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문제 정의
- 본 연구 그룹은 선행 연구에서 안전성이 검증되고 전통된장 풍미를 재현할 수 있는 곰팡이, bacilli, 젖산균, 효모 종균을 개발하였고, 이들 종균은 시험공장 수준에서 된장 발효에 성공적으로 적용한 바 있다[13]. 본 연구에서는 된장 발효용 바로 사용 종균 형태로 개발하기 위해 선행연구에서 검증된 동일한 종균을 사용하였다.
- 본 연구그룹은 안전하고 전통된장 풍미를 갖는 개량형 된장을 생산하기 위해 곰팡이, bacilli, 유산균 및 효모 종균을 개발하고, 이들 종균을 이용하여 시험 공장 규모의 된장 발효공정을 개발한 바 있다[13]. 그러나 종균을 효율적으로 이용하기 위해서는 미생물 배양 시설과 기술이 필요하다.
- oryzae, Bacillus subtilis, Tetragenococcus halophilus 및 Zygosaccharomyces rouxii 등의 종균을 개발하고 이들을 이용한 시험공장(pilot plant) 수준의 된장 생산을 위한 발효 공정을 개발한 바 있다[13]. 본 연구에서는 시험공장 수준에서 검증된 종균을 분말형태의 바로 사용 종균으로 개발하고 이를 적용하여 안전하고 우수한 풍미의 된장 생산의 가능성을 검토하였다.
제안 방법
- Bacillus 건조 종균을 위해서 B. subtilis D119C를 1 × 107 CFU/g 수준으로 콩에 접종 후 1일간 30℃에서 배양 후 80℃에서 24시간 동안 열 건조 및 -80℃에서 동결 후 3일간 동결건조한 후 믹서기를 이용 분말화하였다(Table 2).
- oryzae MJS14를 1 × 106 spore/g 수준으로 콩, 쌀 및 보리에 접종 후 2일 동안 30℃에서 배양한 후 80℃에서 24시간 동안 열 건조하거나 -80℃에서 동결 후 3일간 동결건 조한 후 믹서기를 이용 분말화하였다(Table 1). 각 시료의 포자는 hemocytomer를 이용하여 계수하였다. Bacillus 건조 종균을 위해서 B.
- 각 종균은 건조 분말형태로 개발하였다. 곰팡이 종균을 위해 A.
- 가정이나 영세장류업체에서 바로 사용 종균을 경제적으로 활용하기 위해서는 일정기간 생존율(viability)의 유지가 중요하다. 건조 분발화 된 바로 이용 종균 각각을 상온, 4℃, 및 -20℃에서 저장하면서 저장기간 동안 생존율을 평가하였다. A.
- 곰팡이 바로 이용 종균 개발을 위해 A. oryzae MJS14을 쌀, 보리, 콩 기질에서의 포자 형성능을 비교하였다. 일반적으로 곰팡이는 코오지(koji) 제조를 위해 곡류가 사용되나 된장 발효를 위한 종균이기 때문에 콩 또한 기질로 검토하였다.
- 곰팡이 종균을 위해 A. oryzae MJS14를 1 × 106 spore/g 수준으로 콩, 쌀 및 보리에 접종 후 2일 동안 30℃에서 배양한 후 80℃에서 24시간 동안 열 건조하거나 -80℃에서 동결 후 3일간 동결건 조한 후 믹서기를 이용 분말화하였다(Table 1).
- 바로 사용 종균은 선행연구에서 안전성이 검증된 종균[13] 으로부터 제조되었기 때문에 제조된 된장 또한 안전할 것으로 기대하였다. 다만 T. halophilus가 바이오제닉 아민 생성 능을 보였기 때문에[16], 바로 사용 종균을 이용해 제조된 된장의 바이오제닉 아민 함량을 측정하였다. 시험공장 수준의 선행연구에서와 마찬가지로 모든 시료에서 바이오제닉 아민은 검출되지 않았거나 매우 소량 검출되었다(Table 9).
- 된장 발효는 기존에 개발된 시험공장 공정에 따라 콩알메주 발효와 소금용액에서의 이차발효 두 단계로 진행하였다[13]. 단지 삼각 플라스크 및 비이커를 이용하여 실험실 수준으로 진행하였다. 콩(500 g)을 물에 16시간 동안 침지한 후 121℃에서 8분 동안 증자 하였다.
- halophilus 7BDE22의 경우 동결보호제 (10% dextrin, 10% sorbitol, 20% sodium glutamate) 첨가 후 동결건조 시 83%의 가장 높은 생존율을 보였다(Table 3). 동결 건조 후 믹서기를 이용 분말화 하였다.
- rouxii SMY045는 30% sucrose을 동결보호제로 사용했을 경우 12%의 가장 높은 생존율을 보였다(Table 4). 동결 건조 후 비교적 낮은 생존율이었지만 발효에 충분할 것으로 판단되어 동결 건조 후 분말화 하여 바로 사용 효모 종균으로 사용하였다.
- subtilis D119C는 된장에서 분리한 균주로 높은 수준의 γ-PGA를 생산하는 것으로 알려져 있다[15]. 따라서 경제성을 고려하여 Bacillus 종균 또한 열건조 하였고 믹서기를 이용 분말화 하였다.
- 세균, 유산균, 효모의 계수는 평판배지를 이용 집락수로 계수하였다. 모든 종균은 상온, 4℃ 및 -20℃에서 24주 동안 저장하면서 처음 4주간은 매주 생존율을 측정하였으며 4주차 이후부터는 4주 단위로 생존율을 측정하여 안정성을 평가하였다.
- 그러나 종균을 효율적으로 이용하기 위해서는 미생물 배양 시설과 기술이 필요하다. 미생물 배양시설이나 전문 인력이 없는 가정이나 영세 장류업체에서 쉽게 사용할 수 있는 형태의 종균으로 개발하기 위해 선행연구에서 안전하고 전통풍미를 갖는 된장을 생산하는 것으로 검증된 종균을 바로 사용 종균 형태로 개발하였다.
- 바로 사용 종균을 이용 제조된 된장의 bacilli, 곰팡이 및젖산균의 수는 각각의 선택배지를 이용하여 30℃에서 24시간 동안 배양 후 집락수 계수에 의해 모니터링 하였다[8, 16]. 효모 종균은 hemocytometer를 이용하여 연속 희석 후 직접 계수하였다.
- 발효된 콩알메주를 으깬 후 62 g의 천일염을 첨가하여 수분함량 50% 및 염농도 11%가 되게 한 후 시료에 따라 5.6 g의 T. halophilus 종균 분말(1 × 105 CFU/g) 및/또는 3.8 g의 Z. rouxii 종균 분말(1 × 105 CFU/g)을 첨가한 후 4주 동안 30℃에서 이차발효를 진행하였다.
- 동결 건조 시 낮은 생존율은 동결 과정에서의 균사의 사멸에 기인한 것으로 생각된다. 본 연구에서는 열 건조방법이 경제적이고 우수한 생존율을 보여 열건조 하였고 믹서기를 이용 분말화하였다.
- 회수된 종균에 30 ml의 동결보호제를 첨가 후 동결건조하였으며 사용된 동결보호제는 각각 Table 3, 4와 같다. 세균, 유산균, 효모의 계수는 평판배지를 이용 집락수로 계수하였다. 모든 종균은 상온, 4℃ 및 -20℃에서 24주 동안 저장하면서 처음 4주간은 매주 생존율을 측정하였으며 4주차 이후부터는 4주 단위로 생존율을 측정하여 안정성을 평가하였다.
- 유산균 종균인 T. halophilus 7BDE22는 MRS (3% NaCl, 0.1% biotin 함유) 배지에 접종 후 37℃에서 3일간 배양하였고 효모 종균인 Z. rouxii SMY045는 YPD(10% NaCl 함유)에 접종 후 30℃에서 3일간 배양 후, 각각 30 ml의 배양액을 2,000 ×g, 10분간 원심분리하고 상층액을 제거하였다.
- 증자된 콩에 30 g의 A. oryzae 종균 분말(2 × 107 spore/g)과 0.3 g의 B. subtilis 종균 분말(1 × 106 CFU/g)을 혼합한 후 2일 동안 30℃에 배양하여 콩알메주를 제조하였다.
- 콩알메주에 유산균 및 효모 바로 사용 종균을 이용하여 4종류의 된장을 제조하였다. 천일염만 첨가한 시료(AB), 천일염 및 유산균 종균 분말 첨가 시료(ABT), 천일염 및 효모 종균 분말 첨가 시료(ABZ), 천일염 및 유산균과 효모 종균 동량 첨가 시료(ABTZ)를 4주간 이차 발효 후 제조된 된장의 종균 성장과 물리화학적 특성은 각각 Table 6과 Table 7에 정리하였다. A.
- 바로 사용 종균을 이용 제조된 된장의 bacilli, 곰팡이 및젖산균의 수는 각각의 선택배지를 이용하여 30℃에서 24시간 동안 배양 후 집락수 계수에 의해 모니터링 하였다[8, 16]. 효모 종균은 hemocytometer를 이용하여 연속 희석 후 직접 계수하였다.
대상 데이터
- Aspergillus oryzae MJS14은 전통메주로부터 분리한 곰팡이로 곰팡이독소를 생산하지 않는 균주로서[14], 일반적인 배양을 위해서는 potato dextrose agar (PDA) (Acumedia, Neogen, USA) 배지를 사용하였다. 메주 및 된장에서 콩알메주 및 된장에서의 A. oryzae 수 분석을 위해서는 Dichloran Rose Bengal Chloramphenicol (DRBC) (Acumedia) 배지를 사용하였다. Bacillus subtilis D119C는 전통된장으로부터 분리된 균주로서[15] 단백질 및 전분 분해효소능이 높고 아미노산 탈탄산 효소 능이 낮으며 Bacillus cereus 억제능이 높은 균주로[13] nutrient agar (NA) (Acumedia) 배지에 배양하였다.
- 본 연구 그룹은 선행 연구에서 안전성이 검증되고 전통된장 풍미를 재현할 수 있는 곰팡이, bacilli, 젖산균, 효모 종균을 개발하였고, 이들 종균은 시험공장 수준에서 된장 발효에 성공적으로 적용한 바 있다[13]. 본 연구에서는 된장 발효용 바로 사용 종균 형태로 개발하기 위해 선행연구에서 검증된 동일한 종균을 사용하였다. Aspergillus oryzae MJS14은 전통메주로부터 분리한 곰팡이로 곰팡이독소를 생산하지 않는 균주로서[14], 일반적인 배양을 위해서는 potato dextrose agar (PDA) (Acumedia, Neogen, USA) 배지를 사용하였다.
- 산업체에서 콩알메주는 증자된 으깨지 않은 콩에 특정 종균을 접종하여 제조된다. 본 연구에서도 유사한 방법으로 A. oryzae MJS14와 B. subtilis D119C 바로 사용 종균 분말을 이용해 콩알메주를 제조하였고, 제조된 콩알메주의 특성은 Table 5와 같다. A.
- 관능 평가 또한 시험공장 수준에서 제조된 된장의 평가에 적용된 동일한 방법으로 진행하였다[13]. 시중 된장과 비교하기 위해 C 회사 제품(재래식 콩된장)을 구입하여 관능평가에 포함하였다.
- rouxii 종균 분말(1 × 105 CFU/g)을 첨가한 후 4주 동안 30℃에서 이차발효를 진행하였다. 천일염은 전라남도 신안군에서 제조된 시판 천일염 제품(누리원)을 멸균 후 사용하였다.
- 콩알메주에 유산균 및 효모 바로 사용 종균을 이용하여 4종류의 된장을 제조하였다. 천일염만 첨가한 시료(AB), 천일염 및 유산균 종균 분말 첨가 시료(ABT), 천일염 및 효모 종균 분말 첨가 시료(ABZ), 천일염 및 유산균과 효모 종균 동량 첨가 시료(ABTZ)를 4주간 이차 발효 후 제조된 된장의 종균 성장과 물리화학적 특성은 각각 Table 6과 Table 7에 정리하였다.
- subtilis 종균 분말(1 × 106 CFU/g)을 혼합한 후 2일 동안 30℃에 배양하여 콩알메주를 제조하였다. 콩알메주에 천일염만 첨가한 된장(AB), 천일염 및 T. halophilus 종균 분말 첨가 된장(ABT), 천일염 및 Z. rouxii 종균 분말 첨가 첨가(ABZ), 천일염 및 T. halophilus과 Z. rouxii 종균 동량 첨가 된장 (ABTZ) 등 총 4종류의 된장을 제조하였다. 발효된 콩알메주를 으깬 후 62 g의 천일염을 첨가하여 수분함량 50% 및 염농도 11%가 되게 한 후 시료에 따라 5.
데이터처리
- 관능평가 결과는 ANOVA를 이용하여 분석하였고 Ducan’s multiple range test를 수행하여 다중 비교하였다.
- 모든 분석실험으로 3 반복으로 진행되었으며 데이터는 (평균값 ± 표준편차)로 나타내었다. 관능평가 결과를 제외한 데이터의 p-value는 student t-test를 수행하여 계산되었으며, 0.05 이하의 값이 검출되었을 때 유의적으로 다르다고 정의하였다. 관능평가 결과는 ANOVA를 이용하여 분석하였고 Ducan’s multiple range test를 수행하여 다중 비교하였다.
- 모든 분석실험으로 3 반복으로 진행되었으며 데이터는 (평균값 ± 표준편차)로 나타내었다.
이론/모형
- rouxii (D) were stored at room temperature and at 4℃ or -20℃ for up to 24 weeks. Each starter was enumerated every week for the first 4 weeks and then at every 4 weeks for the rest of the storage period using the plate-counting method. The values with different letters indicate significant differences (p < 0.
- Protease 및 amylase 효소 활성은 Kum 등의 방법에 따라 수행하였다[17].
- 된장 발효는 기존에 개발된 시험공장 공정에 따라 콩알메주 발효와 소금용액에서의 이차발효 두 단계로 진행하였다[13]. 단지 삼각 플라스크 및 비이커를 이용하여 실험실 수준으로 진행하였다.
성능/효과
- 포자는 모든 기질에서 모두 빠르게 형성되었으며 배양 2일 후 콩에서 약 108 spore/g로 가장 우수하였다(Table 1). 2일간 배양된 콩의 열건조 및 동결건조 후 A. oryzae MJS14의 생존율은 열건조가 98.6%로 동결건조보다 우수하였다 (Table 1). 동결 건조 시 낮은 생존율은 동결 과정에서의 균사의 사멸에 기인한 것으로 생각된다.
- A. oryzae MJS14, B. subtilis D119C 및 T. halophilus 7BDE22 바로 사용 종균은 24주 동안 저장 중 저장온도에 관계없이 91.1% 이상의 높은 생존율이 유지되었다(Fig. 1A−C).
- subtilis D119C 바로 사용 종균 분말을 이용해 콩알메주를 제조하였고, 제조된 콩알메주의 특성은 Table 5와 같다. A. oryzae MJS14와 B. subtilis D119C 수는 각각 106 및 108 CFU/g 수준으로 증가하였다(Table 5). 시험공장 수준의 선행연구의 결과와 비교해서 A.
- Bacilli 종균 분말화를 위해 B. subtilis D119C를 콩에 배양한 결과 1일 배양 후 충분한 성장이 관찰되었다(Table 2). 열건조 및 동결건조 방법에 따른 생존율에는 거의 차이가 없었으며 거의 100%의 생존율을 보였다(Table 2).
- 9%로 보통 메주보다 훨씬 높은 것으로 분석되었는데, 이는 용기로 삼각플라스크를 사용했기 때문으로 생각된다(Table 5). Protease 및 amylase 활성은 각각 135 및 480 U/gIDS으로 측정되어, protease 활성은 시험공장 수준의 선행연구보다 훨씬 낮은 수준으로 amylase 활성은 시험공장 수준의 선행연구보다 높은 수준으로 분석되었다(135 vs 458 U/g IDS for protease, 480 vs 122 U/g IDS for amylase) (Table 5). 낮은 protease 활성은 포자 발아에 따른 성장 지체로 인한 A.
- 이전 연구에 따르면 젖산균의 동결건조 시 동결보호제의 종류에 따라 69−78% 정도의 생존율을 보이는 것으로 알려져 있다[18−20]. T. halophilus 7BDE22의 경우 동결보호제 (10% dextrin, 10% sorbitol, 20% sodium glutamate) 첨가 후 동결건조 시 83%의 가장 높은 생존율을 보였다(Table 3). 동결 건조 후 믹서기를 이용 분말화 하였다.
- 효모의의 경우 동결보호제를 사용해도 일반적으로 비교적 낮은 생존율(9−12%)을 보인다[21−23]. Z. rouxii SMY045는 30% sucrose을 동결보호제로 사용했을 경우 12%의 가장 높은 생존율을 보였다(Table 4). 동결 건조 후 비교적 낮은 생존율이었지만 발효에 충분할 것으로 판단되어 동결 건조 후 분말화 하여 바로 사용 효모 종균으로 사용하였다.
- halophilus 사용 된장(ABT 시료)에서 비교적 높게 나타나 발효 및 숙성이 더 진행 되었음을 알 수 있었다(Table 7). 대부분의 아마노산 함량이 상업용 전통된장보다는 높게 측정되었으며, 특히 glutamate 함량이 젖산균 첨가 발효 된장에서 매우 높게 나타났다(Fig. 2). Glutamate는 감칠맛의 주요성분으로 소비자 선호도에 중요한 아미노산이다[28, 29].
- 된장의 숙성 지표인 아미노태 질소 함량은 시료 별로 유사하였지만 T. halophilus 사용 된장 (ABT 시료)에서 약간 높게 나타났는데(Table 7), 이는 이차 발효 시 T. halophilus에 의한 단백질 또는 펩타이드 분해가 더 진행됐음을 알 수 있다.
- ABT 및 ABTZ 시료에서의 높은 단맛 및 감칠맛은 유산균의 발효작용에 따른 높은 유리아미노산 및 glutamate 함량에 기인한 것으로 판단된다. 따라서 바로 사용 종균을 이용하여 제조된 시료에서의 미생물 군집 및 이화학적 특성 분석 결과로 볼 때 이차발효 동안 효모보다는 유산균이 발효 및 풍미형성에 더 큰 영향을 미칠 것으로 판단된다. 이차발효 기간 동안 유산균의 성장과 발효는 적용된 이차 발효공정을 밀봉된 상태의 혐기적 발효에 기인한 것으로 보인다.
- 바로 사용 종균을 이용하여 제조된 된장시료의 관능평가 결과는 Table 8에 나타내었다. 모든 시료는 시판 상업된장보다는 높은 선호도 평가를 받았으며, 특히 유산균 바로 사용 종균을 사용한 ABT 및 ABTZ 시료에서 높은 선호도를 보였다. ABT 및 ABTZ 시료에서의 높은 단맛 및 감칠맛은 유산균의 발효작용에 따른 높은 유리아미노산 및 glutamate 함량에 기인한 것으로 판단된다.
- 바로 사용 종균 조합에 따른 된장시료의 이화학적 특성은 유사하였고 수분 함량 및 염도는 각각 55% 및 11.5%로 목표로 한 된장이 제조되었다(Table 7). 예상대로 유산균 첨가 시료의 산도가 가장 높고 pH는 낮았는데, 이는 젖산균에 의한 유기산 생성에 기인하는 것으로 기존 연구결과와 일치한다(Table 7) [27].
- halophilus가 바이오제닉 아민 생성 능을 보였기 때문에[16], 바로 사용 종균을 이용해 제조된 된장의 바이오제닉 아민 함량을 측정하였다. 시험공장 수준의 선행연구에서와 마찬가지로 모든 시료에서 바이오제닉 아민은 검출되지 않았거나 매우 소량 검출되었다(Table 9). 따라서 바로 사용 종균을 사용하면 일부 된장에서 문제가 되고 있는 바이오제닉 아민 오염 문제가 없는 된장 제조가 가능할 것으로 생각된다.
- subtilis D119C를 콩에 배양한 결과 1일 배양 후 충분한 성장이 관찰되었다(Table 2). 열건조 및 동결건조 방법에 따른 생존율에는 거의 차이가 없었으며 거의 100%의 생존율을 보였다(Table 2). 일부 시료에서의 건조 후 균수의 증가는 건조 동안 증식에 기인한다기 보다는 건조 전 시료의 계수 시 poly-γ-glutamic acid (γ-PGA) 생산에 따른 점성으로 생긴 희석 시 오차에 기인한 것으로 여겨진다.
- halophilus에 의한 단백질 또는 펩타이드 분해가 더 진행됐음을 알 수 있다. 총 아미노산 함량은 시료간 큰 차이를 보이지 않았으나 유리아미노산의 함량이 T. halophilus 사용 된장(ABT 시료)에서 비교적 높게 나타나 발효 및 숙성이 더 진행 되었음을 알 수 있었다(Table 7). 대부분의 아마노산 함량이 상업용 전통된장보다는 높게 측정되었으며, 특히 glutamate 함량이 젖산균 첨가 발효 된장에서 매우 높게 나타났다(Fig.
- 일반적으로 곰팡이는 코오지(koji) 제조를 위해 곡류가 사용되나 된장 발효를 위한 종균이기 때문에 콩 또한 기질로 검토하였다. 포자는 모든 기질에서 모두 빠르게 형성되었으며 배양 2일 후 콩에서 약 108 spore/g로 가장 우수하였다(Table 1). 2일간 배양된 콩의 열건조 및 동결건조 후 A.
후속연구
- 시험공장 수준의 선행연구에서와 마찬가지로 모든 시료에서 바이오제닉 아민은 검출되지 않았거나 매우 소량 검출되었다(Table 9). 따라서 바로 사용 종균을 사용하면 일부 된장에서 문제가 되고 있는 바이오제닉 아민 오염 문제가 없는 된장 제조가 가능할 것으로 생각된다.
- 1D). 따라서 분말형태의 바로 사용 종균은 생산현장에서 적절히 보관된다면 최소 6개월간 사용될 수 있을 것이다.
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