참돔은 등쪽에 푸른 반점이 흩어져 있고, 홍민어는 꼬리 쪽에 검은 점이 있어 원물 형태는 쉽게 구분할 수 있다. 그러나 횟감이나 필렛으로 이용 시 참돔과 홍민어를 구분하기 어려워, 참돔의 종 특이 primer를 개발 및 검증하고 모니터링을 통해 참돔의 위변조 사례를 조사하고자 하였다. 시료에서 gDNA를 추출하여 PCR을 진행하였으며 참돔 primer의 product size는 468 bp, 홍민어 primer의 product size는 181 bp으로 설계하였다. Multiplex PCR 결과 참돔과 홍민어에 대한 종 특이적 증폭이 확인되었다. 또한, 참돔과 홍민어 PCR 민감도 실험 결과 참돔 primer는 1 ng, 홍민어 primer는 0.1 ng 까지 밴드가 확인되었다. 모니터링 결과 참돔으로 구매한 시료 19건 모두 참돔으로 판정되었다. 따라서 본 연구에서 제작된 참돔과 홍민어 종에 대한 종 특이적 primer는 횟감 등 수산물에도 적용할 수 있어 현재 유통 및 판매되고 있는 참돔 및 홍민어 판별에 적합성을 확인하였다.
참돔은 등쪽에 푸른 반점이 흩어져 있고, 홍민어는 꼬리 쪽에 검은 점이 있어 원물 형태는 쉽게 구분할 수 있다. 그러나 횟감이나 필렛으로 이용 시 참돔과 홍민어를 구분하기 어려워, 참돔의 종 특이 primer를 개발 및 검증하고 모니터링을 통해 참돔의 위변조 사례를 조사하고자 하였다. 시료에서 gDNA를 추출하여 PCR을 진행하였으며 참돔 primer의 product size는 468 bp, 홍민어 primer의 product size는 181 bp으로 설계하였다. Multiplex PCR 결과 참돔과 홍민어에 대한 종 특이적 증폭이 확인되었다. 또한, 참돔과 홍민어 PCR 민감도 실험 결과 참돔 primer는 1 ng, 홍민어 primer는 0.1 ng 까지 밴드가 확인되었다. 모니터링 결과 참돔으로 구매한 시료 19건 모두 참돔으로 판정되었다. 따라서 본 연구에서 제작된 참돔과 홍민어 종에 대한 종 특이적 primer는 횟감 등 수산물에도 적용할 수 있어 현재 유통 및 판매되고 있는 참돔 및 홍민어 판별에 적합성을 확인하였다.
Nowadays, with increase of seafood consumption, there have been increasing reports of defective seafood products. There have been incidents of red drum (Sciaenops ocellatus) being sold as red seabream (Pagrus major). In this study, we sought to develop and validate species-specific PCRs to different...
Nowadays, with increase of seafood consumption, there have been increasing reports of defective seafood products. There have been incidents of red drum (Sciaenops ocellatus) being sold as red seabream (Pagrus major). In this study, we sought to develop and validate species-specific PCRs to differentiate between P. major and S. ocellatus to prevent the sale of S. ocellatus as P. major. Primers for P. major were designed to bind 12s rRNA and those for S. ocellatus were designed to bind 16s rRNA. Multiplex PCR showed a 468 bp amplicon for P. major and a 181 bp amplicon for S. ocellatus. The limit of detection of P. major and S. ocellatus was present at 1 ng each. The developed primers were validated with 19 P. major samples of food items purchased through the internet. Using this monitoring method, the experimental results and tested species were in agreement. Hence, the developed multiplex PCR method is considered reliable to authenticate P. major and S. ocellatus.
Nowadays, with increase of seafood consumption, there have been increasing reports of defective seafood products. There have been incidents of red drum (Sciaenops ocellatus) being sold as red seabream (Pagrus major). In this study, we sought to develop and validate species-specific PCRs to differentiate between P. major and S. ocellatus to prevent the sale of S. ocellatus as P. major. Primers for P. major were designed to bind 12s rRNA and those for S. ocellatus were designed to bind 16s rRNA. Multiplex PCR showed a 468 bp amplicon for P. major and a 181 bp amplicon for S. ocellatus. The limit of detection of P. major and S. ocellatus was present at 1 ng each. The developed primers were validated with 19 P. major samples of food items purchased through the internet. Using this monitoring method, the experimental results and tested species were in agreement. Hence, the developed multiplex PCR method is considered reliable to authenticate P. major and S. ocellatus.
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문제 정의
특이적인 band가 나타나지 않아 새로운 어종 판별기술이 필요할 것으로 보고하고 있다. 따라서 PCR을 이용하여 참돔과 홍민어를 구분하고자 하였다.
따라서, 본 연구에서는 형태학적으로 유사하지 않지만 회나 필렛 등으로 가공 처리 시 유사식품으로 판매될 수 있는 참돔과 홍민어의 종 특이 primer를 개발하고, 개발된 판별법의 검증 및 모니터링을 통해 참돔으로 위변조 된 사례를 사전에 예방할 수 있는 분석법을 확립하고자 하였다.
제안 방법
PCR 반응액은 각각 genomic DNA 1µL, forward primer 1µL, reverse primer 1µL, prime taq premix (2X) (GENETBIO, Daejeon, Korea), 멸균증류수 17µL를 포함하여 총 용량이 20µL가 되도록 하였다. PCR 반응은 AllInOneCycler (Bioneer, Daejeon, Korea)를 이용하여 PCR을 진행하였다.
총 용량이 20µL가 되도록 하였다. PCR 반응은 AllInOneCycler (Bioneer, Daejeon, Korea)를 이용하여 PCR을 진행하였다. PCR 조건은 initial denaturation을 95 C에서 5분 실시 후, denaturation을 95 C에서 20초, annealing을 56 C에서 20초, extension을 72 C에서 30초로 30 cycle을 반복하고 최종적으로 extension 72 C에서 5분간 실시하여 PCR을 종료하였다(Table 2).
uk/ Tools/msa/clustalo/)를 이용하였다. Primer는 150-500 base pair가 되도록 하였고, Tm 값은 58-60 C의 범위를 가지며 GC 비율 30-37%를 고려하여 종 특이 primer를 설계하였다(Table 1).
각 시료의 genomic DNA는 POWERPREP DNA Extraction from Food and Feed Kit (Kogenbiotech, Seoul, Korea)를 사용하여 제조사의 매뉴얼에 따라 추출하였다. 추출한 genomic DNA의 농도는 OptizenTM NanoQ (K Lab Kiswire, Daejeon, Korea)을 이용하여 측정하였다.
또한, 프라이머의 비특이적 반응을 알아보기 위해 negative control로 멸균증류수 17µL forward primer 1µL, reverse primer 1µL를 넣어 확인하였다.
실험결과의 판정은 참돔(468 bp) band가 증폭되었을 때 참돔 양성으로 판정하였다.
참돔과 홍민어 염기서열분석은 미국 국립보건원에서 운영하고 있는 유전자은행(www.ncbi.nlm.nih)에 등록 된 염기서열을 이용하여 프라이머를 설계하였다(Table 1). 설계된 프라이머를 이용하여 실험한 결과는 Fig.
홍민어를 참돔으로 위변조하여 판매되는 현황을 알아보기 위해 참돔 필렛시료를 19건 구입 후 본 실험에서 개발된 multiplex PCR 판별법을 이용하여 모니터링을 실시하였다. 실험결과의 판정은 참돔(468 bp) band가 증폭되었을 때 참돔 양성으로 판정하였다.
ocellatus)는 NC_016867의 유전자 염기서열을 선정하였다. 확보된 참돔과 홍민어의 미토콘드리아 DNA 서열 중에서 16s rRNA, 12s rRNA 유전자 염기서열을 이용하여 유전자 서열을 정렬하였으며 염기서열의 정렬은 clustal omega (EMBL, https://www.ebi.ac.uk/ Tools/msa/clustalo/)를 이용하였다. Primer는 150-500 base
1ng가 되도록 희석하였다. 희석된 DNA를 single PCR과 multiplex PCR의 template DNA로 실험을 진행하였다.
대상 데이터
시료는 모두 형태학적으로 판별이 완료된 시료를 사용하였다. 모니터링에 사용된 참돔 시료는 시중에 유통 중인 필렛 제품을 구매하여 사용하였다. 표준시료와 모니터링 시료의 경우 구입 본 실험에서는 개발된 multiplex PCR을 이용해 시중에서 판매되고 있는 참돔 필렛 시료 19건을 구입하여 모니터링 하였으며 전기영동 결과는 Fig. 5에 나타내었다. 참돔의 양성 판정 결과는 Table 3에 나타내었으며 시료 19 건 모두 참돔으로 판정되어 실험시료와 결과가 100% 일치함을 확인하였으며, 참돔의 위변조 사례는 조사된 경우에는 나타나지 않았다.
ocellatus) 는 부산 자갈치 시장에서 구매하였다. 시료는 모두 형태학적으로 판별이 완료된 시료를 사용하였다. 모니터링에 사용된 참돔 시료는 시중에 유통 중인 필렛 제품을 구매하여 사용하였다.
gov)에 등록된 미토콘드리아 전체 염기서열로부터 확보하였다. 참돔(P. major) 은 AP002949, 홍민어(S. ocellatus)는 NC_016867의 유전자 염기서열을 선정하였다. 확보된 참돔과 홍민어의 미토콘드리아 DNA 서열 중에서 16s rRNA, 12s rRNA 유전자 염기서열을 이용하여 유전자 서열을 정렬하였으며 염기서열의 정렬은 clustal omega (EMBL, https://www.
참돔과 홍민어의 판별법 개발을 위한 16s rRNA, 12s rRNA 유전자의 염기서열은 National Center for Biotechnology Information (NCBI, http://www.ncbi.nlm.nih.gov)에 등록된 미토콘드리아 전체 염기서열로부터 확보하였다. 참돔(P.
표준시료로 사용된 참돔(P. major)과 홍민어(S. ocellatus) 는 부산 자갈치 시장에서 구매하였다. 시료는 모두 형태학적으로 판별이 완료된 시료를 사용하였다.
성능/효과
1 ng 까지 검출이 확인되었다. PCR 분석법에서 template DNA 농도는 보통 10 ng으로 설정하고 있고, 본 실험에서는 민감도가 0.1-1 ng 으로 나타나 PCR 실험의 일반적인 민감도를 만족함을 알 수 있었다 .
PCR 반응은 AllInOneCycler (Bioneer, Daejeon, Korea)를 이용하여 PCR을 진행하였다. PCR 조건은 initial denaturation을 95 C에서 5분 실시 후, denaturation을 95 C에서 20초, annealing을 56 C에서 20초, extension을 72 C에서 30초로 30 cycle을 반복하고 최종적으로 extension 72 C에서 5분간 실시하여 PCR을 종료하였다(Table 2). 증폭된 PCR 산물은 1.
판별이 어렵다. 따라서 multiplex PCR 판별법이 유통 및 판매되고 있는 참돔 판별에 적합함을 확인할 수 있었다.
3에 나타내었다. 실험 결과 참돔 primer 는 참돔 template DNA만을 증폭하였고, 홍민어 primer는 홍민어 template DNA만을 증폭하였다. 참돔과 홍민어 primer에서 negative controle 증폭하지 않은 것을 볼 수 있으며 이를 통해 참돔과 홍민어에 적합한 종 특이 primer 가 개발되었음을 확인하였다.
8em;">점이 있다. 유전자 분석법을 이용한 판별법은 단백질 기반의 판별법보다 특이성 및 감도가 높고, 단백질보다 열에 강하여 가공 처리된 시료에서 보다 안정적인 결과를 얻을 수 있다. 또한 중합효소 연쇄반응(Polymerase chain reaction, PCR)을 이용하여 일부 유전자를 증폭시키는 방법은 신속성, 특이도, 민감도, 간편성 등이 우수하여 식품원료 동정에 이용되고 있다.
실험 결과 참돔 primer 는 참돔 template DNA만을 증폭하였고, 홍민어 primer는 홍민어 template DNA만을 증폭하였다. 참돔과 홍민어 primer에서 negative controle 증폭하지 않은 것을 볼 수 있으며 이를 통해 참돔과 홍민어에 적합한 종 특이 primer 가 개발되었음을 확인하였다.
5에 나타내었다. 참돔의 양성 판정 결과는 Table 3에 나타내었으며 시료 19 건 모두 참돔으로 판정되어 실험시료와 결과가 100% 일치함을 확인하였으며, 참돔의 위변조 사례는 조사된 경우에는 나타나지 않았다.
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