[논문]항산화 효소의 산화적 변형에 뽕잎 발효물이 미치는 영향

강정훈

doi:10.12925/jkocs.2019.36.3.985

항산화 효소의 산화적 변형에 뽕잎 발효물이 미치는 영향
Effects of Fermented Mulberry Leaves (Morus alba L.) on Oxidative Modification of Antioxidnat Enzymes 원문보기

Journal of the Korean Applied Science and Technology = 한국응용과학기술학회지, v.36 no.3, 2019년, pp.985 - 994

초록
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뽕잎 (Morus alba L.)을 노루궁뎅이 버섯균사체(Hericium erinaceum)로 발효시켜 열수 추출한 발효물(MA-HE)이 항산화 효소인 Cu,Zn-superoxide dismutase (SOD)와 ceruloplasmin (CP)의 산화적 변형에 미치는 영향을 관찰하였다. 세포질에서 중요한 항산화 활성을 나타내는 Cu,Zn-SOD와 CP는 모두 구리이온을 포함하는 단백질이다. MA-HE은 peroxyl radical에 의해 변형되는 Cu,Zn-SOD와 CP를 모두 보호하였다. MA-HE은 peroxyl radical에 의한 Cu,Zn-SOD의 단백질 fragmentation과 효소의 inactivation을 모두 효과적으로 억제하였다. 또한, MA-HE는 CP의 fragmentation과 inactivation도 효과적으로 억제하였다. MA-HE가 peroxyl radical을 소거할 수 있는 기능을 가지고 있는 지를 확인하기 위해 thiobarbituric acid를 이용한 활성 측정법으로 관찰한 결과, MA-HE는 농도가 증가함에 따라 비례적으로 peroxyl radical 소거 활성이 높아지는 것으로 관찰되었다. MA-HE는 $100{\mu}g/mL$에서 44.03% 소거활성을 나타냈다. 따라서, MA-HE는 peroxyl radical을 효과적으로 소거함으로서 세포 내의 항산화 효소를 산화적 손상으로부터 보호할 것으로 생각된다. 이와 같은 결과는 MA-HE가 세포 내에서 발생하는 활성산소종을 효과적으로 소거하여 산화적 스트레스에 의해 야기되는 세포 독성에 대한 보호 작용을 할 것으로 생각된다.

Abstract ▼ AI-Helper

Muberry (Morus alba L.) leaves fermented with Hericium erinaceum mycelium (MA-HE) were assessed for the protection against oxidative modification of antioxidant enzymes, Cu,Zn-superoxide dismutase(SOD) and ceruloplasmin(CP). MA-HE were shown to significantly inhibited oxidative modifications and inactivations of Cu,Zn-SOD and CP induced by peroxyl radical. Antioxidant activity of MA-HE evaluated using peroxyl radical scavenging assays. MA-HE showed 44.03% of peroxyl radical scavenging activity at $100{\mu}g/mL$. Thus, MA-HE protect the antioxidant enzymes from oxidative damage by the scavenging peroxyl radicals. The results suggested that MA-HE was effectively removed reactive oxygen species in cells, thereby protecting cytotoxicity caused by oxidative stress.

주제어

표/그림 (5)

그림 Fig. 1. Protective effects of fermented Morus alba L. with Hericium erinaceum mycelium (MA-HE) on oxidative modification of Cu,Zn-SOD induced by peroxyl radical.
그림 Fig. 2. Protective effects of fermented Morus alba L. with Hericium erinaceum mycelium (MA-HE) on inactivation of Cu,Zn-SOD induced by peroxyl radical.
그림 Fig. 3. Protective effects of fermented Morus alba L. with Hericium erinaceum mycelium (MA-HE) on oxidative modification of CP induced by peroxyl radical.
그림 Fig. 4. Protective effects of fermented Morus alba L. with Hericium erinaceum mycelium (MA-HE) on inactivation of ceruloplasmin (CP) induced by peroxyl radical.
그림 Fig. 5. Peroxyl radical scavenging activity of fermented Morus alba L. with Hericium erinaceum mycelium (MA-HE).

AI 본문요약
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문제 정의

AAPH 처리 시 Cu,Zn-SOD는 단백질의 변형은 효소의 활성도에 영향을 미칠 것으로 생각되었다. 따라서 peroxyl radical이 Cu,Zn-SOD의 활성 미치는 영향을 알아보았다. 그림 2에서 보는 바와 같이 Cu,Zn-SOD의 활성은 AAPH에 의해 59% 정도 감소되었으나 발효물 처리 시 발효물 농도에 비례하여 활성감소폭이 줄어드는 것을 확인할 수 있었다.
CP도 AAPH 처리 시 단백질의 변형뿐 아니라 효소의 활성도 감소시킨다. 따라서 뽕잎 발효물이 peroxyl radical에 의한 CP의 활성감소에 어떤 영향을 미치는 지 알아보았다. 그림 4에서 보는 바와 같이 CP의 활성은 AAPH에 의해 70% 이상 감소되었으나 발효물 처리 시 발효물 농도에 비례하여 활성감소폭이 줄어드는 것을 확인할 수 있었다.
본 논문에서는 뽕잎을 천연물배지로 하여 노루궁뎅이 버섯균사체를 배양시켜 제조한 발효물이 항산화 기능이 있는 지를 확인하고자 하였다. 이와 같은 연구는 노루궁뎅이 버섯균사체 발효물을 이용한 기능성 식품 소재 개발 및 산업화에 도움을 줄 것으로 생각된다.
본 연구는 뽕잎 (Morus alba L.)을 노루궁뎅이 버섯균사체(Hericium erinaceum)로 발효시켜 열수 추출한 발효물(MA-HE)이 항산화 효소인 Cu,Zn-superoxide dismutase(SOD)와 cerullo-plasmin (CP)의 산화적 변형에 미치는 영향을 관찰하여 다음과 같은 결과를 얻었다.

제안 방법

2회 반복 추출 후 열수 추출액을 4°C에서 30분 동안 7,600 ☓g로 원심분리하여 불용성 침전물을 제거하고 상층액을 농축 및 동결건조 하여 실험에 사용하였다.
50 mM AAPH와 10 mM 2-deoxy-D-ribose를 함께 첨가하여 thiobarbituric acid와 반응할 수 있는 물질인 thiobarbituric acid reactive substances(TBARS)를 유도하기 위해 37°C에서 2시간 동안 반응 시키고, 1X PBS 용액, 2.8% TCA 용액, 1% TBA 용액을 각각 200 μL씩 첨가하고 100°C에서 10 분간 가열한다.
Peroxyl radical 소거활성을[40]의 방법을 변형하여 측정하였다. 50 mM AAPH와 10 mM 2-deoxy-D-ribose를 함께 첨가하여 thiobarbituric acid와 반응할 수 있는 물질인 thiobarbituric acid reactive substances(TBARS)를 유도하기 위해 37°C에서 2시간 동안 반응 시키고, 1X PBS 용액, 2.
따라서 TBARS 생성 억제 정도를 측정하여 peroxyl radical 소거활성을 관찰하였다.
멸균시킨 뽕잎을 냉각시킨 후 10% 노루궁뎅이 버섯균사체를 접종하여 25°C에서 60일간 배양 (multi room incubator, Vision Scientific, Gyeonggi-do, Korea)하고 60°C에서 2일간 건조 시켜 뽕잎 발효물을 제조하였다.
뽕잎 발효물이 Cu,Zn-SOD와 CP의 산화적 변형을 억제하는 것이 peroxyl radical의 소거로 인한 것이 지를 확인하기 위해 뽕잎 발효물의 peroxyl radical 소거활성을 측정하였다.
뽕잎의 발효는 뽕잎을 수세한 후 실온에서 3-4일간 건조시켜 수분함량을 조절한 다음 건조물 100 g에 1.5배수의 물을 첨가하여 3시간 침지 시켜준 후 121°C에서 2시간 동안 고압에서 멸균하였다.
세포질에 존재하는 중요한 항산화 효소인 Cu,Zn-SOD의 산화적 손상에 발효물이 미치는 영향을 관찰하였다.
이와 같은 발효물의 열수 추출물 제조를 위해 뽕잎 발효물에 20배의 증류수를 첨가하고 homogenizer (Ultraturrax T-50, Janke & Kunkel GmbH & CO., KG-IKA-Labortechnik, Staufen, Germany)로 5,000 rpm에서 10분간 분쇄한 후 열수 추출하였으며, 여과지 (No. 2, Toyo Roshi Kaisha Ltd., Tokyo, Japan)로 잔사와 추출액을 분리하고 잔사는 다시 반복 추출하였다.
주로 혈장에 존재하는 구리이온 운반 단백질이자 항산화 효소로 작용하는 CP의 산화적 손상에 발효물이 미치는 영향을 관찰하였다. AAPH를 처리하여 단백질의 손상을 유도하고 뽕잎 발효물을 처리한 결과 발효물을 처리하지 않았을 때에는 단백질의 절단으로 인해 단백질 띠가 거의 보이지 않았으나(Fig.

대상 데이터

2,2'-azobis(2-amidinopropane) dihydrochloride (AAPH)는 Wako (Chuo-Ku, Osaka, Japan)에서 구입하여 사용하였다.
; MA)은 2016년 4월에 강원도 정선군에서 채취한 것을 사용하였으며, 균주로 사용한 노루궁뎅이 버섯(Hericium erinaceum)균사체는 충북농업 기술원(Chungbuk, Korea)으로부터 분양받아 potato dextrose agar (PDA, Difco, Detroit, MI, USA) 사면배지에서 25°C에서 10일간 배양한 후 4°C에 보존한 노루궁뎅이 버섯균사체를 사용하였다. Thiobarbituric acid (TBA), Cu,Zn-SOD, p-phenylenediamine은 Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA)로부터 구입하였고, human CP 는 Calbiochem(Darmstadt, Germany)으로부터 구입하였다. 2,2'-azobis(2-amidinopropane) dihydrochloride (AAPH)는 Wako (Chuo-Ku, Osaka, Japan)에서 구입하여 사용하였다.
본 실험에 사용한 뽕잎(Morus alba L.; MA)은 2016년 4월에 강원도 정선군에서 채취한 것을 사용하였으며, 균주로 사용한 노루궁뎅이 버섯(Hericium erinaceum)균사체는 충북농업 기술원(Chungbuk, Korea)으로부터 분양받아 potato dextrose agar (PDA, Difco, Detroit, MI, USA) 사면배지에서 25°C에서 10일간 배양한 후 4°C에 보존한 노루궁뎅이 버섯균사체를 사용하였다.

데이터처리

각 군 간의 측청치 비교는 ANOVA 분석 후 Duncan's multiple range test로 P<0.05에서 유의성을 검증하였다.
실험결과에 대한 통계분석은 SPSS 통계프로그램(Statistical Package for the Social Science, Ver. 12.0, SPSS Inc., Chicago, IL, USA)을 이용하여 분석하였으며, 모든 실험값은 3회 이상 반복 실시한 결과를 평균 ±표준편차(standard deviation, SD)로 나타내었다.

이론/모형

CP의 효소활성은 Sunderman과 Nomoto 방법 [39]을 사용하여 측정하였다. CP(0.
Cu,Zn-SOD의 활성은 xanthine/xanthine oxidase에 의한 ferricytochrome c의 감소를 억제하는 정도를 측정하는 McCord와 Fridovich 방법 [38]을 이용하여 측정하였다.
단백질의 농도는 BCA 방법[37]을 사용하여 측정하였다. Cu,Zn-SOD와 CP를 50 mM AAPH 와 반응시킨 후 반응액을 Vivaspin ultrafiltration column에 넣고 13,000 rpm으로 1시간 원심분리하여 반응하지 않은 AAPH를 제거해준다.

성능/효과

1. MA-HE은 농도가 증가함에 따라 peroxyl radical에 의한 Cu,Zn-SOD의 단백질 fragmentation과 효소의 inactivation을 모두 비례적으로 억제하였다.
2. MA-HE는 농도가 증가함에 따라 peroxyl radical에 의한 CP의 fragmentation과 inactivation도 비례적으로 억제하였다.
3. MA-HE는 농도가 증가함에 따라 비례적으로 peroxyl radical을 소거할 수 있었다.
주로 혈장에 존재하는 구리이온 운반 단백질이자 항산화 효소로 작용하는 CP의 산화적 손상에 발효물이 미치는 영향을 관찰하였다. AAPH를 처리하여 단백질의 손상을 유도하고 뽕잎 발효물을 처리한 결과 발효물을 처리하지 않았을 때에는 단백질의 절단으로 인해 단백질 띠가 거의 보이지 않았으나(Fig. 3A, lane 2), 발효물을 처리하였을 때에는 농도가 증가함에 따라 단백질 띠의 밀도가 증가함을 나타냈다(Fig. 3A). CP 단백질 띠를 밀도 측정기를 이용하였을 때 뽕잎 발효물 1000 μg/mL 농도에서 CP 단백질 띠가 정상 단백질로 100% 회복되는 것을 확인 할 수 있었다 (Fig.
CP 단백질 띠를 밀도 측정기를 이용하였을 때 뽕잎 발효물 1000 μg/mL 농도에서 CP 단백질 띠가 정상 단백질로 100% 회복되는 것을 확인 할 수 있었다 (Fig. 3B).
SOD 단백질 띠를 밀도 측정기를 이용하였을 때 뽕잎 발효물 1000 μg/mL 농도에서 Cu,Zn-SOD 단백질 띠가 정상 단백질로 100% 회복되는 것을 확인 할 수 있었다(Fig. 1B).
따라서 peroxyl radical이 Cu,Zn-SOD의 활성 미치는 영향을 알아보았다. 그림 2에서 보는 바와 같이 Cu,Zn-SOD의 활성은 AAPH에 의해 59% 정도 감소되었으나 발효물 처리 시 발효물 농도에 비례하여 활성감소폭이 줄어드는 것을 확인할 수 있었다. 뽕잎 발효물 2000 μg/mL 농도에서는 Cu,Zn-SOD 활성이 18%정도 감소되는 것으로 나타나, 효소가 산화적 손상을 받을 때에 비해 약 30% 효소 활성을 보호해 주는 것으로 관찰되었다.
따라서 뽕잎 발효물이 peroxyl radical에 의한 CP의 활성감소에 어떤 영향을 미치는 지 알아보았다. 그림 4에서 보는 바와 같이 CP의 활성은 AAPH에 의해 70% 이상 감소되었으나 발효물 처리 시 발효물 농도에 비례하여 활성감소폭이 줄어드는 것을 확인할 수 있었다. 뽕잎 발효물 2000 μg/mL 농도에서는 CP 활성이 20%정도 감소되는 것으로 나타나 효소가 산화적 손상을 받을 때에 비해 약 50% 효소 활성을 보호해 주는 것으로 관찰되었다.
본 연구결과를 종합해볼 때 뽕잎 발효물은 peroxyl radical에 의한 Cu,Zn-SOD 및 CP의 산화적 변형을 억제하며 이는 peroxyl radical을 효과적으로 소거하기 때문일 것으로 생각된다. Peroxyl radical은 다양한 생리적 및 병리적 과정에서 나타나며[40,41], 지질과산화과정 중에 나타나는 탄소 radical과 산소가 반응하여 생성되므로 지질과산화물의 생성과 밀접한 관련이 있다.
뽕잎 발효물 2000 μg/mL 농도에서는 CP 활성이 20%정도 감소되는 것으로 나타나 효소가 산화적 손상을 받을 때에 비해 약 50% 효소 활성을 보호해 주는 것으로 관찰되었다.
뽕잎 발효물 2000 μg/mL 농도에서는 Cu,Zn-SOD 활성이 18%정도 감소되는 것으로 나타나, 효소가 산화적 손상을 받을 때에 비해 약 30% 효소 활성을 보호해 주는 것으로 관찰되었다.
이상과 같은 연구결과를 통해, MA-HE는 peroxyl radical을 효과적으로 소거함으로서 세포내의 항산화 효소를 산화적 손상으로부터 보호할 것으로 예상된다. 따라서는 MA-HE가 세포 내에서 발생하는 활성산소종을 효과적으로 소거하여 산화적 스트레스에 의해 야기되는 세포 독성에 대한 보호 작용을 할 것으로 생각된다.

후속연구

Peroxyl radical은 다양한 생리적 및 병리적 과정에서 나타나며[40,41], 지질과산화과정 중에 나타나는 탄소 radical과 산소가 반응하여 생성되므로 지질과산화물의 생성과 밀접한 관련이 있다. 따라서 뽕잎 발효물에 의한 peroxyl radical 소거활성은 세포내의 지질과산화 생성 억제 및 항산화 효소들을 보호함으로서 활성산소로 인해 야기되는 여러 질병을 예방하는데 도움을 줄 것으로 사료된다.
이상과 같은 연구결과를 통해, MA-HE는 peroxyl radical을 효과적으로 소거함으로서 세포내의 항산화 효소를 산화적 손상으로부터 보호할 것으로 예상된다. 따라서는 MA-HE가 세포 내에서 발생하는 활성산소종을 효과적으로 소거하여 산화적 스트레스에 의해 야기되는 세포 독성에 대한 보호 작용을 할 것으로 생각된다.
본 논문에서는 뽕잎을 천연물배지로 하여 노루궁뎅이 버섯균사체를 배양시켜 제조한 발효물이 항산화 기능이 있는 지를 확인하고자 하였다. 이와 같은 연구는 노루궁뎅이 버섯균사체 발효물을 이용한 기능성 식품 소재 개발 및 산업화에 도움을 줄 것으로 생각된다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	노루궁뎅이 버섯은 무엇인가?	노루궁뎅이 버섯 (Hericium erinaceum)은 담자 균류 민주름버섯목(Aphllophorales), 턱수염버섯 과(Hydnaecae), 산호침버섯속(Hericium)으로 분류되는 버섯으로 우리나라를 비롯한 중국, 일본 등 북반구 온대지역에 분포하는 식용버섯으로 이용되어 왔다[8]. 노루궁뎅이 버섯은 암세포의 증식 억제, 신경성장인자 합성 유도 촉진, 면역기능 조절, 등의 생리활성이 보고되었다[9-13].
	뽕잎의 성분과 그 성분의 효과는 무엇인가?	의약용 소재로 활용하기 위한 연구들이 활발하게 진행되고 있다[3]. 기존 보고에 의하면 뽕잎에는 술독을 제거하는 alanine, aspartic acid, glutamic acid의 함량이 높고, 특히 γ -aminobutyric acid와 rutin의 함량과 serine과 tyrosine의 함량도 높아 노인성 치매와 동맥경화를 예방한다고 알려져 있다[4]. 또한 항암, 항염, 항산화, 항고지혈증 및 혈압조절에 효과가 있는 것으로 알려져 있고[5] 각종 미네랄 중에서도 칼 슘과 철분 및 칼륨의 함유량이 높은 것으로 알려져 있다[6].
	SOD의 과대 발현에 따른 위험성은 어떠한가?	Cu,Zn-superoxide dismutase (SOD)는 세포내의 중요한 항산화 효소로 알려져 있다. 그러나 이 효소가 과대 발현되면 세포사멸[21], 지질과산화 증가[22], biogenic amines 수송 저하[23], 뉴우런의 파괴[24]이 일어난다고 알려져 있다. 이와같은 현상은 Cu,Zn-SOD의 또 다른 활성인 자유라디칼 생성 기능에 기인한다고 알려져 있다.

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저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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