계종버섯 추출물과 분획물의 라디칼 소거 활성과 항염증 활성 분석 Investigation of radical scavenging and anti-inflammatory activity of the extract and fractions of Termitomyces albuminosus원문보기
계종버섯은 중국에서 맛과 향에서 최고의 버섯으로 평가받고 있으며, 본초강목에 그 효능이 기록되어 전해지고 있으나 효능과 물질연구 및 인공재배법 개발이 요구되고 있는 상황이다. 항산화 활성과 항염증 활성을 가지는 기능성 물질의 확보와 기능성식품 개발을 위한 기초자료를 확보하기 위하여 유기용매 추출물과 열수 추출물을 제조하고, 활성이 높은 분획물을 얻고자 하였다. CH2Cl2와 MeOH 혼합용매로 추출한 다음 비극성용매와 극성용매로서 용해성에 따라 분획하고, 열수 추출로 추출물을 확보하였다. 분획물과 추출물을 이용한 항산화 활성 조사에서는 열수 추출물(TA4)의 DPPH 라디칼 소거능에 대한 IC50값이 1.5 mg/mL로 나타났고, MeOH 분획물(TA2)에서는 IC50값이 1.93 mg/mL로 높게 나타났다. NO생성 억제율로 조사한 항염증 활성은 EtOAc 분획물(TA1)은 조추출물이지만 100 ㎍/mL 처리농도에서는 79% NO생성이 억제되고, 200 ㎍/mL 농도에서는 NO가 전혀 생성되지 않았다. TA1 물질을 2차례 TLC로 분리한 TA1-5-6물질은 15 ㎍/mL 처리농도에서 대조구와 비교하여 NO생성이 86% 억제되었고, 30 ㎍/mL 농도에서는 NO 생성이 완전히 억제되었다. 그리고 세포독성 실험에서는 50 ㎍/mL 농도에서도 전혀 독성이 나타나지 않았다. MeOH 분획물(TA2) 유래의 TA2-1-5물질은 30 ㎍/mL 처리농도에서 75% 이상 NO생성이 억제되었으며, 세포 독성은 50 ㎍/mL에서도 아주 낮게 나타났다. 선택적 용매의 선별과 추출 방법의 개발을 통하여 세포 독성이 없고, 생리활성이 뛰어난 계종버섯 분획물 확보가 가능하였고, 기능성식품 및 건강 기능성소재로서의 충분한 잠재력을 확인할 수 있었다.
계종버섯은 중국에서 맛과 향에서 최고의 버섯으로 평가받고 있으며, 본초강목에 그 효능이 기록되어 전해지고 있으나 효능과 물질연구 및 인공재배법 개발이 요구되고 있는 상황이다. 항산화 활성과 항염증 활성을 가지는 기능성 물질의 확보와 기능성식품 개발을 위한 기초자료를 확보하기 위하여 유기용매 추출물과 열수 추출물을 제조하고, 활성이 높은 분획물을 얻고자 하였다. CH2Cl2와 MeOH 혼합용매로 추출한 다음 비극성용매와 극성용매로서 용해성에 따라 분획하고, 열수 추출로 추출물을 확보하였다. 분획물과 추출물을 이용한 항산화 활성 조사에서는 열수 추출물(TA4)의 DPPH 라디칼 소거능에 대한 IC50값이 1.5 mg/mL로 나타났고, MeOH 분획물(TA2)에서는 IC50값이 1.93 mg/mL로 높게 나타났다. NO생성 억제율로 조사한 항염증 활성은 EtOAc 분획물(TA1)은 조추출물이지만 100 ㎍/mL 처리농도에서는 79% NO생성이 억제되고, 200 ㎍/mL 농도에서는 NO가 전혀 생성되지 않았다. TA1 물질을 2차례 TLC로 분리한 TA1-5-6물질은 15 ㎍/mL 처리농도에서 대조구와 비교하여 NO생성이 86% 억제되었고, 30 ㎍/mL 농도에서는 NO 생성이 완전히 억제되었다. 그리고 세포독성 실험에서는 50 ㎍/mL 농도에서도 전혀 독성이 나타나지 않았다. MeOH 분획물(TA2) 유래의 TA2-1-5물질은 30 ㎍/mL 처리농도에서 75% 이상 NO생성이 억제되었으며, 세포 독성은 50 ㎍/mL에서도 아주 낮게 나타났다. 선택적 용매의 선별과 추출 방법의 개발을 통하여 세포 독성이 없고, 생리활성이 뛰어난 계종버섯 분획물 확보가 가능하였고, 기능성식품 및 건강 기능성소재로서의 충분한 잠재력을 확인할 수 있었다.
Termitomyces albuminosus has been recognized to have the best mushrooms in China, in terms of taste and aroma. The efficacy of these mushrooms has been recorded in the botanical list. However, research on the development of their artificial culture methods is necessary. In this study, we prepared an...
Termitomyces albuminosus has been recognized to have the best mushrooms in China, in terms of taste and aroma. The efficacy of these mushrooms has been recorded in the botanical list. However, research on the development of their artificial culture methods is necessary. In this study, we prepared an organic solvent extract and a hot water extract to understand the development of compounds and functional foods with antioxidant and anti-inflammatory activities. The IC50 value of DPPH radical scavenging activity of the hot water extract (TA4) was 1.5 mg/mL and the IC50 value of the MeOH fraction (TA2) was 1.93 mg/mL. The anti-inflammatory activity was investigated by the inhibition of NO production. EtOAc fraction (TA1) is a crude extract, but 79% of NO production was inhibited at 100 ㎍/mL. NO was not produced at 200 ㎍/mL. TA1-5-6, from TA1 inhibited NO production by 15% as compared to the positive control at 15 ㎍/mL, and completely inhibited NO production at 30 ㎍/mL. No cytotoxicity was observed at 50 ㎍/mL. TA2-1-5 from the MeOH fraction (TA2) inhibited more than 75% of NO production at 30 ㎍/mL; cytotoxicity was very low even at 50 ㎍/mL. In conclusion, by selective solvent selection, it was possible to manufacture an extract with no cytotoxicity and excellent biological activities. Furthermore, the extracts showed potential for developing various functional foods and drugs.
Termitomyces albuminosus has been recognized to have the best mushrooms in China, in terms of taste and aroma. The efficacy of these mushrooms has been recorded in the botanical list. However, research on the development of their artificial culture methods is necessary. In this study, we prepared an organic solvent extract and a hot water extract to understand the development of compounds and functional foods with antioxidant and anti-inflammatory activities. The IC50 value of DPPH radical scavenging activity of the hot water extract (TA4) was 1.5 mg/mL and the IC50 value of the MeOH fraction (TA2) was 1.93 mg/mL. The anti-inflammatory activity was investigated by the inhibition of NO production. EtOAc fraction (TA1) is a crude extract, but 79% of NO production was inhibited at 100 ㎍/mL. NO was not produced at 200 ㎍/mL. TA1-5-6, from TA1 inhibited NO production by 15% as compared to the positive control at 15 ㎍/mL, and completely inhibited NO production at 30 ㎍/mL. No cytotoxicity was observed at 50 ㎍/mL. TA2-1-5 from the MeOH fraction (TA2) inhibited more than 75% of NO production at 30 ㎍/mL; cytotoxicity was very low even at 50 ㎍/mL. In conclusion, by selective solvent selection, it was possible to manufacture an extract with no cytotoxicity and excellent biological activities. Furthermore, the extracts showed potential for developing various functional foods and drugs.
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문제 정의
본 연구에서는 계종버섯 자실체로부터 혼합용매추출과 열수추출을 통하여 추출물을 확보하고 분리단계별 분획물의 항산화 활성과 항염증 활성을 조사하여 활성이 풍부한 분획물을 선별하여 차후 활성물질을 순수 분리하는과정과 이를 이용한 제품개발의 기초자료로 활용하고자한다.
계종버섯은 중국에서 맛과 향에서 최고의 버섯으로 평가받고 있으며, 본초강목에 그 효능이 기록되어 전해지고있으나 효능과 물질연구 및 인공재배법 개발이 요구되고 있는 상황이다. 항산화 활성과 항염증 활성을 가지는 기능성 물질의 확보와 기능성식품 개발을 위한 기초자료를 확보하기 위하여 유기용매 추출물과 열수 추출물을 제조하고, 활성이 높은 분획물을 얻고자 하였다. CH2Cl2와 MeOH 혼합용매로 추출한 다음 비극성용매와 극성용매로서 용해성에 따라 분획하고, 열수 추출로 추출물을 확보하였다.
제안 방법
얻어진 fraction의 분리 패턴을 알아보기 위하여 TLC를 실시하여 Rf 값이 비슷한 물질을 그룹으로 하 여 10개의 그룹으로 나눠 회수하고, 세포 실험과 항산화 활성 확인 실험을 실시하였다. 10개 그룹 물질 중에 1번그룹 회수물에서 항염증 활성이 나타나 NP-TLC 를 실시하여 2차 분리를 실시하였다. Hexane과 EtOAc 혼합 용매로 전개를 실시한 다음 TA1물질을 분리하는 법과 같이실시하여 9개 밴드로 분리하여 항염증 활성을 확인하였다.
TA1 물질은 TLC법으로 1차 분리를 실시하고, short wave(254 nm)와 long wave(365 nm)에 흡광하는 특성에 따라 9개 밴드로 분리하였으며, 활성이 확인된 물질은 2차 TLC를 실시하였다. 2차 TLC에서도 1차 TLC와 같은 방법으로 물질을 확인한 후 10개의 밴드로 물질을 분리하여 항염증 활성을 조사하였다.
ABTS 라디칼을 이용한 항산화능의 측정은 potassium persulfate와의 반응에 의해 생성된 ABTS 자유 라디칼이 추출물에 의해 제거되어 라디칼 특유의 색인 청록색이 탈색되는 것을 이용한 방법으로 Kang(2012)과 Park 등(2011)의 방법을 변형하여 측정하였다. 7 mM ABTS 용액에 potassium persulfate를 2.
항산화 활성과 항염증 활성을 가지는 기능성 물질의 확보와 기능성식품 개발을 위한 기초자료를 확보하기 위하여 유기용매 추출물과 열수 추출물을 제조하고, 활성이 높은 분획물을 얻고자 하였다. CH2Cl2와 MeOH 혼합용매로 추출한 다음 비극성용매와 극성용매로서 용해성에 따라 분획하고, 열수 추출로 추출물을 확보하였다. 분획물과 추출물을 이용한 항산화 활성 조사에서는 열수 추출물(TA4)의 DPPH 라디칼 소거능에 대한 IC50값이 1.
10개 그룹 물질 중에 1번그룹 회수물에서 항염증 활성이 나타나 NP-TLC 를 실시하여 2차 분리를 실시하였다. Hexane과 EtOAc 혼합 용매로 전개를 실시한 다음 TA1물질을 분리하는 법과 같이실시하여 9개 밴드로 분리하여 항염증 활성을 확인하였다.
추출물을 용해도에 따라 분획한 다음, 크로마토그래피법을 이용하여 항산화 활성 물질과 항염증 활성 물질을 분리하기 위하여 Silica gel을 사용한 column chromatography와 TLC를 실시하였다. TA1 물질은 TLC법으로 1차 분리를 실시하고, short wave(254 nm)와 long wave(365 nm)에 흡광하는 특성에 따라 9개 밴드로 분리하였으며, 활성이 확인된 물질은 2차 TLC를 실시하였다. 2차 TLC에서도 1차 TLC와 같은 방법으로 물질을 확인한 후 10개의 밴드로 물질을 분리하여 항염증 활성을 조사하였다.
TA2-1의 경우 세포에 대한 독성이 거의 없을 것으로 예상되는 50 µg/mL의 농도에서 음성대조군과 비슷한 정도까지 NO 생성을 억제하는 것을 확인하였으며, 추가적인 TLC 분리를 통하여 활성 물질을 탐색을 진행하였다.TA2-1의 2차 분획을 위한 TLC는 hexane과 EtOAc(1:3) 조건으로 전개를 하고, UV short/long wave에 흡광을 나타내는 물질을 기준으로 9개 band로 나누어 회수를하였다. 회수한 band는 EtOAc로 용출시켜 TA2-1-1~TA2-1-9로 명명하고, 항염증 활성과 세포 독성을 조사하였다.
TA2-1의 경우 세포에 대한 독성이 거의 없을 것으로 예상되는 50 µg/mL의 농도에서 음성대조군과 비슷한 정도까지 NO 생성을 억제하는 것을 확인하였으며, 추가적인 TLC 분리를 통하여 활성 물질을 탐색을 진행하였다.
TA2column 회수물질 10종의 RAW 264.7 세포에 대한 독성을 조사한 결과, 전체적으로 100 µg/mL의 농도까지는 농도 의존적인 독성이 나타나지는 않았지만 TA2-1에서만 농도의존적인 독성이 나타나서 NO 생성량 확인을 위한 실험을 위한 처리 농도를 시료 10 종 모두 50, 100 µg/mL로 조절하여서 실험을 진행하였다(Fig. 5A).
용매분획물 TA1로부터 물질을 분리하기 위하여 1차TLC를 실시하였으며, TLC전개 후 UV short/long wave에 흡광을 나타내는 특성에 따라 9개 band로 구분할 수있었다. 각 band의 물질은 EtOAc와 MeOH로 용출하였으며, 각각 TA1-1~TA1-9로 명명하고 항산화 활성과 항염증활성 측정을 위해 사용하였다. TA1의 경우 TLC 분리 전 용매분획물의 세포 독성을 확인하였을 때, 50 µg/mL 농도에서 세포 생육을 20%정도 저해하였다(Fig.
2차 TLC에서도 UV short/long wave에 흡광을 나타내 는 것을 기준으로 10개 band로 구분하여 회수하였다. 각 band의 물질을 용출해서 각각 TA1-5-1~TA1-5-10으로 명명하고, 항염증 활성을 조사하기 위해 사용하였다. 세포에 대한 TA1-5-1~TA1-5-10 분획물의 독성을 확인하였을 때, 50 µg/mL 농도까지는 10종의 분획물 모두 독성을 거의 보이지 않아서(Fig.
계종버섯 추출물 및 분획물의 항염증 효과를 확인하기위하여 LPS에 의하여 자극된 RAW 264.7 대식세포에서생성되는 nitric oxide의 배지 내 농도를 Griess 반응을 이용하여 측정하였다(Kim et al, 2016). 실험을 위하여RAW 264.
계종버섯 추출물의 라디칼 소거능을 측정하기 위해DPPH 라디칼 소거능 측정은 Kim 등(2014)의 방법을 변형하여 측정하였다. 양성대조군은 ascorbic acid를 0.
계종버섯으로부터 물질을 추출하기 위하여 유기용매추출과 열수추출을 실시하였다. 유기용매 추출은 계종버섯25 g에 CH2Cl2와 MeOH 혼합용매 250 mL를 넣고, 초음파 추출기로 3회 반복 추출을 실시하였다.
계종버섯의 용매분획물과 열수 추출물을 사용하여 RAW264.7 대식세포에 대한 세포 독성과 항염증 활성을 조사하였다. 각 추출물의 세포 독성을 확인한 결과, H2O 분획물(TA3)과 열수 추출물(TA4)에서는 200 µg/mL까지의 농도에서도 세포독성을 나타내지 않았지만 EtOAc 분획물(TA1)과MeOH 분획물(TA2)에서는 농도가 증가 할수록 강한 독성을나타냈다.
따라서 TA1물질을 TLC로 분리한 물질들의 세포 독성을 확인하기 위하여 일차적으로 100, 200 µg/mL의 농도로 처리하여 독성을 다시 확인하였고, 독성이 있는 분획물의 경우 25 µg/mL와 50 µg/mL 농도까지 낮춰서 실험을 진행하였다.
따라서 항염증 활성 측정을 위한 NO 생성량확인에서 물질의 농도를 일차적으로 25 µg/mL 농도와 50µg/mL 농도로 처리하였다.
)을 암조건에서 처리하여 15분간 상온에서 반응하였다.반응이 끝난 후, 540 nm에서의 흡광도를 microplate reader(Molecular Devices)를 이용하여 측정하였고, NaNO2 standard를 이용하여 NO 생성량을 확인하였다. 음성대조군은 LPS와 추출물을 처리하지 않았고, 양성대조군은LPS만 처리하여 NO 생성량을 확인함으로서 추출물의 항염증 활성을 비교하였다.
, Seoul, Korea)을 10% 각 well에 처리하고 37oC에서 2시간을 배양하여 반응시켰다. 반응이 완료된 후, microplate reader(Molecular Devices, LLC, Sunnyvale,CA, USA)를 이용하여 460 nm의 파장에서 흡광도를 측정함으로서 추출물을 처리하지 않은 대조군과의 생존률을비교하여 수치화 하였다
배양된 세포에 추출물을 최종 농도(0, 25, 50, 100, 200 µg/mL)로 세포에 처리하여24시간 동안 추가로 배양하였다.
TA2로부터 항염증 물질 분리
분획물 TA2로부터 물질을 분리하기 위하여 1차column chromatography를 실시하여 58개의 fraction을 얻었으며, 물질 분리를 확인하기 위하여 TLC로 전개하고,Rf 값이 비슷한 물질들로 10개의 group으로 나누어 회수하였다. 회수한 10개의 group물질들을 TA2-1~TA2-10으로명명하고, 세포 독성 및 항염증활성을 조사하였다.
분획물의 RAW 264.7 세포에 대한 독성을 확인하였을 때, 대부분 분획물에서 50 µg/mL 농도까지는 독성이 나타나지 않았으나, TA2-1-2에서는 약간의 세포 독성을 나타내어 NO 생성량 확인을 위한 실험에서 처리 농도를 15, 30 µg/mL로 조절하여 처리하였다 (Fig. 6A).
세포에 대한 TA1-5-1~TA1-5-10 분획물의 독성을 확인하였을 때, 50 µg/mL 농도까지는 10종의 분획물 모두 독성을 거의 보이지 않아서(Fig. 4A) NO 생성량 확인 실험을 위한 농도를 15, 30 µg/mL로 조절하여 처리하여 NO 생성량을확인하였다.
실험을 위하여RAW 264.7 세포를 24-well plate에 5×104cells/well이 되도록 분주하고 22시간 배양한 후 버섯 추출물을 다양한농도(0, 15, 25, 30, 50, 100, 200 µg/mL)로 2시간 전처리하였다.
용출 용매는 EtOAc와 MeOH 혼합용매로서 순차적으로 극성을 높여가며 58개의 fraction을 얻었다. 얻어진 fraction의 분리 패턴을 알아보기 위하여 TLC를 실시하여 Rf 값이 비슷한 물질을 그룹으로 하 여 10개의 그룹으로 나눠 회수하고, 세포 실험과 항산화 활성 확인 실험을 실시하였다. 10개 그룹 물질 중에 1번그룹 회수물에서 항염증 활성이 나타나 NP-TLC 를 실시하여 2차 분리를 실시하였다.
유기용매 추출은 계종버섯25 g에 CH2Cl2와 MeOH 혼합용매 250 mL를 넣고, 초음파 추출기로 3회 반복 추출을 실시하였다. 열수 추출을 위하여 버섯자실체를 완전 건조한 다음, H2O 300 mL를 넣고 열수환류추출을 반복 실시하여 열수 추출물을 얻었다. 혼합유기용매 추출물은 농축을 한 다음, EtOAc, MeOH, H2O를 사용하여 용해성에 따라 농축물을 분획하여, 각각 TA1, TA2, TA3로 명명하고, 열수 추출물은 TA4로 명명하여 항산화 활성과 항염증 활성 및 세포독성을 조사하였다.
용매분획물 TA1로부터 물질을 분리하기 위하여 1차TLC를 실시하였으며, TLC전개 후 UV short/long wave에 흡광을 나타내는 특성에 따라 9개 band로 구분할 수있었다. 각 band의 물질은 EtOAc와 MeOH로 용출하였으며, 각각 TA1-1~TA1-9로 명명하고 항산화 활성과 항염증활성 측정을 위해 사용하였다.
계종버섯으로부터 물질을 추출하기 위하여 유기용매추출과 열수추출을 실시하였다. 유기용매 추출은 계종버섯25 g에 CH2Cl2와 MeOH 혼합용매 250 mL를 넣고, 초음파 추출기로 3회 반복 추출을 실시하였다. 열수 추출을 위하여 버섯자실체를 완전 건조한 다음, H2O 300 mL를 넣고 열수환류추출을 반복 실시하여 열수 추출물을 얻었다.
반응이 끝난 후, 540 nm에서의 흡광도를 microplate reader(Molecular Devices)를 이용하여 측정하였고, NaNO2 standard를 이용하여 NO 생성량을 확인하였다. 음성대조군은 LPS와 추출물을 처리하지 않았고, 양성대조군은LPS만 처리하여 NO 생성량을 확인함으로서 추출물의 항염증 활성을 비교하였다.
이때 TA1-3과 TA1-5 분획물에서는 25 µg/mL의 농도에서 음성대조군 정도로 NO 생성이 확인되지 않아, 두 물질에 대해서는 10, 20 µg/mL로농도를 더욱 낮춰서 NO 생성량 확인을 진행하였다.
이후 EZ-cytox CellViability Assay Solution WST-1®(Daeil Lab Service Co. Ltd., Seoul, Korea)을 10% 각 well에 처리하고 37oC에서 2시간을 배양하여 반응시켰다.
0 g의 조추출물을 얻었다. 조추출물은 비극성물질에서부터 극성물질까지 혼재되어 있는 상태이므로 농축한 다음, EtOAc와 MeOH 그리고 H2O을 이용하여 극성과 용해성에 따라 물질을 분획하였다. 용매분획물을 농축하여 EtOAc 분획물(TA1)은 2.
추출물을 용해도에 따라 분획한 다음, 크로마토그래피법을 이용하여 항산화 활성 물질과 항염증 활성 물질을 분리하기 위하여 Silica gel을 사용한 column chromatography와 TLC를 실시하였다. TA1 물질은 TLC법으로 1차 분리를 실시하고, short wave(254 nm)와 long wave(365 nm)에 흡광하는 특성에 따라 9개 밴드로 분리하였으며, 활성이 확인된 물질은 2차 TLC를 실시하였다.
3B). 특히 TA1-5 분획물의 경우 독성이 없는 낮은 농도에서 가장 강한 항염증 활성을나타냈기에, TLC를 이용한 2차 분획을 진행하여 세포 독성과 항염증 활성을 조사하였다.
특히 TA2의 경우 100 µg/mL까지의 농도에서는 세포에 대한 독성도 낮게 나타나므로, 활성 분획의 정제와분리에 의하여 독성은 더 낮고 항염증 활성은 높은 분획물을 확보할 수 있을 것으로 판단되어 TA1과 TA2 추출물에 대한 분획을 진행하여 추가적으로 항산화 활성과 항염증 활성 확인을 진행하였다.
열수 추출을 위하여 버섯자실체를 완전 건조한 다음, H2O 300 mL를 넣고 열수환류추출을 반복 실시하여 열수 추출물을 얻었다. 혼합유기용매 추출물은 농축을 한 다음, EtOAc, MeOH, H2O를 사용하여 용해성에 따라 농축물을 분획하여, 각각 TA1, TA2, TA3로 명명하고, 열수 추출물은 TA4로 명명하여 항산화 활성과 항염증 활성 및 세포독성을 조사하였다. 용해분획물들은 광을 차단하고 냉장 온도에서 보관하며 실험에 사용하였다.
분획물 TA2로부터 물질을 분리하기 위하여 1차column chromatography를 실시하여 58개의 fraction을 얻었으며, 물질 분리를 확인하기 위하여 TLC로 전개하고,Rf 값이 비슷한 물질들로 10개의 group으로 나누어 회수하였다. 회수한 10개의 group물질들을 TA2-1~TA2-10으로명명하고, 세포 독성 및 항염증활성을 조사하였다. TA2column 회수물질 10종의 RAW 264.
TA2-1의 2차 분획을 위한 TLC는 hexane과 EtOAc(1:3) 조건으로 전개를 하고, UV short/long wave에 흡광을 나타내는 물질을 기준으로 9개 band로 나누어 회수를하였다. 회수한 band는 EtOAc로 용출시켜 TA2-1-1~TA2-1-9로 명명하고, 항염증 활성과 세포 독성을 조사하였다. 분획물의 RAW 264.
대상 데이터
DPPH(2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl), ABTS(2,2’- azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid))는 SigmaAldrich(St. Louis, MO, USA) 제품이며, potassium persulfate는 Junsei Chemical(Tokyo, Japan) 제품을 사용하였다.
(Manassas, VA, USA)에서 구입하여 사용하였다. Lipopolysaccharide (LPS)는 Sigma-Aldrich사에서 구입하여 사용하였다. 그외의 모든 시약은 분석용 특급 시약을 사용하였다.
용매추출 이후 잔여 버섯자실체에서는 열수 추출을 통하여추출물(TA4)을 얻었다. MeOH 분획물의 함량이 가장 많았고(Table 1), 각 분획물과 열수 추출물은 냉장 보관하면서 물질 분리와 assay의 시료로 사용하였다.
건조한 계종버섯 250 g을 사용하여 CH2Cl2와 MeOH혼합용매로 3회 반복 추출하여 57.0 g의 조추출물을 얻었다. 조추출물은 비극성물질에서부터 극성물질까지 혼재되어 있는 상태이므로 농축한 다음, EtOAc와 MeOH 그리고 H2O을 이용하여 극성과 용해성에 따라 물질을 분획하였다.
7 대식세포는 DMEM에 10%의 heat-inactivated된 FBS와 1%의 penicillin-streptomycin solution을 첨가한배지를 사용하여 배양하였다. 세포는 37o C에서 5%의 CO2가 유지되는 습한 환경에서 배양하였으며, 매일 신선한 배지로 교체하고 계대배양을 통하여 안정화시켜 실험에 사용하였다.
실험에 사용된 시료는 (주)힘찬에서 재배한 계종버섯 (Termitomyces albuminosus)이며(Fig. 1), 해당균주는 농촌진흥청 버섯과에 기탁, 보존(KMCC04978) 하였다. 추출과 분리에 사용한 용매는 dichloromethane(CH2Cl2),ethyl acetate(EtOAc), methanol(MeOH) 등을 사용하였고, 분리 정제를 위해서 column chromatography와 thin layer chromatography(TLC)법을 이용하였다.
TA2 물질은 순상 silica column chromatography법으로 1차 분리를 실시하였다. 용출 용매는 EtOAc와 MeOH 혼합용매로서 순차적으로 극성을 높여가며 58개의 fraction을 얻었다. 얻어진 fraction의 분리 패턴을 알아보기 위하여 TLC를 실시하여 Rf 값이 비슷한 물질을 그룹으로 하 여 10개의 그룹으로 나눠 회수하고, 세포 실험과 항산화 활성 확인 실험을 실시하였다.
추출물 및 분획물의 세포독성과 항염증 활성을 측정하기 위한 세포주로는 쥐에서 유래한 대식세포 RAW264.7 세포를 한국세포주은행(KCLB; Seoul, Korea)에서 분양받아 사용하였다. 세포 배양을 위한 Dulbecco‘s ModifiedEagle Medium(DMEM), fetal bovine serum(FBS), penicillin-streptomycin solution은 Corning Inc.
데이터처리
실험의 측정결과는 Mean±Standard Deviation(SD)로 나타냈으며, 각 실험군 사이의 통계학적 유의성 검정은Prism 5.0 software(GraphPad Software, Inc., La Jolla,CA, USA)를 이용하여 One way ANOVA with Dunnett’smultiple comparison test를 실시하여 p값이 0.05 미만인경우 유의성이 있는 것으로 평가하였다.
이론/모형
TA2 물질은 순상 silica column chromatography법으로 1차 분리를 실시하였다. 용출 용매는 EtOAc와 MeOH 혼합용매로서 순차적으로 극성을 높여가며 58개의 fraction을 얻었다.
계종버섯 추출물 및 분획물의 세포에 대한 독성을 확인하기 위하여 WST-1®assay를 이용하여 세포의 생존률을측정하였다(Shan et al., 2009).
1), 해당균주는 농촌진흥청 버섯과에 기탁, 보존(KMCC04978) 하였다. 추출과 분리에 사용한 용매는 dichloromethane(CH2Cl2),ethyl acetate(EtOAc), methanol(MeOH) 등을 사용하였고, 분리 정제를 위해서 column chromatography와 thin layer chromatography(TLC)법을 이용하였다. Open columnchromatography에는 normal phase silica gel(230~400mesh, Merck, Germany)을 사용하였으며, TLC는 Merck25 DC-Alufolien Kieselgel 60 F254(20×20 cm, 0.
이는 희석 배수를 높여 측정하여 추가적으로 확인하면 측정할 수 있을 것으로 사료된다.EtOAc 분획물(TA1) 과 H2O 분획물(TA3)의 ABTS 라디칼 소거능은 약 0.9 mg/mL로 나타났다. 같은 시료임에도 측정법에 따라 항산화 활성 결과 값이 다르게 나타나는이유는 DPPH는 자유 라디칼이고 ABTS는 양이온 라디칼이라는 것과 함유되어 있는 페놀물질의 종류도 다르기때문에 기질에 결합하는 정도의 차이에 의해 결과 값이다른 것으로 판단된다(Choi and Ryu, 2015; Wang et al.
Figure 3B에서 확인할 수 있듯이, TA1 분획물 9종 모두NO 농도의존적으로 NO 생성을 억제하는 항염증 활성을가지는 것을 확인하였으며, 특히 TA1-3과 TA1-5 물질의경우 10 µg/mL 농도와 20 µg/mL 농도로 처리하였을 때각각 62, 92%와 76.3, 99%의 NO생성을 억제하는 높은항염증 활성을 보였다(Fig. 3B).
NO생성 억제율로 조사한 항염증 활성은 EtOAc 분획물(TA1)은 조추출물 이지만 100 µg/mL 처리농도에서는 79% NO생성 이 억제되고, 200 µg/mL 농도에서는 NO가 전혀 생성되지 않았다.
TA1 물질을 2차례 TLC로 분리한 TA1-5-6물질은 15 µg/mL 처리농도에서 대조구와 비교하여 NO생성 이 86% 억제되었고, 30 µg/mL 농도에서는 NO 생성이 완전히 억제되었다.
TA3와 TA4에서는 항염증 활성이 거의 나타나지 않았으나, TA1과 TA2에서는 세포 독성이 크게 나타나지 않은 50, 100 µg/mL의농도에서 각각 63, 79%와 56, 73%의 NO 생성 억제 활성을 나타내는 뛰어난 항염증 효과를 나타내었다(Fig. 2B).
각 추출물의 세포 독성을 확인한 결과, H2O 분획물(TA3)과 열수 추출물(TA4)에서는 200 µg/mL까지의 농도에서도 세포독성을 나타내지 않았지만 EtOAc 분획물(TA1)과MeOH 분획물(TA2)에서는 농도가 증가 할수록 강한 독성을나타냈다.
그 결과 50 µg/mL까지의 처리 농도에서는 모든분획물이 세포 독성을 전혀 나타내지 않는 것을 확인하였다(Fig. 3A).
CH2Cl2와 MeOH 혼합용매로 추출한 다음 비극성용매와 극성용매로서 용해성에 따라 분획하고, 열수 추출로 추출물을 확보하였다. 분획물과 추출물을 이용한 항산화 활성 조사에서는 열수 추출물(TA4)의 DPPH 라디칼 소거능에 대한 IC50값이 1.5 mg/mL로 나타났고, MeOH 분획물(TA2)에서는 IC50값이 1.93 mg/mL로 높게 나타났다. NO생성 억제율로 조사한 항염증 활성은 EtOAc 분획물(TA1)은 조추출물 이지만 100 µg/mL 처리농도에서는 79% NO생성 이 억제되고, 200 µg/mL 농도에서는 NO가 전혀 생성되지 않았다.
MeOH 분획물(TA2) 유래의 TA2-1-5물질은 30 µg/mL 처리농도에서 75% 이상 NO생성이 억제되었으며, 세포 독성은 50 µg/mL에서도 아주 낮게 나타났다. 선택적 용매의 선별과 추출 방법의 개발을 통하여 세포 독성이 없고, 생리활성이 뛰어난 계종버섯 분획물 확보가 가능하였고, 기능성식품 및 건강 기능성소재로서의 충분한 잠재력을 확인할 수 있었다.
특히 TA2-1-5물질의 경우 30 µg/mL 농도에서 양성대조군 대비 75% 이상 NO 생성이 억제되는 것을 확인하였다(Fig. 6B).
4A) NO 생성량 확인 실험을 위한 농도를 15, 30 µg/mL로 조절하여 처리하여 NO 생성량을확인하였다. 항염증 활성 결과를 확인하였을 때, 10종의분획물 중 TA1-5-1을 제외한 9종의 분획물 모두 농도에따른 NO 생성 억제 효과를 나타내었다. 특히 TA1-5-6 물질의 경우 15 µg/mL 농도로 처리한 곳의 NO 생성 억제활성은 양성대조군과 비교하여 86% 억제하는 높은 항염증 활성을 나타내었다(Fig.
6A). 항염증 활성을 확인하였을 때, TA2-1-7, TA2-1-8, TA2-1-9를 제외한 나머지 6개 분획물에서는 농도의존적으로 NO 생성을 억제하는 것을 확인하였다. 특히 TA2-1-5물질의 경우 30 µg/mL 농도에서 양성대조군 대비 75% 이상 NO 생성이 억제되는 것을 확인하였다(Fig.
후속연구
TA2-1-5 물질은 50 µg/mL 농도에서 세포 독성이 거의 없는 것을 확인하였고, 항염증 활성 분획물로 가치가 있고, 순수 분리가 이루어지면 더 높은 활성을 기대할 수 있을 것이다.
, 2016), 버섯시장의 침체로 생산농가의 어려움이 가중 되고 있다. 버섯시장의 활성화를 위해서는 국내에서 식용 버섯으로 많이 생산되는 양송이버섯, 표고버섯, 느타리버섯 및 팽이버섯 등에만 집중할 것이 아니라 기호성과 기 능성이 뛰어난 새로운 품종을 찾거나 품종개량이 필요하며, 원가절감과 기능성 성분의 함량을 높일 수 있는 새로운 배지원을 개발하는 등의 인공재배법 개발도 절실히 요구된다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
버섯시장의 활성화 어떻게 해야하나?
, 2016), 버섯시장의 침체로 생산농가의 어려움이 가중 되고 있다. 버섯시장의 활성화를 위해서는 국내에서 식용 버섯으로 많이 생산되는 양송이버섯, 표고버섯, 느타리버섯 및 팽이버섯 등에만 집중할 것이 아니라 기호성과 기 능성이 뛰어난 새로운 품종을 찾거나 품종개량이 필요하며, 원가절감과 기능성 성분의 함량을 높일 수 있는 새로운 배지원을 개발하는 등의 인공재배법 개발도 절실히 요구된다.
계종버섯은 무엇인가?
계종버섯은 중국에서 맛과 향에서 최고의 버섯으로 평가받고 있으며, 본초강목에 그 효능이 기록되어 전해지고 있으나 효능과 물질연구 및 인공재배법 개발이 요구되고 있는 상황이다. 항산화 활성과 항염증 활성을 가지는 기능성 물질의 확보와 기능성식품 개발을 위한 기초자료를 확보하기 위하여 유기용매 추출물과 열수 추출물을 제조하고, 활성이 높은 분획물을 얻고자 하였다.
계종버섯은 현재 어디에서 재배되는가?
, 2012)가 보고되어 있다. 그러나 계종버섯은 배지를 이용한 인공재배 기술이 개발되어 있지 않아 생산에 어려움이 있으며, 현재는 사질토양에서 재배되고 있어 수확 후 갓 부분의 모래 제거가 쉽지않아 섭취 시 모래가 씹히는 경향이 있어 선 호도에 큰 걸림돌이 되고 있다. 최근 국내연구진에 의해 계종버섯의 독성연구에서 그 안정성이 확인되었기에(An et al.
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