익히지 않고 양념에 무쳐 먹는 음식이고 육회는 소고기를 얇게 저며 익혀 먹지 않는 음식이다. 육회와 육회는 가열처리를 하지 않고 바로 섭취하는 음식이기 때문에 S. Typhimurium과 L. monocytogenes에 의한 식중독의 위험성이 크다.
Salmonella의 신속검출법에는 어떤 방법이 있는가? 신속검출법에는 주형 DNA를 이용한 polymerase chain reaction (PCR) 이 널리 이용되고 있으며, 우리나라 식품공전에도 real-time PCR을 통한 분자생물학적 시험 방법이 등재되어 있다 7). Real-time PCR 법은 기존 conventional PCR 과는 달리 전기영동 과정이 필요하지 않아 DNA 증폭 결과를 실시간으로 컴퓨터에서 확인이 가능하다 8).
질의응답 정보가 도움이 되었나요?

참고문헌 (13)

  1. Oliveira, S. D., Rodenbusch, C. R., Ce, M. C., Rocha, S. L. S., Canal, C. W.: Evaluation of selective and non-selective enrichment PCR procedures for Salmonella detection. Lett. Appl. Microbiol., 36(4), 217-221 (2003). 

  2. Cover, T. L., Aber, R. C.: Medical progress: Yersinia enterocolitica. N. Engl. J. Med., 321(1), 16-24 (1989). 

  3. Donnelly, C. W.: Detection and isolation of Listeria monocytogenes from food samples: implications of sublethal injury. J. AOAC Int., 85(2), 495-500 (2002). 

  4. Ministry of Food and Drug Safety.: Food Code; Available from: http://www.foodsafetykorea.go.kr/foodcode/01_03.jsp?idx378. Accessed Mar. 20, (2019). 

  5. Bohaychuk, V. M., Gensler, G. E., McFall, M. E., King, R. K., Renter, D. G.: A real-time PCR assay for the detection of Salmonella in a wide variety of food and food-animal matrices. J. Food Prot., 70(5), 1080-1087 (2007). 

  6. Peplow, M. O., Correa-Prisant, M., Stebbins, M. E., Jones, F., Davies, P.: Sensitivity, Specificity, and Predictive Values of Three Salmonella Rapid Detection Kits Using Fresh and Frozen Poultry Environmental Samples versus Those of Standard Plating. Appl. Environ. Microbiol., 65(3), 1055-1060 (1999). 

  7. Ministry of Food and Drug Safety.: Food Code; Available from: http://www.foodsafetykorea.go.kr/foodcode/01_03.jsp?idx11046. Accessed Mar. 20, (2019). 

  8. Hein, I., Flekna, G., Krassnig, M., Wagner, M.: Real-time PCR for the detection of Salmonella spp. in food: an alternative approach to a conventional PCR system suggested by the FOOD-PCR project. J. Microbiol. Methods., 66(3), 538-547 (2006). 

  9. Kaneko, H., Kawana, T., Fukushima, E., Suzutani, T.: Tolerance of loop-mediated isothermal amplification to a culture medium and biological substances. J. Biochem. Biophys. Methods., 70(3), 499-501 (2007). 

  10. Cho, A.R., Dong, H.J., Cho, S.B.: Rapid and Sensitive Detection of Salmonella spp. by Using a Loop-Mediated Isothermal Amplification Assay in Duck Carcass Sample. Korean J. Food Sci. Anim. Resour., 33, 655-663 (2013). 

  11. Kocharova, N.A., Knirel, Y.A., Stanislavsky, E. S., Kholodkova, E. V., Lugowski, C., Jachymek, W., Romanowska, E.:Structural and serological studies of lipopolysaccharides of Citrobacter O35 and O38 antigenically related to Salmonella. FEMS Immunol. Medical. Microbiol., 13(1), 1-8 (1996). 

  12. Bang H.J.: 3M Molecular Detection System: Next Day Result Solution for Pathogen Detection. Safe Food, Vol 13. The Korean Society of Food Hygiene and Safety, Korea, pp. 77-81 (2018). 

  13. Besse, N.G., Audinet, N., Kerouanton, A., Colin, P., Kalmokoff, M.: Evolution of Listeria populations in food samples undergoing enrichment culturing. Int. J. Food microbiol., 104(2), 123-134 (2005). 

저자의 다른 논문 :

관련 콘텐츠

오픈액세스(OA) 유형

BRONZE

출판사/학술단체 등이 한시적으로 특별한 프로모션 또는 일정기간 경과 후 접근을 허용하여, 출판사/학술단체 등의 사이트에서 이용 가능한 논문

이 보고서와 함께 이용한 콘텐츠

섹션별 컨텐츠 바로가기

AI-Helper ※ AI-Helper는 오픈소스 모델을 사용합니다.

AI-Helper 아이콘
AI-Helper
안녕하세요, AI-Helper입니다. 좌측 "선택된 텍스트"에서 텍스트를 선택하여 요약, 번역, 용어설명을 실행하세요.
※ AI-Helper는 부적절한 답변을 할 수 있습니다.

선택된 텍스트