[논문]상황버섯에 의해 활성화된 RAW 264.7 대식세포주 배양액의 인간 전립선암 세포주의 epithelial-mesenchymal transition 조절

강태우; 안현희; 박슬기; 유선녕; 황유림; 김지원; 안순철

doi:10.5352/jls.2019.29.8.904

초록
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전립선암은 전이성 종양 중의 하나로 치료를 위해 호르몬 요법이나 외과 적 거세 방법이 주로 수행되지만 많은 부작용을 나타내었다. 최근 많은 연구자들이 이러한 상황을 해결하기 위해 종양 미세 환경을 연구하고 있으며 그 중 면역 세포, 특히 대식세포는 종양 미세 환경의 중요한 구성요소이다. 정상적인 조건에서 대식세포는 여러 암세포에 대해 약한 종양 살균 활성을 갖으나 $interferon-{\gamma}$ 또는 lipopolysaccharide에 의해 활성화되면, 염증성 사이토카인 및 케모카인을 분비함으로써 암세포를 직접 또는 간접적으로 사멸 시키게 된다. 본 연구에서는, 마우스 대식세포인 RAW 264.7 세포에 Phellinus linteus 추출물을 처리하여 산화질소의 방출과 pro-inflammatory cytokine들을 real-time PCR과 ELISA 방법으로 분석하였다. RAW 264.7의 조정 배지는 48시간 동안 전립선 암세포처리하여 상피간엽세포전이 관련 유전자의 발현을 측정 하였다. 그 때에 mesenchymal 관련 유전자들인 N-cadherin, snail, twist, slug 및 cadherin 11이 감소했을 뿐만 아니라 epithelial 관련 유전자인 E-cadherin은 증가하였다. 또한 암 전이 및 신생 혈관 형성에 관여하는 vimentin, ccl2 및 vegfa가 감소되었는데, 이는 EMT가 암세포의 이동과 침범에 밀접한 관련이 있기 때문이다. 따라서 Phellinus linteu에 의해 자극된 RAW 264.7 세포의 조정 배지는 인간 전립선 암세포주인 PC-3 세포의 이동과 전이를 억제하고 EMT 경로를 조절한다는 것을 나타낸다.

Abstract ▼ AI-Helper

Prostate cancer (PCa) is one of the most metastatic tumor. Although hormone therapy or surgical castration is mostly conducted to treat PCa, it has a lot of side effects. Recently, many researchers have been exploring the tumor microenvironment to remedy these circumstances. Immune cells, especially...

Prostate cancer (PCa) is one of the most metastatic tumor. Although hormone therapy or surgical castration is mostly conducted to treat PCa, it has a lot of side effects. Recently, many researchers have been exploring the tumor microenvironment to remedy these circumstances. Immune cells, especially macrophages, are an important composition of the tumor microenvironment. Under normal conditions, macrophages exhibit mild tumoricidal activity against tumors. However, once activated by interferon gamma or lipopolysaccharides, macrophages can kill cancer cells directly or indirectly by secreting cytokines and chemokines. In this study, murine macrophage RAW 264.7 cells were treated with Phellinus linteus extract. To analyze their pro-inflammatory phenotype, we were used several assays such as a real-time polymerase chain reaction, an enzyme-linked immunosorbent and nitric oxide assay. Prostate cancer cells were treated with the RAW 264.7-conditioned media, which was identified as a pro-inflammatory nature, for 48 h, and the expression of epithelial-mesenchymal transition (EMT)-related genes was determined. Not only N-cadherin, Snail, Twist, Slug, and Cadherin 11, which are mechenchymal-related proteins, were decrease, but epithelial marker of E-cadherin was increased. In addition, the mRNA level of vimentin, ccl2, and vegfa were decreased, as the EMT is closely related to the migration and invasion of cancer cells. In conclusion, the RAW 264.7-conditioned media stimulated with P. linteus extract inhibited migration and invasion and regulated the EMT pathway in human prostate cancer cells.

주제어

표/그림 (7)

표 Table 1. Schematic process for purification of bioactive compounds from Phellinus linteus
표 Table 2. List of human- and mouse-originated primers and antibodies used in this study Mouse origin primers
$Fig. 1. Effects of PLE and its fractions on nitric oxide production in RAW 264.7 cells.$ 그림 Fig. 1. Effects of PLE and its fractions on nitric oxide production in RAW 264.7 cells.
그림 Fig. 2. The production of mRNA and cytokine in RAW 264.7 cells stimulated with PLEP.
그림 Fig. 3. Conditioned media of RAW 264.7 cells stimulated with PLEP does not affect apoptosis in prostate cancer cells.
그림 Fig. 4. Conditioned media of RAW 264.7 cells activated with PLEP suppress EMT process in PC-3 cells.
그림 Fig. 5. Conditioned media of RAW 264.7 cells represses migration, invasion and angiogenesis ability in PC-3 cells.

AI 본문요약
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제안 방법

7 cells stimulated with PLEP. To investigate the anti-cancer activities of PLEP itself and conditioned media of RAW 264.7 cells treated with PLEP, MTT assay was performed (Fig. 3A). As a result, PLEP itself and conditioned media of RAW 264.

대상 데이터

(Tokyo, Japan). Lipopolysaccharide (LPS) and polymyxin B sulfate salt (PB) were purchased from Sigma-Aldrich Co. (St. Louis, MO, USA). Antibodies of Ecadherin, vimentin, and snail-1 were purchased from Cell Signaling Technology (Victoria, BC, Canada), CCL2 from Bio X Cell (BxCell, West Lebanon, NH, USA), β-actin from Santa Cruze Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA).
Phellinus linteus was purchased from Kumwhangbio Co. (Jinju, Korea). Diaion HP-20 was purchased from the Mitsubishi Kasei Co.
The plates were washed with 200 μl of PBS containing 0.1% Tween 20 (PBST).

데이터처리

Unless otherwise stated, the data are expressed as means ± SD. Differences between the three groups were performed using by ANOVA, followed by Tukey-Kramer multiple comparison tests. Results were statistically significant at *p<0.

이론/모형

The cell viability was determined by the colorimetric MTT assay. Prostate cancer PC-3 and DU145 cells were seeded in 48-well plates at a density of 1×10⁴ /well and treated with the conditioned media of RAW 264.

성능/효과

It seemed that PLEP not only regulates the mRNA expression levels but also actually controls to secrete cytokines. Based on these results, it was suggested that PLEP can lead RAW 264.7 cells to tumoricidal phenotype by producing NO and pro-inflammatory cytokines. Also biomarkers of M2 type macrophages, Il-4, and Arginase-1 were examined by RT-PCR.
In conclusion, it was suggested that PLEP induces pro-inflammatory effect of RAW 264.7 cells and its conditioned media has an effect on migration and invasion by inhibiting EMT of PC-3 prostate cancer cells. Although the conditioned media of RAW 264.
To identify whether PLEP also plays a role similar to LPS, EMT-related genes such as E-cadherin, N-cadherin, snail, twist, slug, and cadherin 11 were observed by using RT- PCR (Fig. 4A). The EMT is important developmental program that is activated during cancer metastasis and invasion.

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