[논문]식품 미생물 균총 연구를 위한 최신 마이크로바이옴 분석 기술

권준기; 김선균; 이주훈

doi:10.23093/fsi.2019.52.3.220

식품 미생물 균총 연구를 위한 최신 마이크로바이옴 분석 기술
Recent next-generation sequencing and bioinformatic analysis methods for food microbiome research 원문보기

식품과학과 산업 = Food science and industry, v.52 no.3, 2019년, pp.220 - 228

권준기 (경희대학교 생명과학대학 식품생명공학과) , 김선균 (경희대학교 생명과학대학 식품생명공학과) , 이주훈 (경희대학교 생명과학대학 식품생명공학과)

Abstract ▼ AI-Helper

Rapid development of next-generation sequencing (NGS) technology is available to study microbes in genomic level. This NGS has been widely used in DNA/RNA sequencing for genome sequencing, metagenomics, and transcriptomics. The food microbiology area could be categorized into three groups. Food microbes including probiotics and food-borne pathogens are studied in genomic level using NGS for microbial genomics. While food fermentation or food spoilage are more complicated, their genomic study needs to be done with metagenomics using NGS for compositional analysis. Furthermore, because microbial response in food environments are also important to understand their roles in food fermentation or spoilage, pattern analysis of RNA expression in the specific food microbe is conducted using RNA-Seq. These microbial genomics, metagenomics, and transcriptomics for food fermentation and spoilage would extend our knowledge on effective utilization of fermenting bacteria for health promotion as well as efficient control of food-borne pathogens for food safety.

주제어

AI 본문요약
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제안 방법

454 Roche Pyrosequencing은 처음으로 출시된 NGS 분석 플랫폼이다. Pyrophosphate가 방출될 때 연쇄 반응에 기초한 광 검출로 염기서열을 분석한다. 하지만 현재는 더 이상 사용하지 않는 장비이며, 반응이 느리고, 염기서열의 길이는 비교적 긴편이나 분석할 수 있는 염기서열의 양이 비교적 적다는 단점을 가지고 있다(Ronaghi, 2001).
또한 MiSeq은 메타게놈 분석에 일반적으로 많이 사용하는 분석법이다. 분석 방법은 샘플에서 total DNA를 추출하고 sequencing platform에 맞게 PCR을 이용하여 adapter를 붙여주는 작업을 한다. 이것을 library preparation이라 한다.
ddNTPs는 deoxyribose의 3’ 위치에 수산화기(-OH)가 없고 H기로 치환되어 있어 DNA 중합효소에 의해 DNA가 복제될 때 다음 뉴클레오타이드(nucleotide)와 인산디에스테르 결합(phosphodiester bond)을 형성할 수 없어 DNA 사슬의 합성이 종료된다. 이러한 방법을 이용하여 4가지 염기 각각의 ddATP, ddTTP, ddGTP, ddCTP로 반응을 종결시켜 염기서열을 확인할 수 있다. 따라서 사슬종결법(chain-termination method)이라 한다(Sanger 등, 1977).
이러한 분석은 많은 정보량으로 인해 컴퓨터를 기반으로 하는 생물정보학 프로그램을 이용하여 분석을 하게 된다. 메타게놈 분석의 경우 주로 Qiime, Mothur와 같은 command line을 기반으로 하는 분석 파이프라인 프로그램과 컴퓨터를 잘 이용하지 못하는 생명공학자를 위한 GUI (graphic user interface) 기반의 MG-RAST 프로그램이 있다.
식품 미생물의 NGS분석 활용은 크게 3가지 그룹으로 나눠진다. 프로바이오틱스와 식중독균과 같은 단일 균주의 유전체 연구, 식품 발효 또는 부패 동안의 균주 조성 분석을 위한 메타게놈 연구, 마지막으로 식품환경 에서의 미생물의 발효 또는 부패 기간의 특정 미생물의 반응을 확인하기 위하여 RNA-seq 기술을 기반으로 RNA 발현량 비교 패턴 분석이 있다. 이러한 유전체학, 메타게놈학, 전사체학에서의 NGS 분석 기술은 효과적인 식중독균 조절뿐만 아니라 건강 증진을 위한 발효 식품 미생물의 효과적인 이용에도 널리 이용될 것이다.

성능/효과

프로바이오틱스의 유전체 정보가 확보되어 있을 시에 균주의 안전성은 어느정도 예측이 가능하다. NGS 염기서열 분석을 통해 얻은 염기서열 정보를 활용하여 Virulence Factor DB (VFDB)를 통한 병원성 인자 유무 확인과 Antibiotic Resistance DB (ARDB)를 통한 항생제 내성 유전자의 유무를 확인하여 유전자 단계에서 안전성 평가가 가능하다. 또한 분석된 유전체 염기서열을 바탕으로 기존에 분석된 정보와 비교분석을 통하여 기능성을 예측할 수 있으며, 균주의 대사과정 또한 예측하여 산업적으로 활용 시 대량생산이 가능하다.
Roche가 처음으로 NGS 장비를 출시한 이후 Illumina Solexa, Applied Biosystems 등이 연이어 출시하였다. NGS 장비 출시 전에는 생어 염기서열 분석법을 이용한 장비는 기껏해야 동시에 수십 개의 전기영동이 가능한 반면, NGS 장비는 수십만에서 수십억 개의 서로 다른 염기서열 분석이 가능해졌다. 또한 이러한 기술의 발달로 유전체 분석에 소요되는 시간과 비용까지 점차 절감하고 있다.
미생물은 식품을 발효해서 생기는 대사산물에 의해서 인체 건강에 도움이 되는 물질을 생성하기도 하고 부패를 일으켜 고약한 냄새를 풍기며 인체에 해로운 독소를 생성하기도 한다. 과거 식품에서의 미생물 산업은 생화학적인 특성에만 의존하여 미생물을 식품에 적용하였으나, 분자생물학적 기술의 발달에 따라 생화학적 특성 이외에도 유전자 수준에서의 미생물의 특성을 확인 할 수 있게 되었으며, 더 나아가 차세대 염기 서열 분석(next-generation sequencing, NGS) 기술의 발달에 따라 메타게놈(metagenome) 수준에서의 분석이 가능해지면서, 미생물 하나가 아닌 특정 환경에서 존재하는 미생물 군집, 즉 마이크로바이옴(microbiome) 분석이 가능해졌다. 이러한 마이크로바이옴 분석 기술은 다양한 연구분야에서 활용되고 있으며, 특히 식품 산업에 적용되어 발효식품의 제조나 식중독균의 제어 등에 적용되어 식품산업 발전에 이바지 하고 있으며, 식품 미생물 산업에서 메타게놈 분석 기술은 절대 없어서는 안될 기술로 변모하고 있다.

후속연구

NGS 염기서열 분석을 통해 얻은 염기서열 정보를 활용하여 Virulence Factor DB (VFDB)를 통한 병원성 인자 유무 확인과 Antibiotic Resistance DB (ARDB)를 통한 항생제 내성 유전자의 유무를 확인하여 유전자 단계에서 안전성 평가가 가능하다. 또한 분석된 유전체 염기서열을 바탕으로 기존에 분석된 정보와 비교분석을 통하여 기능성을 예측할 수 있으며, 균주의 대사과정 또한 예측하여 산업적으로 활용 시 대량생산이 가능하다.
메타게놈은 미생물 조성과 군체의 기능은 파악이 가능 하지만 실제로 발현 유무에 대한 파악이 어렵다. 이러한 문제점을 해결하기 위하여 metatranscriptome 연구를 통하여 특정 환경에 존재하는 미생물 군체의 실질적인 발현 수준을 정량화하고 수준이 서로 다른 조건에서 어떻게 변경되는지를 모니터링하는 등 특정 환경 내에서 활성 유전자의 다양성을 연구하는데 사용할 수 있다. 이것의 장점은 미생물 군집의 활성 기능의 차이에 관한 정보를 제공할 수 있다는 것이다.
프로바이오틱스와 식중독균과 같은 단일 균주의 유전체 연구, 식품 발효 또는 부패 동안의 균주 조성 분석을 위한 메타게놈 연구, 마지막으로 식품환경 에서의 미생물의 발효 또는 부패 기간의 특정 미생물의 반응을 확인하기 위하여 RNA-seq 기술을 기반으로 RNA 발현량 비교 패턴 분석이 있다. 이러한 유전체학, 메타게놈학, 전사체학에서의 NGS 분석 기술은 효과적인 식중독균 조절뿐만 아니라 건강 증진을 위한 발효 식품 미생물의 효과적인 이용에도 널리 이용될 것이다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	NGS란?	NGS란 next-generation sequencing의 약자로 차세대 염기서열 분석법을 말한다. 이러한 기술의 발달과 분석 비용의 절감으로 인해 프로바이오틱스 (probiotics) 균주의 기능성 검증, 식중독균 분리 및 동정 시 필요한 유전체 정보 데이터베이스 구축 등과 같은 다양한 연구 분야에서 NGS를 보편적으로 사용하고 있다.
	DNA sequencing는 어떤 분석 방법인가?	차세대 염기서열 분석법(NGS) 이전에 사람의 몸을 구성하는 DNA 서열을 모두 알고자 했던 과학자들은 DNA sequencing 기술을 연구하기 시작했다. DNA sequencing이란 생화학적 방법으로 DNA 사슬을 구성하는 A, T, G, C 염기의 서열을 분석하는 방법이다. 이러한 DNA sequencing은 1977년 영국의 생화학자 프레더릭 생어(Frederick Sanger) 가 최초로 개발한 방법에서 시작되었다.
	ddNTPs은 4가지 염기 각각의 ddATP, ddTTP, ddGTP, ddCTP로 반응을 종결시켜 염기서열을 확인할 수있는데 이러한 특징 떄문에 불리는 명칭은?	이러한 방법을 이용하여 4가지 염기 각각의 ddATP, ddTTP, ddGTP, ddCTP로 반응을 종결시켜 염기서열을 확인할 수 있다. 따라서 사슬종결법(chain-termination method)이라 한다(Sanger 등, 1977). 생어 염기서열 분석법은 오랫동안 검증되어 기술적 신뢰도가 높고 분석 방법이 비교적 간단하다.

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