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문제 정의
- 山茱萸는 補益肝腎의 효능이 있어 노인, 만성질환에 빈용되는 약물로 골다공증 억제 효과에 대한세포 및 동물 모델 연구는 활발히 진행 중이나, 골관절염에 대한 효과는 실험적 연구를 통해 밝혀진바가 없다. 이에 본 연구는 MIA로 골관절염을 유발한 rat 모델에서 산수유 물추출물을 경구 투여하여 관절 조직의 항산화 및 항염증 효과를 관찰한후 유의한 결과를 얻었기에 보고하는 바이다.
제안 방법
- MIA로 유발 7일 후 뒷다리 체중 부하 검사를 통해 골관절염이 유발된 실험동물을 각 군당 8마리씩4그룹으로 구분하여 실험을 진행하였다. 실험군은골관절염을 유발하지 않은 정상군(Normal), 골관절염 유발 후 증류수를 투여한 대조군(Control), 골관절염 유발 후 indomethacin을 5 mg/kg로 경구 투여한 양성대조군(INDO), 골관절염 유발 후 CFW를 200 mg/kg로 경구 투여한 CFW군(CFW)으로 약물은 2주간 존대(Zonde)를 이용하여 투여하였다.
- 뒷다리 체중 부하는 MIA로 골관절염을 유발하기 7일 전(-1 week), 유발 후 7일(0 week), 14일(1 week),21일(2 weeks) 총 4번을 측정하였다. Incapacitancetester(Ser No.
- 뒷다리 체중 부하는 골관절염을 유발하기 7일전(-1 week), 유발 후 7일(0 week), 14일(1 week),21일(2 weeks) 총 4번을 측정하였다. 정상군의 뒷다리 체중 부하 비율을 100으로 하였을 때, 각 군의 상대적 뒷다리 체중 부하의 변화를 측정한 결과.
- 또한 노화과정에서 염증반응이 지속적으로 일어나면서 iNOS유도에 따른 NO의 대량 생성이 ONOO-의 생성을더욱 증가시켜 세포 및 조직 손상을 가져오게 되며 특히 ONOO-의 독성은 NO와 ·O2-보다 더 강한것으로 알려져 있다35. 본 연구에서는 골관절염의증상을 악화시킬 수 있는 산화적 스트레스 바이오마커인 ROS와 ONOO-를 측정하여 항산화 활성에대한 산수유 물추출물의 효과를 관찰하였다. ROS와 ONOO-는 INDO군과 CFW군 모두에서 유의성있게 감소하여 산수유 물추출물이 산화적 스트레스를 효과적으로 억제함으로써 세포를 보호하고관절연골의 염증 및 손상의 진행을 방어하는 것으로 생각된다.
- 본 연구에서는 산수유의 골관절염에 대한 염증억제 효과를 과학적으로 검증하기 위하여 MIA로 골관절염을 유발 후 2주 동안 산수유 200 mg/kg/day를 투여한 후 체중부하 측정, 혈액 분석 및 관절조직 내 단백질 발현량을 분석한 결과, 다음과 같은 결론을 얻었다.
- 한의학에서 골관절염은 鶴膝風, 痺證, 歷節風, 脚氣 등의 범주로 보았으며, 그 원인을 風寒濕 등의 外邪로 인하여 氣血運行이 阻閉된 外因과, 노화에 따라 肝腎衰弱하여 傷骨한 內因으로 분류하여 補肝腎陰虛 및 破瘀血을 위주로 치료한다28. 산수유는 노화에 의한 각종 질병 치료 처방에 빈용되는 구성 약재이며 장기 복용할수록 효과가 큰 것으로 알려져 퇴행성질환인 골관절염 예방 및 치료에 효과적일 것으로 판단되었기에 염증성 관절손상 동물모델을 이용하여산수유 물추출물의 염증 억제 효과를 분석하였다.
- MIA로 유발 7일 후 뒷다리 체중 부하 검사를 통해 골관절염이 유발된 실험동물을 각 군당 8마리씩4그룹으로 구분하여 실험을 진행하였다. 실험군은골관절염을 유발하지 않은 정상군(Normal), 골관절염 유발 후 증류수를 투여한 대조군(Control), 골관절염 유발 후 indomethacin을 5 mg/kg로 경구 투여한 양성대조군(INDO), 골관절염 유발 후 CFW를 200 mg/kg로 경구 투여한 CFW군(CFW)으로 약물은 2주간 존대(Zonde)를 이용하여 투여하였다.
- 실험동물의 오른쪽 무릎 주변의 털을 깨끗이 제모한 후, 0.9% saline으로 희석한 MIA를 0.3 mlinsulin 주사기(BD 31 G Ultra-Fine Ⅱ, USA)를 사용하여 오른쪽 무릎 관절강 내에 50 μl(80 mg/mL)씩 주입하여 골관절염을 유발하였다.
대상 데이터
- 7주령의 Sprague-Dawley(SD)계 체중 180~220 g의 수컷 흰쥐를 하나바이오테크(경기, 한국)에서 구입하여, 물과 고형사료(조단백질 18% 이상, 칼륨0.55% 이상, 조지방 5.0% 이상, 조회분 8.0% 이하, 칼슘 1.0% 이상, 인 0.85% 이상, 나트륨 0.25% 이상,조섬유 5.0% 이하, 마그네슘 0.15% 이상 NIH-41, Zeigler Bros, Inc., USA)를 충분히 공급하며 1주일간 실험실 환경에 적응시킨 후 실험에 사용하였다. 동물 사육실의 조건은 conventional system으로 명암주기는 12시간 주기, 온도 22±2 ℃, 습도 50±5%로 조절하였다.
- 본 실험에 사용한 山茱萸는 옹기한약국(대구, 한국)에서 구입하여 대구한의대 본초약리학교실에서 정선, 감별하여 사용하였다. 山茱萸 300 g에 10배수의 증류수 3 L를 가하여 열탕 추출기를 사용하여 2시간 열수 추출을 시행하였다.
데이터처리
- 모든 수치는 평균과 표준편차(mean±SD)로 표시하였으며, SPSS(Version 22.0, IBM, Armonk, NY,USA)를 사용하여 one-way analysis of variance(ANOVA) test를 실시한 후 least-significant differences(LSD) test로 사후검증을 실시하여 각 군의 평균차이에 대한 통계적 유의성을 p-value<0.05에서 검증하였다.
이론/모형
- 26 방법을 이용하여 ROS를 측정하였으며25 mM DCF-DA를 혼합한 후, 형광 광도계를 이용하여 0분부터 매 10분씩 emission wavelength of530 nm와 excitation wavelength of 486 nm를 이용하여 30분간 측정한 산출 값을 계산하였다. 관절조직의 ONOO- 측정을 위해 Kooy et al.27) 방법을 이용하여 측정하였다.
성능/효과
- 1. 체중부하 측정 시 정상군에 비해 대조군에서 유의하게 상승하였으며, 산수유 투여로 인해 유의하게 감소하였다.
- 2. 산수유 투여는 관절 조직 내 산화적 스트레스마커인 ROS와 ONOO-를 대조군에 비해 유의하게 감소시켰다.
- 3. 산수유 투여군은 Catalase와 GPx-1/2와 같은 항산화 효소 단백질을 유의하게 증가하였다.
- 4. 산수유 투여는 NF-κB의 활성을 유의하게 억제시켰으며 이는 염증성 매개인자인 COX-2를 유의하게 감소시켰고, IL-6와 IL-1β 같은 염증성사이토카인을 유의하게 감소시켰다.
- 본 연구에서는 골관절염의증상을 악화시킬 수 있는 산화적 스트레스 바이오마커인 ROS와 ONOO-를 측정하여 항산화 활성에대한 산수유 물추출물의 효과를 관찰하였다. ROS와 ONOO-는 INDO군과 CFW군 모두에서 유의성있게 감소하여 산수유 물추출물이 산화적 스트레스를 효과적으로 억제함으로써 세포를 보호하고관절연골의 염증 및 손상의 진행을 방어하는 것으로 생각된다.
- 먼저 MIA로 골관절염을 유발하여 뒷다리 체중부하를 검사한 결과 관절 손상 후 정상군 대비 3개 그룹에서 모두 유의하게 증가하였다가 약물 투여2주 후 대조군에 비해 INDO군과 CFW군에서 유의하게 감소되는 것을 확인하였다. 이는 연골 손상으로 인해 하체의 중심이 관절염이 유발되지 않은 건측으로 기울어지는 것을 이용하여 건측 체중부하가 감소함으로써 관절염을 유발한 환측 다리로의 체중 지지가 증가한 것을 관찰하는 방법으로 손상받은 관절의 통증이 완화되었음을 의미한다.
- 즉,NF-ĸB는 염증매개 cytokine의 발현에 중요한 역할을 담당하는 경로로 알려져 있으며39,40, NF-ĸB의활성 억제와 cytokine의 생성 억제는 염증성 관절염 치료와 예방에 있어 중요한 부분이 된다. 본 연구에서는 NF-ĸB의 활성을 억제함으로 인해 염증성 매개인자인 COX-2의 발현을 유의하게 억제시켰으며 염증성 사이토카인인 IL-1β, IL-6의 생성이 산수유 투여에 의해 유의하게 감소하였다. 특히NF-ĸB의 활성 억제는 INDO군보다 CFW군에서 더 효과적으로 억제되는 것을 확인하였다.
- 이상의 결과들로 보아 산수유는 골관절염 동물모델에서 산화적 스트레스 및 항산화 효소 단백질을 상승시켜 항산화 효과를 발휘하였으며 NF-κB비활성을 통한 염증인자들을 억제함으로서 골관절염에서의 관절 보호 효과를 발휘하는 것으로 나타났다. 이는 산수유가 골관절염 치료를 위한 소재로 적극 활용될 수 있음을 시사하고 있다.
- 이와 같은 결과를 종합하여 볼 때 산수유 추출물은 NF-ĸB의 활성 억제를 통한 염증성 단백질의발현을 감소시켜 골관절염의 염증 개선 및 연골파괴의 진행을 억제하였으며 이는 골관절염의 통증 감소와 회복을 도운 것으로 판단되어지며 또한, 항산화효소 단백질의 증가를 통해 산화적 스트레스를 감소시켜 관절 보호 효과를 발휘하는 것으로 사료된다.
- 본 연구에서는 NF-ĸB의 활성을 억제함으로 인해 염증성 매개인자인 COX-2의 발현을 유의하게 억제시켰으며 염증성 사이토카인인 IL-1β, IL-6의 생성이 산수유 투여에 의해 유의하게 감소하였다. 특히NF-ĸB의 활성 억제는 INDO군보다 CFW군에서 더 효과적으로 억제되는 것을 확인하였다.
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