[논문]추출용매 조건에 따른 비파 잎 추출물의 항산화 활성 및 유효성분의 분석법 밸리데이션

김현희; 허미라; 이송미; 임순호

doi:10.9721/kjfst.2019.51.4.301

추출용매 조건에 따른 비파 잎 추출물의 항산화 활성 및 유효성분의 분석법 밸리데이션
Validation of analytical method and antioxidant properties of Eriobotrya japonica Lindl. Leaf extract according to extraction solvent 원문보기

한국식품과학회지 = Korean journal of food science and technology, v.51 no.4, 2019년, pp.301 - 308

김현희 (동신대학교 제약공학과) , 허미라 (동신대학교 뷰티미용학과) , 이송미 (동신대학교 식품영양학과) , 임순호 (동신대학교 제약공학과)

초록
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본 연구에서는 다양한 생리활성을 가진다고 알려진 비파의 잎과 이에 비하여 연구가 미흡한 비파 어린잎에 대한 항산화 활성 등 생리활성에 대한 과학적 연구 근거를 제공하여 산업적 이용 증대 및 고부가가치 소재 개발을 목적으로 비파 잎 및 비파의 어린잎을 열수, 20% 에탄올, 80% 에탄올 용매를 이용하여 추출, 용매 조건에 따른 추출물의 항산화 활성 및 주요성분의 함량을 비교 분석하였다. 추출물의 수율이 가장 높았던 비파 잎 및 어린잎의 80% 에탄올 추출물 플라보노이드 함량은 2194.7 mg QE/g 및 502.3 mg QE/g으로 장미과 식물과 비교해 보았을 때 높은 함량을 나타내었으며, DPPH radical 소거 활성 및 ABTS radical 소거 활성은 모든 추출물 시료에서 농도 의존적으로 유의성 있는 항산화 활성을 보였고, 비파 잎의 80% 에탄올 추출물에서 DPPH와 ABTS radical 소거 활성 $IC_{50}$ 값이 13.9와 $10.9{\mu}g/mL$로 분석되어 비파 어린잎 보다 항산화 활성이 높게 나타났다. 그리고 비파 잎에 함유되어 있는 페놀성 화합물 중 항산화 효능이 입증된 ellagic acid와 chlorogenic acid 성분의 표준화를 위하여 HPLC-DAD를 이용하여 chlorogenic acid와 ellagic acid의 함량분석 및 분석법에 대한 밸리데이션을 수행하여 유효성을 검증하였다. 이상의 결과 비파 잎 80% 에탄올 추출물은 높은 항산화 활성을 나타내어 비파 잎의 산업적으로 활용 가능성을 확인하였으며, 각종 가공식품 및 건강 기능성 식품 개발가치가 한층 높아질 수 있을 것으로 기대한다.

Abstract ▼ AI-Helper

The antioxidant properties of Eriobotrya japonica leaf extract were investigated using DPPH and ABTS radical scavenging assay. The 80% ethanol extract of leaves ($IC_{50}$ values for DPPH and ABTS were 13.9 and $10.9{\mu}g/mL$, respectively) and young leaves ($IC_{50}$ values for DPPH and ABTS were 20.7 and $17.3{\mu}g/mL$, respectively) showed high radical scavenging activity. Additionally, the quantitative method for estimation of ellagic acid and chlorogenic acid from E. japonica leaves was optimized by HPLC/DAD. This method showed high linearity of the calibration curve with a coefficient of correlation ($R^2$) equal to 0.999. The LOD values for ellagic acid and chlorogenic acid were 2.35 and $0.73{\mu}g/mL$, respectively, whereas LOQ values were 7.13 and $2.22{\mu}g/mL$, respectively. Recovery of the two compounds was 99.7-108.0% with RSD values less than 5.31%. These results suggest that 80% ethanol extract of E. japonica leaves could serve as a potential source of natural antioxidant for us in various industrial applications.

주제어

표/그림 (9)

표 Table 1. Analytical conditions of HPLC for quantification of ellagic acid and chlorogenic acid
표 Table 2. The extraction yield of various solvent extracts obtained from 1,500 g of dry weight E. japonica Lindl.
그림 Fig. 1. DPPH radical scavenging activities of various solvent extracts from E. japonica Lindl. leaf (A) and young leaf (B).
표 Table 3. Total flavonoid contents of various solvent extracts from E. japonica Lindl.
그림 Fig. 2. ABTS radical scavenging activities of various solvent extracts from E. japonica Lindl. leaf (A) and young leaf (B).
표 Table 4. Values of IC₅₀ (μg/mL) for antioxidant activity of various solvent extracts from E. japonica Lindl. leaf, young leaf and L-ascorbic acid
표 Table 5. Linear ranges, LOD, LOQ, contents of ellagic acid and chlorogenic acid in E. japonica Lindl. leaf
표 Table 6. Accuracy of the of ellagic acid and chlorogenic acid in E. japonica Lindl. leaf
표 Table 7. Precision of ellagic acid and chlorogenic acid in E. japonica Lindl. leaf

AI 본문요약
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문제 정의

본 연구에서는 다양한 생리활성을 가진다고 알려진 비파의 잎과 이에 비하여 연구가 미흡한 비파 어린잎에 대한 항산화 활성 등 생리활성에 대한 과학적 연구 근거를 제공하여 산업적 이용증대 및 고부가가치 소재 개발을 목적으로 비파 잎 및 비파의 어린잎을 열수, 20% 에탄올, 80% 에탄올 용매를 이용하여 추출,용매 조건에 따른 추출물의 항산화 활성 및 주요성분의 함량을 비교 분석하였다. 추출물의 수율이 가장 높았던 비파 잎 및 어린잎의 80% 에탄올 추출물 플라보노이드 함량은 2194.
이에 본 연구에서는 비파의 부위별 생리활성을 보았을 때 비파의 잎이 종자, 과육보다 폴리페놀 등의 유용한 화합물을 다량함유하고 있다는 점을 착안하여(Lee 등, 2016b) 비파 잎과 비파 어린잎을 대상으로 수율 증대 및 유용활성물질의 손실을 최소화하는 다양한 추출 조건(열수, 20% 에탄올, 80% 에탄올)에서 invitro 항산화 활성을 비교 평가하고 이를 바탕으로 HPLC를 이용하여 chlorogenic acid와 ellagic acid의 함량분석 및 분석법에 대한 유효성을 검증하는 밸리데이션을 수행함으로써 비파 잎으로부터 HPLC-DAD 방법으로 확립된 chlorogenic acid와 ellagicacid 성분의 품질 규격 및 공정 표준화와 천연 항산화제 개발을 위한 기초정보를 제공하고자 한다.

제안 방법

DPPH 라디칼 소거 활성을 측정하여 시료의 항산화 활성을 측정방법 중 하나며 Blois (1958)의 실험방법을 응용하여 측정하였다. 99.
9 µg/mL로 분석되어 비파 어린잎 보다 항산화 활성이 높게 나타났다. 그리고 비파 잎에 함유되어 있는 페놀성 화합물 중 항산화 효능이 입증된ellagic acid와 chlorogenic acid 성분의 표준화를 위하여 HPLCDAD를 이용하여 chlorogenic acid와 ellagic acid의 함량분석 및 분석법에 대한 밸리데이션을 수행하여 유효성을 검증하였다. 이상의 결과 비파 잎 80% 에탄올 추출물은 높은 항산화 활성을 나타내어 비파 잎의 산업적으로 활용 가능성을 확인하였으며, 각종 가공식품 및 건강 기능성 식품 개발가치가 한층 높아질 수 있을 것으로 기대한다.
비파 잎 시료를 대상으로 항산화 물질 등 손실을 최소화할 수 있는 에탄올 용매 비율에 따른 다양한 추출 조건은 예비 실험을 통하여 열수추출, 20% 에탄올, 80% 에탄올로 선정하였다. 비파 잎과 비파 어린잎을 각각 1.
정확성 및 정밀성-정확성과 정밀성 모두 동일농도의 지표 성분에 대하여 일간(inter-day) 및 일내(intra-day)변동을 알아보기 위해 정확성 및 정밀성 평가를 실시하였다.
추출용매 조건에 따른 비파 잎의 항산화 활성을 검증하기 위하여 비파 잎 및 비파 어린잎을 식품용으로 적합한 열수와 에탄올을 농도별로 20% 에탄올, 80% 에탄올로 추출하였다. 추출물들을 동결건조 시킨 후 고형분 함량을 추출 수율로 계산하였고 추출물의 수율은 Table 2와 같다.
특히, ellagic acid는 benzo[alpha]pyrene에 의해 유발된 발암에 대해 항암활성을 나타내며, chlorogenic acid는 지방대사 및 포도당을 조절할 수 있다고 보고되어지고 있다(Khanduja등, 1999; Naveed 등, 2018). 플라보노이드 함량 및 항산화 활성과 폴리페놀의 상관성을 확인하기 위하여 항산화 활성이 가장 뛰어난 비파 잎 80% 에탄올 추출물에 ellagic acid 및 chlorogenicacid 함량분석을 하였다(Table 5). 비파 잎 80% 에탄올 추출물에ellagic acid 함량은 4.
활성산소종을 제거할 수 있는 항산화제를 찾으려는 연구들이 이루어지고 있으며 식물 추출물의 복잡한 반응으로 인해 수많은 기술이 이용가능하나, 항산화 활성의 단일 절차는 특성화 할 수 없기에 본 연구는 신뢰성을 입증하기 위하여 두 가지의 항산화능 분석법을 사용하여 시료의 항산화 정도를 측정하였다. 다양한 용매로 추출한 비파 잎 및 어린잎의 DPPH radical 소거활성을 농도에 따라 측정한 결과 0.

대상 데이터

본 연구에서 사용된 비파 어린잎은 2016년 3-4월에 채취하고,비파 잎은 6-7월에 수확된 시료로 전남생약농업협동조합 내 비파 과수원에서 (Goheung, Korea)에서 비파 잎을 동정하여 사용하였다. 비파 시료는 신선한 잎을 수세 후 dry oven에서 80°C에서5시간 동안 가열 건조한 잎을 약 직경 1 cm 이하로 전남생약농업협동조합에서 분쇄하여 사용하였다.
본 연구에서 사용된 비파 어린잎은 2016년 3-4월에 채취하고,비파 잎은 6-7월에 수확된 시료로 전남생약농업협동조합 내 비파 과수원에서 (Goheung, Korea)에서 비파 잎을 동정하여 사용하였다. 비파 시료는 신선한 잎을 수세 후 dry oven에서 80°C에서5시간 동안 가열 건조한 잎을 약 직경 1 cm 이하로 전남생약농업협동조합에서 분쇄하여 사용하였다. Folin-Ciocalteu reagent,ABTS (2,2'-azino-bis-3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid), DPPH(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl), tannic acid, quercetin, ellagic acid,L-ascorbic acid 등은 Sigma-Aldrich Co.

데이터처리

본 실험에서 제시된 모든 실험 결과는 3회 반복 측정한 평균값±표준편차(Mean±SD)로 나타내었다. 통계처리는 Statistical Package for the Social Sciences (SPSS, Chicago, IL, Korea)를 이용하여 수행하였으며 각 실험군 간의 통계적 유의성 검정은 일원 배치 분산분석 one-way analysis of variance (ANOVA)을 실시하였으며, 유의성이 있는 경우 사후검증으로 Duncan’s multiple range test를 실시하였다.
본 실험에서 제시된 모든 실험 결과는 3회 반복 측정한 평균값±표준편차(Mean±SD)로 나타내었다. 통계처리는 Statistical Package for the Social Sciences (SPSS, Chicago, IL, Korea)를 이용하여 수행하였으며 각 실험군 간의 통계적 유의성 검정은 일원 배치 분산분석 one-way analysis of variance (ANOVA)을 실시하였으며, 유의성이 있는 경우 사후검증으로 Duncan’s multiple range test를 실시하였다. p<0.

이론/모형

지표 성분에 대한 분석법의 유효성 검증은 의약품 등 분석법의 밸리데이션 가이드라인(KFDA, 2004)에 따라 직선성(linearity),검출한계(limit of detection, LOD), 정량한계(limit of quantitation, LOQ), 정확성(accuracy) 및 정밀성(precision) 등을 판단하여 분석 방법을 검증하였다.
총 플라보노이드 함량분석은 Moreno 등(2000)의 실험방법을 응용하여 측정하였다. 분석을 위해서 각 시료 100 µL을 80% ethanol 990 µL에 희석하고, 100 µL를 취하여 10% aluminum nitrate와 1 M potassium acetate를 함유하는 80% ethanol 4.

성능/효과

본 연구 결과 비파 잎의 추출 수율과 추출물의 항산화성, 유효성분 등을 검토할 때 열수추출물과 80% 에탄올 추출물에서 수율, 플라보노이드 함량, 항산화능(DPPH, ABTS)이 가장 우수하였다. 수율과 항산화성 및 유효성분 함량을 고려한 추출 조건으로 비파 잎을 산업적으로 활용하여 각종 가공식품 및 건강 기능성 식품을 개발하기 위한 좋은 천연 소재로 이용할 수 있을 것으로 판단된다.
본 연구에서는 다양한 생리활성을 가진다고 알려진 비파의 잎과 이에 비하여 연구가 미흡한 비파 어린잎에 대한 항산화 활성 등 생리활성에 대한 과학적 연구 근거를 제공하여 산업적 이용증대 및 고부가가치 소재 개발을 목적으로 비파 잎 및 비파의 어린잎을 열수, 20% 에탄올, 80% 에탄올 용매를 이용하여 추출,용매 조건에 따른 추출물의 항산화 활성 및 주요성분의 함량을 비교 분석하였다. 추출물의 수율이 가장 높았던 비파 잎 및 어린잎의 80% 에탄올 추출물 플라보노이드 함량은 2194.7 mg QE/g 및 502.3 mg QE/g으로 장미과 식물과 비교해 보았을 때 높은 함량을 나타내었으며, DPPH radical 소거 활성 및 ABTS radical 소거 활성은 모든 추출물 시료에서 농도 의존적으로 유의성 있는 항산화 활성을 보였고, 비파 잎의 80% 에탄올 추출물에서 DPPH와 ABTS radical 소거 활성 IC₅₀ 값이 13.9와 10.9 µg/mL로 분석되어 비파 어린잎 보다 항산화 활성이 높게 나타났다. 그리고 비파 잎에 함유되어 있는 페놀성 화합물 중 항산화 효능이 입증된ellagic acid와 chlorogenic acid 성분의 표준화를 위하여 HPLCDAD를 이용하여 chlorogenic acid와 ellagic acid의 함량분석 및 분석법에 대한 밸리데이션을 수행하여 유효성을 검증하였다.

후속연구

본 연구 결과 비파 잎의 추출 수율과 추출물의 항산화성, 유효성분 등을 검토할 때 열수추출물과 80% 에탄올 추출물에서 수율, 플라보노이드 함량, 항산화능(DPPH, ABTS)이 가장 우수하였다. 수율과 항산화성 및 유효성분 함량을 고려한 추출 조건으로 비파 잎을 산업적으로 활용하여 각종 가공식품 및 건강 기능성 식품을 개발하기 위한 좋은 천연 소재로 이용할 수 있을 것으로 판단된다.
그리고 비파 잎에 함유되어 있는 페놀성 화합물 중 항산화 효능이 입증된ellagic acid와 chlorogenic acid 성분의 표준화를 위하여 HPLCDAD를 이용하여 chlorogenic acid와 ellagic acid의 함량분석 및 분석법에 대한 밸리데이션을 수행하여 유효성을 검증하였다. 이상의 결과 비파 잎 80% 에탄올 추출물은 높은 항산화 활성을 나타내어 비파 잎의 산업적으로 활용 가능성을 확인하였으며, 각종 가공식품 및 건강 기능성 식품 개발가치가 한층 높아질 수 있을 것으로 기대한다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	비파(Eriobotrya japonica Lindl.)의 자생지는 어디인가?	)는 장미과(Rosaceae)의 잎으로 긴 원형의 도란형으로 황갈색의 섬모가 덮여있고 광택이 난다(Cho와 Kim, 2013). 중국, 스페인, 일본 등 광범위하게 자라며 우리나라에서는 제주도 경남 및 전남지방 등 온화한 기후조건에 주로 자생하며, 재배뿐 아니라 비파 가공 산업도 활발하게 이루어지고 있다. 또한, 민간요법에서 비파 과실이나 잎은 진해, 거담,구토, 토혈, 이뇨 등에 효과가 있으며 호흡 진정과 갈증 해소에도 효능이 있다고 보고되고 있다(Eom 등, 2009; Lee 등, 2016b; Shin 등, 2012).
	피부 노화는 어떻게 구분되며 해당노화의 원인은 무엇인가?	약용식물에 존재하는 항산화제인 terpenoid, polyphenol, flavonoid 등은 활성산소종에 의한 손상을 예방하여 인체 건강 유지에 중요한 역할을 한다(Shahidi와 Ambigaipalan, 2015). 피부 노화는 생리적 요인들의 기능 감소에 의해 발생하는 내인성 노화(intrinsic aging)와 외인성 노화(extrinsic aging)로 구분할 수 있으며, 가장 큰 영향을 미치는 외인성 노화는 자외선과호흡을 통해 생성되는 활성산소종이 주된 원인이며 이를 제거하는 항산화제는 피부 노화를 예방하고 지연시키는데 효과가 증명되면서 식품, 의학, 미용 등 다양한 분야에서 연구가 활발히 이루어지고 있다(Afaq와 Mukhtar, 2006; Bowden, 2004; Lee, 2014). 인간의 몸에 유해한 활성산소의 형성 및 축적을 억제하는데 butylated hydroxyanisole (BHA), butylated hydroxytoluene(BHT), polyphenol, flavonoid, vitamin C 등의 항산화 물질들이 효과가 있는 것으로 알려져 있다(Bowden, 2004; Das 등, 1999).
	활성산소종(reactive oxygen species, ROS)이란?	그 중 페놀류와 플라보노이드류는 항산화, 항균, 항암, 항염증 등 다양한 생리활성을 나타내는 중요한 성분으로 당뇨병, 고혈압뿐만 아니라 순환기 장애와 피부 노화 등을 억제하는 항산화 기능을 지녀 각종 질환 예방 및 치료에 중요한 역할을 한다(Cicerale 등, 2010). 활성산소종(reactive oxygen species, ROS)은 우리 몸속에서 호흡 과정과 에너지 대사과정에서 생성된 강한 산화력을 가지게 된 물질을 말하며, 우리 몸의 세포와 DNA에 손상을 입혀당뇨, 암과 같은 각종 만성 질환과 피부 노화를 일으키는 물질이다(Lee 등, 2005). 약용식물에 존재하는 항산화제인 terpenoid, polyphenol, flavonoid 등은 활성산소종에 의한 손상을 예방하여 인체 건강 유지에 중요한 역할을 한다(Shahidi와 Ambigaipalan, 2015).

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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