[논문]와송이 인간 백혈병 세포주 THP-1에서 NF-κB 활성 억제와 p38 활성을 통해 세포사멸과 자가포식에 미치는 영향

주성희; 장은경; 김영철

doi:10.13048/jkm.19015

와송이 인간 백혈병 세포주 THP-1에서 NF-κB 활성 억제와 p38 활성을 통해 세포사멸과 자가포식에 미치는 영향
Effect of Orostachys japonicus on Apoptosis and Autophagy in Human monocytic leukemia Cell line THP-1 via Inhibition of NF-κB and Phosphorylation of p38 MAPK 원문보기

Journal of Korean Medicine = 대한한의학회지, v.40 no.2, 2019년, pp.35 - 50

주성희 (경희대학교 한의과대학 간계내과교실) , 장은경 (경희대학교 한의과대학 간계내과교실) , 김영철 (경희대학교 한의과대학 간계내과교실)

Abstract ▼ AI-Helper

Objectives: Orostachys japonicas (O. japonicus) has been known for its anti-tumor effect. In the present study, it was investigated whether O. japonicus EtOH extracts could induce apoptosis and autophagy which are part of the main mechanism related to anti-tumor effect in THP-1 cells. Methods: Cells were treated with various concentrations of O. japonicus EtOH extracts ($0-300{\mu}g/ml$) for 24, 48, and 72h. Cell viability was evaluated by MTS/PMS assay and apoptosis rate was examined by flow cytometry and ELISA assay. The mRNA expression of apoptosis-related genes (Bcl-2, Mcl-1, Survivin, Bax) and autophagy-related gene (mTOR) was evaluated using real-time PCR. The protein expression of Caspase-3, Akt, LC3 II, Beclin-1, Atg5, $NF-{\kappa}B$, p38, ERK was evaluated using western blot analysis. Results: O. japonicus EtOH extracts inhibited cell proliferation and apoptosis rate was increased in both flow cytometry and ELISA assay. Bcl-2, Mcl-1, Survivin (anti-apoptosis factors) mRNA expressions were decreased and Bax (pro-apoptosis factor) mRNA level was increased. mTOR mRNA expressions was decreased and LC3 II protein expressions was increased. Activation of $NF-{\kappa}B$ was decreased and phosphorylation of p38 was increased. Conclusion: O. japonicus is regarded to inhibit cell proliferation, to induce apoptosis and to regulate autophagy-related genes in THP-1 cells via $NF-{\kappa}B$ and p38 MAPK signaling pathway. This suggests O. japonicus could be an effective herb in treating acute myeloid leukemia.

주제어

AI 본문요약
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문제 정의

본 연구에서는 세포자멸과 더불어 자가포식과 관련한 인자들의 mRNA 및 단백질 발현량을 살펴보았다. mTOR (mammalian target of rapamycin)는 주로 영양 상태, 성장 인자(growth factor), stress에 대한 반응으로 세포 성장과 자가포식 사이의 균형을 조절하는 중요한 역할을 하는 물질로 mTOR가 억제되면 세포에서 자가포식이 유도되는 방향으로 반응이 진행된다²⁶⁾.
본 연구에서는 와송 에탄올 추출물이 인간 단핵구 백혈병 세포(THP-1)에서 세포자멸 및 자가포식에 미치는 영향을 알아보고자 하였다. 분자생물학적 기전을 살펴보고자 MTS/PMS assay, 유동세포 분석, 효소면역 분석, real-time PCR, Western Blot을 시행하였고 다음과 같은 결과를 얻었다.
의 논문을 포함하여 와송과 세포자멸의 연관성에 대한 연구는 다수였으나 와송과 자가포식의 연관성을 살핀 연구는 부재하였다. 본 연구에서는 와송의 항암효과를 살펴보기 위해 급성 골수성 백혈병 환자의 혈액으로부터 배양된 인간 단핵구 백혈병 세포주(THP-1)에 와송 에탄올 추출물을 처리하여 세포자멸과 더불어 자가포식과 관련한 인자들을 살펴보았다.
본 연구에서는 인간 단핵구 백혈병 세포(THP-1)에 와송 에탄올 추출물을 투여하여 세포자멸과 자가포식에 미치는 영향에 대해 살펴보았다. 가장 먼저 와송 에탄올 추출물을 농도별(0-500μg/ml)로 투여하며 THP-1 세포의 생존률을 확인하였다.
용량은 일반적으로 5-15g 정도 사용하며 암 치료를 목적으로 사용할 때는 300g까지 사용하기도 한다⁶⁾. 와송의 항암 효과에 대해서는 지속적으로 연구^7-10)가 이루어지고 있으며 기존 연구를 살펴본 결과, 급성 골수성 백혈병 세포와 세포자멸 및 자가포식과의 연관성을 관찰한 연구는 부재하였기에 본 연구를 시행하였다.

제안 방법

1μg의 Total RNA와 0.5μg의 Random hexamers를 이용하여 Reverse-transcription system (Promega, WI, USA)으로 cDNA를 합성하였다.
300μg/ml 이상의 농도에서 세포 생존률의 뚜렷한 차이를 보이지 않았기 때문에 이후 실험에서 와송 에탄올 추출물의 최고 투여 농도는 300μg/ml으로 설정하였고 농도별 세포 생존률의 차이가 비교적 뚜렸했던 100, 200, 300μg/ml를 실험 농도로 선택하여 실험을 진행하였다.
400μl의 binding 용액을 첨가하여 혼합한 후, 염색된 세포를 FACS Calibur (Becton Dickinson Immunocytometry System, CA, USA)를 이용하여 분석하였다.
Caspase 억제제 처리 후 와송 에탄올 추출물 투여시 세포 생존율에 미치는 영향을 확인하기 위해 pan-caspase 억제제(Z-VAD-FMK) 또는 caspase-3억제제(Z-DEVD-FMK)를 농도별(25, 50, 100μM)로 처리한 후, 2시간 후에 와송 에탄올 추출물 300μg/ml을 투여하였다.
Cell death detection ELISA kit (Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Germany)를 이용하여 세포자멸 세포의 양을 측정하였다. THP-1 세포를 96-well cell culture plate (2×10⁴cells)에 분주하고 100nM의 PMA를 첨가하여 72시간 동안 분화시킨 다음 세포배양액을 제거한 후 200μl의 새로운 배양액으로 3회 세척하였다.
FITC에만 양성반응을 보이는 세포는 초기 세포자멸을 나타내고 FITC와 PI에 모두 양성반응을 보이는 세포는 후기 세포자멸을 나타내므로 이 두 가지 분획에 해당하는 세포 비율의 합으로 세포자멸 정도를 평가하였다.
HPLC (high-performance liquid chromatography)를 통해 성분 분석을 하였으며 HPLC 분석 샘플로 와송 에탄올 추출물을 50mg/ml의 농도로 메탄올에 용해하여 초음파 처리(sonication) 한 후, 0.45μm PVDF membrane filter로 여과시켰다.
Real-time PCR은 StepOnePlus real-time PCR System (Applied Biosystems, CA, USA)을 사용하여 진행하였고 10μl의 2x SYBR green PCR Master Mix (Applied Biosystems, CA, USA), 1μl의 cDNA, 각각 1μl의 primer (sense and antisense) (Bioneer, Daejeon, Korea), 7μl의 증류수를 혼합하여 전체 용량을 20μl로 조절하여 진행하였다. PCR반응은 초기에는 95℃에서 10분 간 초기 변성을 시킨 후, 95℃에서 15초 간, 60℃에서 1분 간, 40주기로 시행하였다. 각 유전자의 mRNA 발현 결과는 β-actin mRNA level을 기준으로 하여 상대적인 값으로 나타내었다.
Real-time PCR은 StepOnePlus real-time PCR System (Applied Biosystems, CA, USA)을 사용하여 진행하였고 10μl의 2x SYBR green PCR Master Mix (Applied Biosystems, CA, USA), 1μl의 cDNA, 각각 1μl의 primer (sense and antisense) (Bioneer, Daejeon, Korea), 7μl의 증류수를 혼합하여 전체 용량을 20μl로 조절하여 진행하였다.
THP-1 세포에 와송 에탄올 추출물을 농도별(0, 100, 200, 300μg/ml)로 처리하여 24, 48, 그리고 72시간 동안 배양하였다.
THP-1 세포에 와송 에탄올 추출물을 농도별(0-500μg/ml)로 처리하여 24, 48, 그리고 72 시간 동안 배양하였다.
THP-1세포에 Caspase 억제제를 농도별(25, 50, 100μM)로 처리하고 2시간 후에 와송 에탄올 추출물 300μg/ml을 투여하였으며 72시간 경과 후 MTS/PMS assay를 통해 세포 생존율을 확인하였다.
가장 먼저 와송 에탄올 추출물을 농도별(0-500μg/ml)로 투여하며 THP-1 세포의 생존률을 확인하였다.
다음으로 100μl의 와송 에탄올 추출물(0, 100, 200, 300μg/ml)을 처리하여 24, 48, 그리고 72시간 동안 배양하였다.
다음으로 100μl의 와송 에탄올 추출물(0~500μg/ml)을 넣고 24, 48, 그리고 72시간 동안 배양한 후 20μl의 MTS/PMS 용액을 첨가하였고 4시간 동안 반응시킨 후 ELISA reader를 이용하여 490nm에서 흡광도를 측정하였다.
다음으로 Annexin V-FITC와 PI의 염색을 통한 유동세포 분석으로 초기 및 후기 세포자멸을 관찰하였다. Figure 2에 초기 및 후기 세포자멸 정도를 백분율로 표시하였는데 Annexin-V(+), PI(-)는 초기 세포자멸 세포를 의미하고 Annexin-V(+), PI(+)는 후기 세포자멸 세포를 의미한다.
다음으로 THP-1 세포에 와송 에탄올 추출물 투여시 발생한 세포자멸과 Caspase의 연관성을 확인하고자 Caspase 억제제 처리 후 와송 에탄올 추출물을 투여하였을 때의 세포 생존율을 관찰하였다. THP-1세포에 Caspase 억제제를 농도별(25, 50, 100μM)로 처리하고 2시간 후에 와송 에탄올 추출물 300μg/ml을 투여하였으며 72시간 경과 후 MTS/PMS assay를 통해 세포 생존율을 확인하였다.
와송 100 g을 80% 에탄올 1000 ml에 넣고 2시간씩 2회 환류추출한 후 추출액을 Whatmann Paper를 통해 여과시킨 후 감압농축기를 사용해서 농축하였다. 다음으로 농축액을 동결건조기(EYELA, Tokyo, Japan)를 이용하여 건조시켰으며 총 6.5g의 건조추출물을 얻었다(수율 6.5%). 얻어진 추출물을 RPMI-1640 배지에 10mg/ml의 농도로 녹여서 100℃에서 1시간 동안 끓인 다음 14,000g에서 30분간 원침한 후 상청액을 0.
다음으로 와송 에탄올 추출물(0, 100, 200, 300μg/ml)을 투여하여 24, 48, 그리고 72 시간 동안 배양하였다.
다음으로 와송 에탄올 추출물(0, 100, 200, 300μg/ml)을 투여하여 24, 48, 그리고 72시간 동안 배양하였다.
다음으로 TBS-T로 15분간 3회 세척하였다. 단백질 발현은 Amersham ECL (Enhanced Chemiluminescence) Prime reagent (GE Healthcare Life Sciences, UK)를 사용하여 검출하였고 단백질 발현의 분석에는 Amersham 600 (GE Healthcare Life Sciences, UK)을 이용하였다. 단백질 band의 intensity는 ImaJ program (NIH, USA)을 사용하여 측정하였다.
얼음에 10분간 둔 다음 13,000xg에서 10분 동안 원심 분리하여 상층액을 얻은 뒤 단백질을 분리하였다. 단백질 정량분석을 위해 Pierce BCA Protein Assay Kit를 이용하였다. 10μg의 단백질을 sample buffer (100mM DTT, 30% glycerol, 0.
또한 THP-1 세포(2×104 cells/well)에 pan-caspase억제제인 Z-VAD-FMK 또는 caspase-3 특이 억제제인 Z-DEVD-FMK (R&D Systems, MN, USA)를 농도별(25, 50, 100μM)로 처리한 후, 2시간 후에 300μg/ml의 와송 에탄올 추출물을 투여하였고 72시간 후에 20μl의 MTS/PMS 용액을 첨가하여 4시간 동안 반응시킨 후 ELISA reader를 이용하여 490nm에서 흡광도를 측정하였다.
마지막으로 본 연구에서도 세포자멸과 자가포식과 관련한 신호 전달 경로를 확인하고자 NF-κB와MAPK의 단백질 발현량을 측정해보았다.
본 연구에서는 와송 에탄올 추출물이 인간 단핵구 백혈병 세포(THP-1)에서 세포자멸 및 자가포식에 미치는 영향을 알아보고자 하였다. 분자생물학적 기전을 살펴보고자 MTS/PMS assay, 유동세포 분석, 효소면역 분석, real-time PCR, Western Blot을 시행하였고 다음과 같은 결과를 얻었다.
세포 배양액을 제거한 후 200μl의 용해완충액을 첨가하여 30분 간 방치하고 200xg에서 10분 간 원심분리 한 후, 20μl의 상층액을 얻은 뒤 제조사의 방법에 따라 ELISA reader를 이용하여 405nm 파장에서 흡광도를 측정하였다.
THP-1 세포에 와송 에탄올 추출물을 농도별(0, 100, 200, 300μg/ml)로 처리하여 24, 48, 그리고 72시간 동안 배양하였다. 세포자멸 세포의 양을 확인하기 위해 효소면역 분석을 시행하였다. 그 결과, 와송 에탄올 추출물을 처리한 THP-1 세포에서 세포자멸 세포의 양이 농도 및 시간에 의존적으로 유의하게 증가하였다[Figure 4].
THP-1 세포에 와송 에탄올 추출물을 농도별(0, 100, 200, 300μg/ml)로 처리하여 24, 48, 그리고 72시간 동안 배양하였다. 세포자멸과 관련한 mRNA유전자 발현 정도를 평가하기 위해 real time PCR를 시행하였다. 그 결과 anti-apoptotic 유전자인 Bcl-2, Mcl-1, Survivin의 mRNA 발현은 감소한 반면 pro-apoptotic 유전자인 Bax의 mRNA 발현은 증가하였다[Figure 5].
; Macherey-Nagel, Dueren, Germany)을 사용하였다. 이동상으로 0.05M NH₄HCO₂ (A)와 메탄올(B)을 이용하였으며 0분에서는 10%로 B용매를 흘리다가 40분에서는 90%가 되도록 직선성의 용매 변화를 주는 gradient mode로 진행하였고 유속은 1ml/min로 하였다. 검출 파장은 280 nm이었다.
이에 이후의 실험을 진행할 때 와송 에탄올 추출물의 최고 투여 농도는 300μg/ml로 설정하였고 농도별 세포 생존률의 차이가 비교적 뚜렸했던 100, 200, 300μg/ml를 실험 농도로 선택하여 실험을 진행하였다.
THP-1 세포에 와송 에탄올 추출물을 농도별(0, 100, 200, 300μg/ml)로 처리하여 24, 48, 그리고 72시간 동안 배양하였다. 자가포식과 관련한 유전자의 mRNA 발현 정도를 평가하기 위해 real time PCR를 시행하였다. 그 결과, mTOR (mammalian target of rapamycin) mRNA의 발현은 농도 및 시간 의존적으로 감소하였다.

대상 데이터

HPLC 분석은 Alliance 2690 기기를 이용하였으며 검출기는 Waters 996 Photodiode Array Detector를 사용하였고 Column은 C18 column (5μm, 4.6mm×250mm I.D.; Macherey-Nagel, Dueren, Germany)을 사용하였다.
45μm PVDF membrane filter로 여과시켰다. Standard로 Epicatechin gallate (ECG), Quercetin과 Kaempferol (Sigma-Aldrich, St. Louis, U.S.A)을 사용하였다[Figure 1A].
세포 배양을 위한 재료로 DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium, High glucose)는 웰진(Welgene, Daegu, Korea)에서 구입하였다. THP-1 세포는 10%의 FBS (Hyclone, Logan, USA)와 1%의 antibiotics(Gibco-BRL, NY, USA)가 첨가된 RPMI-1640 배양액으로 배양하였다. 와송 에탄올 추출물을 투여하기 전에 100nM의 PMA (Phorbol-12-Myristate-13-Acetate) (Sigma-Aldrich, MO, USA)을 첨가하여 72시간 동안 배양하여 대식유사세포(macrophage-like cell)로 분화시켰다.
본 실험에서 사용한 약재인 와송은 대한약전외 한약규격집¹⁷⁾에 근거하여 경희대학교 부속 한방병원에서 구입하여 사용하였다.
세포 배양을 위한 재료로 DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium, High glucose)는 웰진(Welgene, Daegu, Korea)에서 구입하였다.
인간 단핵구 백혈병 세포주(THP-1)은 한국세포주은행(Cancer Research Institute, Seoul National University, Seoul, Korea)으로부터 분양을 받았다. 세포 배양을 위한 재료로 DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium, High glucose)는 웰진(Welgene, Daegu, Korea)에서 구입하였다.

데이터처리

Excel과 Prism program의 Student’s t-test를 이용해 대조군과 실험군의 결과값을 비교하였다.

이론/모형

japonicus EtOH extracts (0-500μg/ml) for 24, 48, and 72 h. Cell viability was evaluated using MTS/PMS assay. The control group was assigned a value of 100%.
THP-1 세포에 와송 에탄올 추출물을 농도별(0, 100, 200, 300μg/ml)로 처리하여 24, 48, 그리고 72시간 동안 배양하였다. Western blot 방법으로 Caspase-3와 Akt의 단백질 발현을 분석하였다. 그 결과, 와송 에탄올 추출물을 처리한 THP-1 세포에서 Caspase-3의 단백질 발현은 증가하였고 Akt 인산화 는 증가하는 양상을 보였으나 농도 및 시간에 따른 일관된 경향성은 없었다[Figure 6].
Western blot 방법으로 NF-κB, p38, ERK의 인산화 정도를 분석하였다.
단백질 발현은 Amersham ECL (Enhanced Chemiluminescence) Prime reagent (GE Healthcare Life Sciences, UK)를 사용하여 검출하였고 단백질 발현의 분석에는 Amersham 600 (GE Healthcare Life Sciences, UK)을 이용하였다. 단백질 band의 intensity는 ImaJ program (NIH, USA)을 사용하여 측정하였다.
세포 생존율(cell viability)를 분석하기 위해 제작사의 방법에 따라 CellTiter 96 AQueous One solution Cell Proliferation assay (MTS/PMS assay) (Promega, WI, USA)를 시행하였다. THP-1 세포를 96-well cell culture plates (2×10⁴ cells/well)에 분주하고 100nM PMA를 첨가하여 72시간 동안 분화시킨 다음 세포배양액을 제거한 후 200μl의 새로운 배양액으로 3회 세척하였다.
THP-1 세포에 와송 에탄올 추출물을 농도별(0, 100, 200, 300μg/ml)로 처리하여 24, 48, 그리고 72시간 동안 배양하였다. 세포자멸 정도를 평가하기 위해 Annexin V-FITC와 PI 염색법을 이용하여 유동세포 분석을 진행하였다. 실험 결과 초기 세포자멸과 후기 세포자멸이 농도 및 시간 의존적으로 증가하였다[Figure 3].
한편 LC3Ⅱ, Beclin-1, Atg5 단백질 발현은 Western blot 방법으로 분석하였다. 그 결과, LC3Ⅱ 단백질 발현량은 유의하게 증가하였고 Beclin-1은 24시간, 200μg/ml과 300μg/ml 그룹 그리고 72시간, 100μg/ml 그룹에서 유의하게 증가하였으며 Atg5 단백질 발현은 300μg/ml 그룹에서 시간 의존적으로 감소하였다[Figure 8].

성능/효과

1. 와송 에탄올 추출물은 MTS/PMS assay 결과, THP-1세포 증식을 억제하였다.
2. 와송 에탄올 추출물은 Annexin V와 PI 염색법을 사용한 유동세포 분석 결과, THP-1 세포의 초기와 후기 세포자멸을 유도하였다.
3. 와송 에탄올 추출물은 효소면역 분석 결과, THP-1세포의 세포자멸을 유도하였다.
4. 세포자멸과 관련한 유전자의 mRNA 발현을 살펴본 결과, Anti-apoptotic 유전자인 Bcl-2, Mcl-1, Survivin mRNA 발현은 감소하였으며 Pro-apoptotic유전자 Bax인 mRNA의 발현은 증가하였다.
5. 와송 에탄올 추출물 투여 시 Western Blot 결과, Caspase-3 단백질 발현은 증가하였으며 Akt의 인산화는 증가하는 양상을 보였으나 농도 및 시간에 따른 일관된 경향성을 보이지 않았다.
6. Caspase inhibitor 처리 후 와송 에탄올 추출물을 투여하였을 때 MTS/PMS assay 결과, 세포 증식이 증가하였다.
7. 자가포식과 관련한 유전자의 mRNA 발현과 단백질 발현을 살펴본 결과, mTOR mRNA의 발현은 감소하였고 LC3 II의 단백질 발현은 증가하였다. Beclin-1 단백질 발현은 일부 그룹에서 증가하였으며 Atg5 단백질 발현은 300μg/ml 그룹에서 시간에 따라 감소하는 경향을 보였다.
Caspase 억제제 처리 후 와송 에탄올 추출물 투여시 세포 생존율에 미치는 영향을 확인하기 위해 pan-caspase 억제제(Z-VAD-FMK) 또는 caspase-3억제제(Z-DEVD-FMK)를 농도별(25, 50, 100μM)로 처리한 후, 2시간 후에 와송 에탄올 추출물 300μg/ml을 투여하였다. 72시간 후에 MTS/PMS assay를 통해 세포 생존율을 확인한 결과, 와송 에탄올 추출물만 투여한 군과 비교하였을 때 caspase 억제제를 처리한 군에서 세포 증식이 증가하였다[Figure 7].
8. 와송 에탄올 추출물 투여 시 Western Blot 결과, NF-κB의 활성은 억제되었고 p38의 인산화는 증가하였다.
Beclin-1 단백질 발현은 일부 그룹에서 증가하였으며 Atg5 단백질 발현은 300μg/ml 그룹에서 시간에 따라 감소하는 경향을 보였다.
THP-1 세포에 와송 에탄올 추출물을 농도별(0-500μg/ml)로 처리하여 24, 48, 그리고 72 시간 동안 배양하였다. MTS/PMS assay를 통해 세포 생존율을 평가하였고 그 결과, 와송 에탄올 추출물은 THP-1 세포의 증식을 억제하였다[Figure 2].
결론적으로 와송 에탄올 추출물이 인간 단핵구 백혈병 세포(THP-1)의 증식을 억제하였으며 세포자멸을 유도하고 자기포식 유전자를 조절을 한다는 것을 알 수 있었다. 또한 이러한 과정에 NF-κB 활성의 억제와 p38 활성이 관여하는 것을 추정해 볼 수 있었다.
세포자멸과 관련한 mRNA유전자 발현 정도를 평가하기 위해 real time PCR를 시행하였다. 그 결과 anti-apoptotic 유전자인 Bcl-2, Mcl-1, Survivin의 mRNA 발현은 감소한 반면 pro-apoptotic 유전자인 Bax의 mRNA 발현은 증가하였다[Figure 5].
THP-1세포에 Caspase 억제제를 농도별(25, 50, 100μM)로 처리하고 2시간 후에 와송 에탄올 추출물 300μg/ml을 투여하였으며 72시간 경과 후 MTS/PMS assay를 통해 세포 생존율을 확인하였다. 그 결과, Caspase억제제의 농도가 증가할수록 세포 생존율이 증가하였으며 이러한 결과는 THP-1 세포에 와송 에탄올 추출물 투여 시 발생한 세포자멸이 Caspase 의존적이었음을 시사한다.
그 결과, LC3Ⅱ 단백질 발현량은 유의하게 증가하였고 Beclin-1은 24시간, 200μg/ml과 300μg/ml 그룹 그리고 72시간, 100μg/ml 그룹에서 유의하게 증가하였으며 Atg5 단백질 발현은 300μg/ml 그룹에서 시간 의존적으로 감소하였다[Figure 8].
그 결과, NF-κB의 인산화는 의미 있게 억제되었고 p38의 인 산화는 의미 있게 증가하였으며 ERK의 인산화는 유의미한 변화를 보이지 않았다[Figure 9, Table 8].
자가포식과 관련한 유전자의 mRNA 발현 정도를 평가하기 위해 real time PCR를 시행하였다. 그 결과, mTOR (mammalian target of rapamycin) mRNA의 발현은 농도 및 시간 의존적으로 감소하였다.
Western blot 방법으로 Caspase-3와 Akt의 단백질 발현을 분석하였다. 그 결과, 와송 에탄올 추출물을 처리한 THP-1 세포에서 Caspase-3의 단백질 발현은 증가하였고 Akt 인산화 는 증가하는 양상을 보였으나 농도 및 시간에 따른 일관된 경향성은 없었다[Figure 6].
세포자멸 세포의 양을 확인하기 위해 효소면역 분석을 시행하였다. 그 결과, 와송 에탄올 추출물을 처리한 THP-1 세포에서 세포자멸 세포의 양이 농도 및 시간에 의존적으로 유의하게 증가하였다[Figure 4].
본 연구와 유사한 연구로 삼소음을 인간 위암 세포(AGS cell)와 피부암 세포 (B16F10 cell)에 투여하였을 때 세포자멸과 자가포식에 미치는 영향에 대해 관찰한 결과, Bcl-2의 하향 조절 및 Bax의 상향조절이 일어났고 Beclin-1과 LC3Ⅱ의 단백질 발현이 증가하였으며 이와 같은 반응은 AMPK 활성화를 통한 Akt/mTOR 신호 전달 경로의 억제를 통해 나타났음을 확인하였다³⁰⁾.
LC3 (Microtubule-associated protein 1A/1B-light chain 3)는 포유류의 조직과 세포에 존재하는 용해성 단백질로 LC3Ⅰ은 자가포식 과정에서 포스파디딜에틸올아민(phosphatidylethanolamine)과 결합한 LC3Ⅱ (LC3-phosphatidylethanolamine conjugate)로 바뀌며 자가포식소체(autophagosome)의 막 형성에 관여한다²⁷⁾. 실험 결과, mTOR mRNA발현량은 농도와 시간 의존적으로 감소하고 LC3Ⅱ단백질 발현량은 의미 있게 증가하였으며 이러한 결과를 통해 와송 에탄올 추출물을 투여한 THP-1 세포에서 자가포식이 유도되었음을 추정해 볼 수 있다.
. 실험 결과, 와송 에탄올 추출물을 투여한 THP-1 세포에서 p38의 인산화가 증가하였고 ERK의 유의미한 변화는 나타나지 않았다. 이를 통해 THP-1 세포에서 와송 에탄올 추출물이 유도한 세포자멸과 자가 포식에는 p38의 인산화가 관여했음을 추정해 볼 수 있다.
실험 결과, 와송 에탄올 추출물을 투여한THP-1 세포에서 NF-κB 활성이 억제되었고 이는 세포자멸이 유도되는데 도움이 되었으리라 사료된다.
Figure 2에 초기 및 후기 세포자멸 정도를 백분율로 표시하였는데 Annexin-V(+), PI(-)는 초기 세포자멸 세포를 의미하고 Annexin-V(+), PI(+)는 후기 세포자멸 세포를 의미한다. 실험 결과, 초기와 후기 세포자멸 모두 농도 및 시간 의존적으로 증가하였다. 효소면역 분석에서도 THP-1 세포에 와송 에탄올 추출물을 투여하였을 때, 세포자멸이 농도 및 시간 의존적으로 증가한 것을 확인할 수 있었다.
와송 에탄올 추출물 투여 시 THP-1 세포의 생존률이 감소하는 것을 확인하였으며 각 그룹(24시간, 48시간, 72시간)의 300μg/ml 이상 농도에서는 세포 생존률의 뚜렷한 차이를 보이지 않았다.
와송 에탄올 추출물을 투여한 THP-1 세포에서 Beclin-1과 Atg5의 단백질 발현량을 측정한 결과, Beclin-1 단백질 발현량은 농도 및 시간에 따른 유의미한 경향성을 보이지 않았고 Atg5 단백질 발현량은 300μg/ml농도에서 시간 의존적으로 감소하는 경향을 보여 자가포식 유도와는 연관성을 보이지 않았다.
이상의 결과들을 종합해보면 와송 에탄올 추출물은 인간 단핵구 백혈병 세포(THP-1)에서 세포자멸을 유도하고 자기포식 관련 유전자를 조절하였으며 이러한 과정에는 NF-κB의 활성 억제와 p38의 활성이 관여한다는 것을 추정해 볼 수 있다.
실험 결과, 초기와 후기 세포자멸 모두 농도 및 시간 의존적으로 증가하였다. 효소면역 분석에서도 THP-1 세포에 와송 에탄올 추출물을 투여하였을 때, 세포자멸이 농도 및 시간 의존적으로 증가한 것을 확인할 수 있었다. 이러한 결과는 와송이 세포자멸을 유도할 수 있음을 시사한다.

후속연구

본 연구에서는 와송의 항암효과를 살펴보기 위해 세포자멸 및 자가포식과 관련한 일부 인자들을 살펴보았으며 향후 와송과 자가포식의 관련성에 대한 심도 있는 연구가 진행될 필요가 있다고 사료된다. 또한 실험 모델의 확장으로 세포 실험에서 나아가 다수의 동물 실험 모델에서도 와송의 항암 효과를 밝히는 추가적인 연구가 필요할 것으로 사료된다.
와송은 본 연구를 포함하여 기존의 다양한 세포실험을 통해 항암제로서의 가능성이 밝혀져 온 약재이다. 본 연구에서는 와송의 항암효과를 살펴보기 위해 세포자멸 및 자가포식과 관련한 일부 인자들을 살펴보았으며 향후 와송과 자가포식의 관련성에 대한 심도 있는 연구가 진행될 필요가 있다고 사료된다. 또한 실험 모델의 확장으로 세포 실험에서 나아가 다수의 동물 실험 모델에서도 와송의 항암 효과를 밝히는 추가적인 연구가 필요할 것으로 사료된다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	와송의 최근 연구에서 보고된 효과들은 어떤것이 있는가?	Berger)과 동속 식물의 전초로 여름과 가을에 채취하며 약성은 酸, 苦, 凉 하고 항암, 지혈, 해열, 해독, 수렴 작용이 있는 본초이다6). 최근에 와송과 관련한 실험 연구들을 살펴보면 와송의 항암 효과7-10) 뿐만 아니라 항섬유화 효과11), 항염증 효과12), 항산화 효과13) 등이 보고되고 있다.
	와송이란 무엇인가?	와송(Orostachys japonicus, 생약명: Orostachysdis Herba)은 오래된 기와 지붕 혹은 높은 산에 위치한 바위에서 자라나는 다년생 식물로 한국과 중국 등에 분포한다. 돌나물과(Crassulaceae)의 여러해살이풀인 바위솔(Orostachys japonica A. Berger)과 동속 식물의 전초로 여름과 가을에 채취하며 약성은 酸, 苦, 凉 하고 항암, 지혈, 해열, 해독, 수렴 작용이 있는 본초이다6). 최근에 와송과 관련한 실험 연구들을 살펴보면 와송의 항암 효과7-10) 뿐만 아니라 항섬유화 효과11), 항염증 효과12), 항산화 효과13) 등이 보고되고 있다.
	급성 골수성 백혈병의 환자들이 보이는 증상은 어떤것들이 있는가?	급성 골수성 백혈병의 임상증상은 골수, 말초혈액 혹은 드물게는 기타 기관 내에서 미분화된 악성 골수성 세포의 축적으로부터 기인한다. 대부분의 환자들은 백혈구증가증과 더불어 빈혈, 혈소판감소증과 같은 골수부전(bone marrow failure)을 보이며 피로, 식욕부진, 체중감소 등을 호소한다1). 급성 백혈병의 진단은 골수 혹은 말초혈액에서 20% 이상의 모세포(blast)가 존재할 때19) 혹은 모세포의 비율과 상관없이 관련된 임상증상이 있고 골수 외 조직 침투 혹은 관련된 염색체 전좌(translocation) 또는 역위(inversion)가 확인될 때 가능하다20).

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저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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