[논문]인체 방광암 T24 세포에서 감초(Glycyrrhizae radix) 열수추출물에 의한 apoptosis 유도

이기원; 김정일; 이승영; 최경민; 오영택; 정진우

doi:10.7732/kjpr.2019.32.4.255

인체 방광암 T24 세포에서 감초(Glycyrrhizae radix) 열수추출물에 의한 apoptosis 유도
Induction of Apoptosis by Water Extract of Glycyrrhizae radix in Human Bladder T24 Cancer Cells 원문보기

韓國資源植物學會誌 = Korean journal of plant resources, v.32 no.4, 2019년, pp.255 - 263

이기원 (광동제약(주)) , 김정일 (동아대학교 의과대학 직업환경의학교실) , 이승영 (국립낙동강생물자원관 혁신성과부) , 최경민 (국립낙동강생물자원관 혁신성과부) , 오영택 (국립낙동강생물자원관 동식물활용연구팀) , 정진우 (국립낙동강생물자원관 동식물활용연구팀)

초록
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본 연구에서는 다양한 약리학적 활성을 가지는 것으로 알려진 감초 열수추출물(GRW)의 항암효능을 알아보기 위하여 인체 방광암 T24 세포에서 생존율 및 증식억제에 미치는 영향과 이와 연관된 apoptosis 유발 여부 및 관련 인자들의 발현 변화를 조사하였다. 먼저 GRW의 처리에 따른 증식억제 정도를 조사한 결과, GRW 처리 농도 의존적으로 생존율 및 증식억제 현상이 나타났으며, 핵의 형태 변화, DNA 단편화 및 apoptosis 유발에 관하여 조사한 결과 역시 GRW 처리 농도 의존적으로 증가됨을 확인할 수 있었다. 이는 GRW의 처리에 의한 암세포의 증식억제 및 형태적 변형이 암세포의 apoptosis 유발과 밀접한 관련이 있음을 시사하여 주는 것으로 사료된다. GRW 처리에 의한 apoptosis 유발에 관여하는 유전자의 탐색을 위하여 apoptosis와 연관성을 가지는 Bcl-2 family에 속하는 유전자의 발현을 조사한 결과 GRW 처리 농도 의존적으로 Bax 단백질의 발현증가와 더불어 Bcl-2 및 Bcl-xL 단백질의 발현감소가 관찰되었다(Fig. 3A). 이는 GRW에 의한 T24 세포의 apoptosis 유발에 Bcl-2 family에 속하는 유전자의 발현 조절이 중요한 역할을 하는 것으로 사료된다. 또한 GRW의 처리에 따른 MMP의 소실은 미트콘드리아 막의 교란이 유발되었음을 의미하는 것으로, 이러한 MMP 값의 변동은 Bcl-2 family 단백질의 발현 변화에 의한 것이라 추정된다. 한편 Apoptosis에 중요한 역할을 하는 것으로 알려진 caspase(-3/-8/-9)의 발현과 이들의 활성을 억제하는 IAP family (XIAP, cIAP-1, cIAP-2)의 발현에 GRW이 어떠한 영향을 미치는지를 조사한 결과, caspase-3, -8 및 -9의 활성형 단백질 발현 및 정량적 활성증가를 확인하였으며, IAP family 속한 3가지 단백질 모두 발현이 감소하는 것이 관찰되었다. 이상의 결과에서 GRW은 외인적 및 내인적 경로의 개시에 핵심적인 역할을 하는 caspase-8 및 -9의 활성을 모두 증가시켰으며, 이에 따른 caspase-3의 활성증가에 의하여 apoptosis가 유발되었음을 알 수 있었다. 이러한 두 경로의 동시 활성화에는 미트콘드리아의 기능 소실과 Bcl-2 및 IAP family의 발현 변화가 관여하고 있었으며, 특히 Bid의 발현 감소는 GRW에 의한 내인적 경로를 증폭시키는 효과로 작용했을 것이라 추정된다. 방광암의 치료에 보다 효과적인 생리활성을 갖는 물질을 발굴하고 그와 관련된 분자 및 세포수준에서의 기전을 밝히는 것이 중요하기에 본 연구의 결과는 향후 GRW로 수행될 추가 실험을 위한 기초자료로서 그 가치가 매우 높을 것으로 사료된다.

Abstract ▼ AI-Helper

Glycyrrhizae radix is one of the most frequently prescribed ingredients in Oriental medicine, and Glycyrrhizae radix extract has been shown to exert anti-cancer effects. However, the cellular and molecular mechanisms of programed cell death (apoptosis) by Glycyrrhizae radix are poorly defined. In the present study, it was examined the molecular mechanisms of apoptosis by water extracts of Glycyrrhizae radix (GRW) in human bladder T24 cancer cells. It was found that GRW could inhibit the cell growth of T24 cells in a concentration-dependent manner, which was associated with the induction of apoptotic cell death, as evidenced by the formation of apoptotic bodies, DNA fragmentation and increased populations of annexin-V positive cells. The induction of apoptotic cell death by GRW was connected with an up-regulation of pro-apoptotic Bax protein expression and down-regulation of anti-apoptotic proteins (Bcl-2 and Bcl-xL), and inhibition of apoptosis family proteins (XIAP, cIAP-1 and cIAP-2). In addition, apoptosis-inducing concentrations of GRW induced the activation of caspase-9, an initiator caspase of the mitochondrial-mediated intrinsic pathway, and caspase-3, accompanied by proteolytic degradation of PARP. GRW also induced apoptosis via a death receptor-mediated extrinsic pathway by caspase-8 activation, resulting in the down-regulation of total Bid and suggesting the existence of cross-talk between the extrinsic and intrinsic pathways. Taken together, the present results suggest that GRW may be a potential chemotherapeutic agent for the control of human bladder cancer cells.

주제어

표/그림 (5)

그림 Fig. 1. Inhibition of cell proliferation by GRW in T24 human bladder cancer cells. Cells were seeded in 6 well plate at 3×105 cells/mL and treated with the indicated concentrations of GRW for 24 hr. Cell number (A) and viability (B) were measured by the metabolic-dye-based MTT assay and trypan blue assay, respectively. Each point represents the mean ±SD of three independent experiments. The significance was determined by the Student’s t-test (*p<0.05 vs. untreated control).
그림 Fig. 2. Induction of apoptosis by GRW in T24 human bladder cancer cells. (A) The cells were fixed and stained with DAPI solution. The stained nuclei were photographed with a fluorescence microscope using blue filter. (Original magnification, ×400). (B) The DNA fragmentations were separated on 1.6% agarose gel electrophoresis and visualized under UV light after staining with EtBr. (C) To quantify the degree of apoptosis induced by GRW, cells were stained with FITC-conjugated Annexin V and PI for DNA flow cytometry analysis. Apoptotic cells are determined by counting the % of annexin V+/PI- cells.
그림 Fig. 3. Effects of GRW on the expression of Bcl-2 and IAP family proteins in T24 human bladder cancer cells. Cells were treated with GRW for 24 hr, and aliquots containing total proteins were subjected to SDS-polyacrylamide gels followed by immunoblot analysis with specific antibodies against Bcl-2 (A) and IAP (B) family proteins, and an ECL detection system. Actin was used as an internal control.
그림 Fig. 4. Effects of GRW on the MMP values in T24 human bladder cancer cells. (A) Cells were treated with GRW for 24 hr, collected and then incubated with JC-1 (10 μM) for 20 min at 37°C in the dark. The cells were then washed once with PBS and analyzed by a flow cytometer. (B) Results are expressed as percentage of the vehicle treated control ±SD of three separate experiments. Significance was determined using a Student’s t-test (*p<0.05 vs. untreated control).
그림 Fig. 5. Activation of caspases and the degradation of the caspase-3 substrate protein by GRW treatment in T24 human bladder cancer cells. The cells were treated with indicated concentration of GRW for 24 hr. (A) The cells were lysed and then equal amounts of cell lysates were separated on SDS-polyacrylamide gels and transferred to nitrocellulose membranes. The membranes were probed with the indicated antibodies. Proteins were visualized using an ECL detection system. Actin was used as an internal control. (B) Caspases (-3, -8, and -9) activities were determined using in vitro caspases assay kits obtained from R&D according to the protocol of the manufacturer. The data are expressed as the mean ±SD of three independent experiments. The significance was determined by the Student's t-test (*p<0.05 vs. untreated control).

AI 본문요약
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문제 정의

따라서 본 연구에서는 감초 열수추출물이 인체 방광암 T24 세포에 미치는 항암 효과의 생화학적 기전의 해석을 위하여 T24 세포의 증식에 미치는 영향을 조사하였고, 감초 열수추출물이 유발하는 증식억제 현상이 apoptosis에 어떠한 영향을 미치는지를 조사하여 유의적인 결과를 얻었기에 이를 보고하는 바이다.

제안 방법

Apoptosis 유발에 있어서 중요한 작용을 하는 것으로 알려진 caspase-3/-8/-9의 활성 정도를 정상 및 GRW가 처리된 배지에서 colorimetric assay kits (R&D Systems, Minneapolis, MN, USA)를 사용하여 제시된 방법에 준하여 활성의 증감여유를 조사하였다. 24시간 배양된 세포를 모은 뒤 상기와 동일한 방법으로 단백질을 추출하고 정량하여 각각 20 ㎍의 단백질을 fluorogenic peptide 기질 100 μM이 함유된 50 μL의 extraction buffer [40 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesul fonic acid (pH 7.
Apoptosis 유발의 또 다른 증거를 제시하기 위하여 DNA 단편화 현상의 분석을 실시하였다. 상기와 동일한 방법으로 처리된 세포들을 모은 다음 lysis buffer [5 mM Tris-HCl (pH 7.

대상 데이터

T24 세포는 American Type Culture Collection (Rockville, MD, USA)에서 분양받아, 10% fetal bovine serum (FBS, Gibco BRL, Gaithersburg, MD, USA) 및 1% penicillin–streptomycin이 함유된 RPMI 1640 배지를 사용하여 37℃, 5% CO₂ 조건에서 배양하였다. GRW 처리에 따른 세포 증식 억제 정도를 측정하기 위하여 6-well plate에 T24 세포를 well당 3×10⁵개를 분주하고 GRW를 적정 농도로 처리하여 배양하였다.
본 실험에 사용한 감초 시료는 ㈜서경한방약업사(Busan, Republic of Korea)에서 파쇄된 상태로 구입하였으며, 본 표본은 국립낙동강 생물자원관 자원은행부에 보관하고 있다(FBCC-EP-83). 감초 열수 추출물(water extract of Glycyrrhizae radix, GRW)을 얻기 위하여 시료 무게의 10배에 해당하는 증류수로 100℃에서 3시간 동안 추출하였다.

데이터처리

실험 결과들의 유의성을 검정하기 위하여 분산분석(ANOVA)을 실시한 후 p<0.05 수준에서 Duncan’s multiple range tests를 실시하였으며, 그 결과는 평균(mean) ± 표준편차(standard deviation, SD)로 표시하였다. 이때 사용한 모든 통계분석은 SPSS 17.

성능/효과

58%의 세포에서 apoptosis가 유발되는 것으로 나타났다. 이상의 결과를 살펴볼때 인체 방광 암 T24 세포에서 GRW 처리에 의한 생존율 감소, 증식 억제 및 형태변화는 apoptosis 유발과 밀접한 연관성이 있음을 알 수 있었다.
, 2004). 이상의 결과를 살펴볼때 인체 방광암 T24 세포에서 GRW이 유발하는 apoptosis는 caspase-8 및 -9의 활성화에 따른 caspase-3의 활성화 및 기질단백질인 PARP의 단편화가 중요한 역할을 한다는 것을 알 수 있었다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	감초의 최근 연구에 의한 효능은 무엇인가?	, 2008). 최근 연구에 의하면 항산화, 항염증 효과(Siracusa et al., 2011) 뿐만 아니라, 세포주기 억제 및 apoptosis 유발 등과 같은 항암활성을 가지는 것으로 보고되고 있다(Yamazaki et al., 2002).
	감초의 정의는 무엇인가?	감초(Glycyrrhizae radix)는 콩과에 속하는 다년생 초본으로 예로부터 진해(鎭咳), 해독(解毒), 거담(祛痰), 이뇨(利尿)작용 등을 치료하기 위해 한방에서 널리 사용되어 왔으며(Lee et al., 2010; Lee et al.
	항암치료의 효과적인 전략은 무엇인가?	항암치료의 효과적인 전략은 다양한 기전을 통하여 암세포의 분열과 성장을 억제하고 선택적으로 암세포를 제거하는데 있다. 이러한 측면에서 특정 약물의 처리에 의한 암세포 특이적 프로그램화된 세포사멸 기전으로 알려져 있는 apoptosis 유발은 항암제 개발에 가장 중요한 영역으로 인식되고 있다(Kasibhatla and Tseng, 2003; Kerr et al.

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저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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