문제 정의

• 따라서 본 연구에서는 BA 함량이 낮은 치즈 제조에 이용할 발효 스타터를 선발하기 위하여 탈지유와 두유 내에서 유산균의 아미노산 탈탄산 효소 및 항균 물질 생성능과 이에 따른 BA 생성균의 증식과 아민 생성량에 미치는 영향을 비교하였다.
• 본 연구의 목적은 탈지유와 두유 내에서 Enterobacter aerogenes CIH05의 증식과 바이오제닉 아민(biogenic amines, BA) 생성량에 대한 유산균의 영향을 조사하는 것이다. 갓김치로부터 분리된 Lactobacillus acidophilus GK20, Lactobacillus paracasei GK74 및 Lactobacillus planatrum GK81은

  제안 방법

  • 400 nm에서 흡광도를 측정하고 표준곡선으로부터 과산화수소의 함량(μg/ml)을 측정하였다.
  • 0으로 조정한 다음 카탈라아제(1 mg/ml, Sigma-Aldrich)를 처리하였다. 60% (w/v)의 황산암모늄으로 염석 후 투석하여 탈염시켜 조 박테리오신 용액을 조제하였다. Acetonitrite를 가해 최종 5 ml에 맞추어 원심분리(2,500 × g, 5분)하여 얻은 상등액을 0.22 μl syringe filter로 여과 제균한 후 HPLC의 Nova-Pak C18 column (150 × 3.9 mm, Waters)으로 BA의 함량을 측정하였다.
  • High pressure liquid chromatography (HPLC, Shimadzu)의 Nova-Pak C18 column (150 × 3.9 mm, Waters)을 사용하였으며 UV 254 nm에서 검출하였다.
  • Microtiter plate의 well에 전 배양액(50 μl)과 아미노산(2%, w/v)이 첨가된 탈카르복시화 액체배지(100 μl)를 각각 분주한 후 35°C, 48시간 동안 혐기적인 조건(Anoxomat system, MART Co.) 하에서 배양한 다음 BA 함량은 Eerola 등(1993)과 Mah등(2003)의 방법을 일부 변형하여 측정하였다.
  • Skim milk powder (BD Difco)를 10% (w/v)의 농도에 맞춰 증류수에 용해시킨 다음 고압습열 멸균하여 탈지유를 제조하였다. 한편, 대두(500 g)에 10배의 증류수를 가하여 상온에서 12시간 동안 수침한 후 대두를 건져 60°C의 열수(5 L)를 가하여 약 3분간 후)박테리오 신">박테리오신 용액을 microtiter plate well (Falcon)에 가한 후 37°C에서 24시간 배양하여 600 nm에서 흡광도를 측정하였다. 대조구는 박테리오신 용액 대신 PBS (pH 7.0)를 가하여 얻은 탁도 50%에 해당하는 최대 희석배수의 역수를 박테리오신 활성(arbitrary unit, AU)으로 계산하였다.
  • 면보로 압착하여 얻은 액체는 원심분리(5,000 × g, 5분)하여 침전물을 제거한 후 상등액은 65°C에서 30분간 가열 살균하여 두유를 제조하였다(Devi et al., 2014).
  • 박테리오신 용액 300 AU/ml을 탈지유와 두유에 각각 첨가한 다음 BHI broth에서 배양한 BA 생성균의 배양액을 원심분리(7,000 × g, 20분, 4°C)하여 세포 현탁액(1.0 × 106 CFU/ml)을 접종하고 37〬C에서 24시간 동안 배양하였다.
  • 배양 상등액 처리: 유산균은 MRS broth에 접종하여 37°C에서 24시간 배양한 후 원심분리(7,000 × g, 20분, 4°C)하여 상등액을 회수한 후 세포를 제거하기 위해 여과 제균(0.45 μm membrane filter)하고 탈지유와 두유에 각각 5.0% (v/v) 농도로 첨가하였다.
  • 배양한 시료(1 g)를 채취한 후 PBS (pH 7.0)로 십진 희석한 다음 MRS agar 상에서 표준한천평판배양법으로 유산균수를 측정하였다.
  • 상등액을 회수하여 0.22 μm membrane filter로 여과 제균한 후 HPLC의 ion exchange column (Aminex HPX-87H, 300 × 7.8 mm, Bio-Rad) 온도는 65°C, 이동상(0.01 M H2SO4) 유속은 0.6 ml/min 하에서 분석하였다.
  • 세포 현탁액 내 균수는 1.0 × 105 CFU/ml로 맞추고 이진법으로 희석한 박테리오신 용액을 microtiter plate well (Falcon)에 가한 후 37°C에서 24시간 배양하여 600 nm에서 흡광도를 측정하였다.
  • 시료 5 g에 동량의 증류수를 가하고 1% (w/v) 페놀프탈레인 지시약을 첨가한 다음 0.1 N NaOH 용액으로 적정하여 그 소비량을 측정한 다음 계산식[산도(%) = 0.1 N NaOH 소비량 × 0.1 N NaOH 역가 × 0.9]/시료량]에 대입하여 적정 산도를 계산하였다.
  • 시료 내 BA 함량은 Eerola 등(1993)의 방법을 일부 변형하여 측정하였다. 즉, 시료(2 ml)에 0.
  • 시료(1 g)를 채취한 후 PBS (pH 7.0)로 십진 희석한 다음 BA 생성균은 Eosin Methylene Blue (EMB) agar (BD Difco) 상에서 표준한천평판배양법으로 생균수를 측정하였다.
  • 유산균은 Lactobacilli MRS agar (BD Difco), BA 생성균은 Brain Heart Infusion (BHI) agar (BD Difco) 사면배지 상에서 계대 배양(37°C, 24시간)하여 실험하였다.
  • 컬럼 온도 40°C에서 이동상(solvent A: 0.1 M ammonium acetate, solvent B: acetonitrile)의 유속은 1 ml/min으로 조정하였고, 시료량은 10 μl에 맞춰 주입하였다.
  • 컬럼 온도 40°C에서 이동상은 0.1 M ammonium acetate (A)와 acetonitrile (B)을 이용하였으며, 유속은 1 ml/min, 시료 10 μl 주입 후 254 nm에서 흡광도를 측정하여 분석하였다.
  • 혼합 배양 : 유산균과 BA 생성균은 MRS broth와 BHI broth에 각각 접종하고 37°C, 24시간 동안 배양하여 얻은 배양액으로부터 원심분리(7,000 × g, 10분, 4°C)하여 세포를 모아서 PBS (pH 7.0)로 2회 세척하였다.

  대상 데이터

  • 전보(Lim et al., 2011; Lim and Lee, 2016)에서 갓김치로부터 분리된 유산균(Lactobacillus acidophilus GK20, Lactobacillus brevis GK55, Lactobacillus paracasei GK74, Lactobacillus plantarum GK81)을 실험 균주로 사용하였고, 생선 내장으로부터 분리된 BA 생성균 Enterobacter aerogenes CIH05는 항균 활성 측정을 위한 지시 균주로 사용하였다. 유산균은 Lactobacilli MRS agar (BD Difco), BA 생성균은 Brain Heart Infusion (BHI) agar (BD Difco)

    데이터처리

    • 실험 결과값은 SPSS 프로그램(Ver. 12.0, Chicago, IL, USA)의 Student’s t-test를 통해 P < 0.05 유의 수준에서 대조구와 실험구의 유의성을 검정하였다.
    • 실험 항목별로 3회씩 실험하여 얻은 측정값은 평균±표준편차로 나타내었다.

  이론/모형

  • ">동결 건조시켰다. 50% (v/v) alcohol (4 ml)에 용해시켜 조박테리오신 용액을 제조하고 microtiter plate method (Hole et al., 1991)로 항균 활성을 측정하였다. BA 생성균은 BHI broth 내에서 37°C, 24시간 동안 배양 후 원심분리(7,000 × g, 20분, 과산화수소의 함량은 Gilliland (1969)의 방법에 따라 시료 (10 g)의 pH를 4.5로 조정한 후 0.1 M acetate buffer (2 ml)를 가하고 멸균수를 첨가하여 20 ml에 맞춰서 약 2분 동안 균질화 하였다. Whatman No.
  • 후)박테리오 신">박테리오신 용액 처리 : 전보(Lim et al., 2011)의 방법에 따라 유산균의 배양 상등액 내 유산 및 과산화수소의 항균력을 배제하기 위해 1 N NaOH를 이용하여 pH 7.0으로 조정한 다음 카탈라아제(1 mg/ml, Sigma-Aldrich)를 처리하였다. 60% (w/v)의 황산암모늄으로 염석 후 투석하여 탈염시켜 박테리오신 함량은 Settanni 등(2005)의 방법에 따라 시료 (10 g)에 40% acetonitrite-0.1% (v/v) trifluoroacetic acid (90ml)을 가하여 균질화 한 다음 원심분리(15,000 × g, 10분)하여 얻어진 침전물을 동결 건조시켰다.
  • 유산의 함량은 Shah와 Ravula (2002)의 방법에 따라 시료(1g)에 15.5 M nitric acid (100 μl)와 0.01 M sulfuric acid (2 ml)를 가한 후 원심분리(14,000 × g, 30분)해서 단백질을 침전시켰다.