[논문]생물학작용제 검출 키트 개발 및 성능시험 연구

조혜은

doi:10.9766/kimst.2019.22.4.575

생물학작용제 검출 키트 개발 및 성능시험 연구
Development and Validation Study of Biological Agent Detection Kit 원문보기

韓國軍事科學技術學會誌 = Journal of the KIMST, v.22 no.4, 2019년, pp.575 - 580

조혜은 (국방과학연구소 제4기술연구본부)

Abstract ▼ AI-Helper

In biological warfare, it is important to identify biological agents for proper treatment. We focused on developing a real-time RT-PCR kit that can detect multiple species of biological agents. AccuPower(R) Biothreat Real-Time RT-PCR Kit(v3.0) could detect Bacillus anthracis, Yersinia pestis, Vibrio cholerae, Francisella tularensis, Salmonella typhi, Rickettsia prowazekii, Variola virus, Hantaan virus, Yellow fever virus, Brucella spp., Shigella dysenteriae in a single reaction. The results showed that the kit was verified to be able to detect at least 0.005 ng of nucleotide and 10,000 CFU/ml of bacteria. Therefore, the kit is expected to be used as a rapid and sensitive detection kit for 11 species of biological agents within 2 hours.

주제어

표/그림 (7)

표 Table 1. The target gene of biological agents
표 Table 2. List of reagent components
표 Table 3. Reporter dye of target genes
그림 Fig. 1. Results of the real-time PCR amplification of genomic DNA(0.1 ng/μℓ)
표 Table 4. The Ct value of genomic DNA amplification
그림 Fig. 2. Results of the real-time PCR amplification of dead cells(1×10⁶ CFU/ml)
표 Table 5. The Ct value of dead cells amplification

AI 본문요약
AI-Helper

* AI 자동 식별 결과로 적합하지 않은 문장이 있을 수 있으니, 이용에 유의하시기 바랍니다.

문제 정의

본 연구에서는 생물학작용제 및 유사작용제를 사용하여 본 키트에 대한 성능시험을 진행하였다.

제안 방법

AccuPower® Biothreat Real-Time RT-PCR Kit(v3.0)는 생물학작용제 검증용 시약으로 제작한 키트며 세 차례에 걸쳐 성능 개선을 진행하였다. 이 키트는 유전자시료를 사용하여 진단 시험을 하도록 설계 되었으며 각 well에는 IPC DNA/RNA가 들어감으로써 반응이 제대로 일어나는지를 확인할 수 있도록 제작되었다.
개선된 v3.0 키트에 대한 성능 시험을 진행하기 위해 생물학작용제에 대한 유전자 9 종과 사균 4 종을대상으로 성능 검증시험을 진행하였다.

대상 데이터

콜레라균은 고위험 병원체로 분류되는 혈청형 O1,O139에 대하여 구분할 수 있도록 표적 유전자를 구성하였다. 그리고 브루셀라균의 경우 사람에게 감염 가능한 브루셀라균을 검출할 수 있도록 양 브루셀라균(Brucella melitensis)은 IS711, 소 브루셀라균(Brucellaabortus)은 alkB와 IS711, 돼지 브루셀라균(Brucella suis)은 BR0952를 검출할 수 있도록 특이적인 표적 유전자를 사용하였다^[5,6].
생물학작용제 사균에 대한 성능검사를 위하여 탄저균 Sterne 균주의 영양세포 및 포자, 콜레라 O1 균주, 살모넬라균 검체는 121 ℃에서 40 분간 고압멸균을 한 뒤 20 일간 37 ℃에서 배양하여 사멸을 확인한 후 실험에 사용하였다.
성능검사에 필요한 분석시료는 탄저균(Bacillus Anthracis; BA), 콜레라균 O1/O139(Vibrio Cholerae; VC), 야토균(Francisella Tularensis; FT), 살모넬라균(Salmonella Typhi; ST), 리케치아균(Rickeettsia Prowazekii;RP), 백시니아 바이러스(Vaccinia Virus; VACV), 한탄바이러스(Hantaan Virus; HTNV), 브루셀라균(Brucella Melitensis; BM), 이질균(Shigella Dysenteriae; SD)에 대한 genomic DNA를 사용하였다.
추출된 DNA가 아닌 생물학작용제 사균에 대한 검출 성능시험을 위해 탄저균 Sterne 균주의 영양세포 및 포자, 콜레라균(O1균주), 살모넬라균 등의 사균을 사용하였다. 사균는 2×10³(1×10¹ CFU/well), 1×10⁴(5×10¹CFU/well), 2×10⁴(1×10² CFU/well), 1×10⁵(5×10² CFU/well), 2×10⁶(1×10⁴ CFU/well), 1×10⁷(5×10⁴ CFU/well),2×10⁸(1×10⁶ CFU/well), 1×10⁹(5×10⁶ CFU/well) CFU/ml의 8 가지 농도로 희석하여 분석을 진행한 결과2×10⁴ CFU/ml 이하의 농도에서 검출되지 않았으나 그이상의 농도에서는 Ct값이 유의미하게 변하는 것이확인되었다(Table 5, Fig.

데이터처리

실시간 중합효소연쇄반응을 위해 AccuPower®Biothreat Real-Time RT-PCR Kit(v3.0)(Bioneer, SouthKorea)을 사용하였으며, QuantStudio 6 Flex Real-TimePCR system(Applied BioSystems, USA) 장비를 사용하여 실시간 중합효소연쇄반응 및 분석 시험을 실시하였다.

성능/효과

결과적으로 이 키트는 최소 0.005 ng의 유전자 뿐만 아니라 1×10⁴ CFU/ml의 사균부터 검출이 가능한 키트며 유전자와 사균 간 상호 농도별 상관관계도 확인되었다. 다시 말해, 본 키트는 11 종의 생물학작용제 유전자 또는 사균을 2 시간 이내에 동시에 검출 가능하기 때문에, 기존 상용화되어 있는 단일 생물학작용제를 검출할 수 있는 키트와는 차별성이 있다.
5 ng/well), 1(5 ng/well), 10 ng/μℓ(50 ng/well)의 5 가지 농도로 처리하였다. 그 결과 대부분의 생물학작용제 표적 유전자가 검출 되었으며 농도에 따라 유의미하게 Ct(threshold cycle) 값이 변하는 것을 확인하였다. 단, 한탄바이러스의 경우에는 최대 1 ng/μℓ부터 검출이 가능함을 확인하였다.
다시 말해, 본 키트는 11 종의 생물학작용제 유전자 또는 사균을 2 시간 이내에 동시에 검출 가능하기 때문에, 기존 상용화되어 있는 단일 생물학작용제를 검출할 수 있는 키트와는 차별성이 있다. 뿐만 아니라 일부 생물학작용제에 대해서는 유전자가 아닌 사균 자체에 대한 검출도 가능한 것을 확인하였으며,이는 긴급한 상황에서 시료의 전처리 과정 없이 신속하게 분석을 진행할 수 있다는 이점이 있다. 따라서 본 키트는 단일 혹은 혼합 생물학작용제가 의심되는 미지시료의 생물학작용제 식별 및 검증용 키트로 사용될 수 있을 것으로 기대된다.

후속연구

뿐만 아니라 일부 생물학작용제에 대해서는 유전자가 아닌 사균 자체에 대한 검출도 가능한 것을 확인하였으며,이는 긴급한 상황에서 시료의 전처리 과정 없이 신속하게 분석을 진행할 수 있다는 이점이 있다. 따라서 본 키트는 단일 혹은 혼합 생물학작용제가 의심되는 미지시료의 생물학작용제 식별 및 검증용 키트로 사용될 수 있을 것으로 기대된다. 본 키트에 대한 본 키트를 현장에 사용하기 위해서는 휴대가 용이한 분석장비에 적용할 수 있는 시약 및 키트의 개발이 필요하고, 더 나아가 시료전처리과정을 단순화하여 실시간분석에 곧바로 적용할 수 있는 형식의 검출시스템 개발이 필요할 것으로 판단된다.
따라서 본 키트는 단일 혹은 혼합 생물학작용제가 의심되는 미지시료의 생물학작용제 식별 및 검증용 키트로 사용될 수 있을 것으로 기대된다. 본 키트에 대한 본 키트를 현장에 사용하기 위해서는 휴대가 용이한 분석장비에 적용할 수 있는 시약 및 키트의 개발이 필요하고, 더 나아가 시료전처리과정을 단순화하여 실시간분석에 곧바로 적용할 수 있는 형식의 검출시스템 개발이 필요할 것으로 판단된다.
브루셀라균의 경우 본 시험에서는 양 브루셀라균의 DNA를 사용하였으나 소브루셀라균의 특이적 유전자인 alkB와 교차 검출되는 것을 확인하였고, 공통 표적유전자인 IS711은 검출이 되지 않아 추가적인 검증이 필요할 것으로 보인다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	생물학전에서 사용된 생물학 작용제를 빠르게 파악하기 힘든 이유는?	생물학작용제는 인체 내로 유입 후 일정 잠복기를가지는 특징이 있는데 이로 인해 초기감염 시 감염사실을 인지하지 못 하거나 어떤 생물학작용제가 사용되었는지를 확진하기 어려운 문제가 있다[2]. 특히 특이적 증상이 발병하고 난 후에는 치료시기를 놓치는 경우가 많아 완치될 가능성이 매우 낮아진다.
	생물학작용제란?	생물학작용제는 박테리아, 바이러스 또는 독소 등의병원체를 말하는데 무기화되기 용이하고 미량으로도대량살상이 가능한 특성 때문에 역사적으로 생물학전에 사용되기도 하였다. 그러나 생물학작용제의 사용에대한 위험을 인지한 나라들은 1972 년 생물무기금지협약(Biological Weapons Convention)을 체결하였으며 이에 따라 생물무기를 제조, 획득, 보유, 비축, 운송하지 않도록 협약하였다.
	생물학작용제가 생물학전에 사용된 이유는?	생물학작용제는 박테리아, 바이러스 또는 독소 등의병원체를 말하는데 무기화되기 용이하고 미량으로도대량살상이 가능한 특성 때문에 역사적으로 생물학전에 사용되기도 하였다. 그러나 생물학작용제의 사용에대한 위험을 인지한 나라들은 1972 년 생물무기금지협약(Biological Weapons Convention)을 체결하였으며 이에 따라 생물무기를 제조, 획득, 보유, 비축, 운송하지 않도록 협약하였다.

LOADING...

내보내기 구분	파일저장 인쇄 메일전송
구성항목	기본정보 상세정보 관리번호, 논문명, 저널/프로시딩명, 저자 , 발행년, 권, 호, 시작페이지, 끝페이지, 발행기관 관리번호, 논문명, 대등논문명, 저자 , 저널/프로시딩명, 발행기관, 발행년, 발행언어, 권, 호, 시작페이지, 끝페이지, ISBN, ISSN, 주제분야, 키워드, 초록(한글), 초록(영문), 저자(소속기관)
저장형식	Text(ASCII format) Excel format RefWorks Direct Export RIS format (for Reference Manager, ProCite, EndNote), Scholar's Aids, Mendeley
메일정보	받는사람 (필수) @ 보내는사람 (선택) @ 제목 내용 KISTI 검색결과 이메일 서비스
안내	총 건의 자료가 검색되었습니다. 다운받으실 자료의 인덱스를 입력하세요. (1-10,000) 검색결과의 순서대로 최대 10,000건 까지 다운로드가 가능합니다. 데이타가 많을 경우 속도가 느려질 수 있습니다.(최대 2~3분 소요) 다운로드 파일은 UTF-8 형태로 저장됩니다. 파일의 내용이 제대로 보이지 않을실 때는 웹브라우저 상단의 보기 -> 인코딩 -> 자동선택 여부를 확인하십시오. ~ Text(ASCII format) Excel format

연합인증