[논문]살 오징어(Todarodes pacificus) 간췌장 유래 한외여과 Aminopeptidase Retentate Fraction의 특성과 쓴맛 개선효과

김진수; 이정석; 윤인성; 강상인; 박선영; 정우철; 허민수

doi:10.5657/kfas.2020.0112

살 오징어(Todarodes pacificus) 간췌장 유래 한외여과 Aminopeptidase Retentate Fraction의 특성과 쓴맛 개선효과
Characteristics of Aminopeptidase Retentate Fraction from the Common Squid Todarodes pacificus Hepatopancreas Obtained by Ultrafiltration, and Its Lowering the Bitterness 원문보기

한국수산과학회지 = Korean journal of fisheries and aquatic sciences, v.53 no.1, 2020년, pp.112 - 122

김진수 (경상대학교 수산식품산업화기술지원센터) , 이정석 (경상대학교 수산식품산업화기술지원센터) , 윤인성 (경상대학교 해양식품생명의학과) , 강상인 (경상대학교 해양식품생명의학과) , 박선영 (경상대학교 해양식품생명의학과) , 정우철 (경상대학교 수산식품산업화기술지원센터) , 허민수 (경상대학교 수산식품산업화기술지원센터)

Abstract ▼ AI-Helper

This study investigated some enzymatic properties and bitterness improvement of an aminopeptidase retentate fraction (ARF) from common squid Todarodes pacificus hepatopancreas extract (HPE), obtained by ultrafiltration with a 10 kDa molecular weight cut off membrane. Endoprotease and aminopeptidase (AP) activity, and the purity of the ARF (>10 kDa) increased by 6.69-18.11 U/mg and 1.5-2.6 fold, respectively, compared to HPE (2.63-9.37 U/mg). The AP activity toward LeuPNA was stable at 20-55℃ and pH 5-9, but decreased slightly with increasing concentration of NaCl in the reaction mixture. The ARF was the most active MetPNA and preferentially hydrolyzed Glu, Leu and AlaPNA. The bitterness tryptic casein hydrolysates (BTCHs) were treated with ARF, and the bitterness of ARF-BTCHs significantly decreased with increasing amounts of released amino acids Ala, Val, Met, Ile and Leu, which show strong correlations with bitterness. Therefore, the ARF of T. pacificus HPE obtained by ultrafiltration may have a considerable potential for application in protein hydrolysis and appears to be ideally suited to the purpose of lowing bitterness in protein hydrolysates.

주제어

표/그림 (7)

표 Table 1. Endoprotease and aminopeptidase activities of ARF and PE from the common squid Todarodes pacifcicus HPE by the ultrafltra-tion toward azocasein, LeuPNA and ArgPNA as substrates
$Fig. 1. Effect of pH stability (A), thermal stability (B) and NaCl (C) on aminopeptidase activity of the retentate fraction from the common squid Todarodes pacificicus hepatopancreas extracts by the ultrafiltration toward LeuPNA as a substrate.$ 그림 Fig. 1. Effect of pH stability (A), thermal stability (B) and NaCl (C) on aminopeptidase activity of the retentate fraction from the common squid Todarodes pacificicus hepatopancreas extracts by the ultrafiltration toward LeuPNA as a substrate.
표 Table 2. Substrate specifcity of HPE and ARF of common squid Todarodes pacifcicus hepatopancreas toward various substrates
표 Table 3. Sensory score on the bitterness of ARF and PF-treated BTCHs
표 Table 4. Changes in major peaks area(%) from HPLC profle of BTCHs treated with ARF of common squid Todarodes pacifcicus hepatopancreas by the ultrafltration for different times (Area %)
그림 Fig. 2. Reverse-phase HPLC profile of BTCHs treated with ARF of common squid Todarodes pacificicus hepatopancreas by the ultrafiltration for different incubation times.
표 Table 5. Released amino acid compositions of BTCHs treated with ARF of common squid Todarodes pacifcicus hepatopancreas by the ultrafltration for different times

AI 본문요약
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문제 정의

이 연구는 살 오징어(T. pacificus)의 간췌장 추출물로부터 10kDa 한외여과 막을 이용하여 분획한 aminopeptidase retentatefraction (ARF)의 효소적 특성과 tryptic casein 가수분해물의 쓴맛 개선효과에 대하여 평가하고자 한다.
(1997) 및 Park and Lee (1996)도 aminopeptidase를 이용하여 casein 가수분해물의 쓴맛개선을 시도하였고, 그 효과를 C18-RP HPLC 분석 결과 retention time 40분대 이후의 소수성이 강한 peak들이 감소한 반면 40분대 이전의 친수성이 강한 peak들이 증가하였다고 보고하여 본 실험 결과와 유사하였다. 이러한 보고의 내용을 확인하기 위하여 가수분해시간에 따른 ARF 처리 BTCHs의 방출된 아미노산의 조성 변화를 살펴보고자 한다.

제안 방법

Endoprotease의 활성은 azocasein 기질을 사용하여 Kim etal. (2008a)의 방법을 다소 수정하여 측정하였다. 즉, 20 μL의 효소 용액과 2 mL의 1% (w/v) azocasein 기질이 용해되어 있는 0.
ARF 및 PF의 BTCH에 대한 쓴맛개선 효과는 ARF- 및 PFBTCH를 제조하여, 이들 가수분해물의 관능검사, HPLC profile 및 유리된 아미노산의 분석을 통하여 살펴보았다.
ARF-BTCHs의 유리된 아미노산(released amino acid) 분석 시료조제는 ARF-BTCHs (0, 8, 16 및 24 h)에 대해 동량의 20% trichloroacetic acid (TCA)를 가해 제단백질하고, 원심분리(10,000 g, 15 min)한 다음, 상층액에 동량의 ether를 가해 남아있는 TCA를 제거하는 과정을 3회 반복하였다. 이들 시료의 2 mL (50 mg의 단백질)에 각각 2 mL의 conc.
ARF의 LeuPNA에 대한 분해활성으로 측정한 pH 안정성은 20 μL의 ARF와 50 μL의 다양한 pH buffer (pH 3-11)로 전 단계 반응(40℃, 30 min)을 실시한 후, 그리고 온도 안정성은 20μL의 RF를 20-80℃의 온도별로 30분간 전 단계 반응을 실시한후, 각각 1 mL의 0.5 mM LeuPNA를 함유하는 0.1 M sodiumphosphate buffer (pH 7.5)를 가하고, 앞서의 aminopeptidase활성 측정방법(50℃, 1 h)에 따라 실시하였다.
이들 시료의 2 mL (50 mg의 단백질)에 각각 2 mL의 conc. HCl (12 N)를 가하여 밀봉한 다음, heating block (HF21, Yamato, Japan)으로 가수분해(110℃, 24 h)한 후, glass filter로 여과 및 감압건조하고, 이를 sodium citrate buffer (pH 2.2)로 정용하여 최종 분석용 시료를 제조하였다. 아미노산 자동분석기(Biochrom 30, Pharmacia Biotech, London, England)를 통해 각 ARF-BTCH의 유리된 아미노산을 분석하고 아미노산 조성(%, g/100 g ofprotein) 및 함량(mg/100 mL of BTCH)으로 나타내었다.
5M이 되도록 첨가하여, 앞서의 aminopeptidase 활성 측정방법(50℃, 1 h)에 따라 측정하였다. NaCl을 첨가하지 않은 control의 활성에 대한 각 NaCl 농도별 활성을 relative activity (%)로 NaCl에 대한 안정성을 검토하였다.
또한 ARF- 및 PF-BTCH의 HPLC profile에의한 peptide 분석은 5C18-AR column (i.d. 4.6×250 mm, 5μm, Waters Co., Massachusetts, USA)을 장착한 HPLC (L2000 Series System, Hitachi Co., Tokyo, Japan)를 사용하였다.
먼저, ARF- 및 PF-BTCH의 제조는 효소 (ARF 및 PF)와 기질(TBCH)의 비율을 1/10-1/2,000 (단백질 함량기준)으로 혼합하여, 50℃에서 8, 16 및 24시간동안 반응시킨 다음, 효소반응정지(90°C, 20 min) 및 원심분리(1,460 g, 20 min)한 상층액을 효소 첨가비율 및 반응시간에 따른 ARF- 및 PF-BTCH로 사용하였다.
살 오징어(Todarodes pacificicus) hepatopancreas extract(HPE)로부터 한외여과막(MWCO 10 kDa)으로 분획한 aminopeptidase retentate fraction (ARF, ]10 kDa fraction) 및 permeate fraction (PF, [10 kDa fraction)의 endoprotease 및 aminopeptidase의 분해활성과 회수율은 Table 1과 같다. 먼저, HPE의 총 단백질량(27,660 mg)에 대하여 한외여과 과정을 거침으로서 각각 ARF (10,540 mg)는 38.1% 그리고 PF (13,780mg)는 49.8%로 분획되었다. UFs (ARF 및 PF)의 azocasein에대한 specific activity는 ARF가 6.
, Tokyo, Japan)를 사용하였다. 반응시간 별 ARF-BTCHs에 대해 0.1% (v/v) trifluoroacetic acid (TFA)가 함유된 acetonitrile 용액을 이동상으로 하여 linear gradient (0-45% 범위)로 용출하였다. 이때 유속은 0.
살 오징어 HPE 및 ARF의 N-terminal blocked 합성기질에 대한 기질특이성을 살펴보기 위하여, 10종의 LeuPNA, ArgPNA, LysPNA, ProPNA, MetPNA, PhePNA, GluPNA, ValPNA, AlaPNA 및 GlyPNA에 대한 분해활성은 효소 용액 20 μL와 1mL의 0.5 mM 합성 기질을 함유하는 0.1 M sodium phosphatebuffer (pH 7.5)를 혼합한 다음, 앞서의 aminopeptidase 활성 측정방법(50℃, 1 h)에 따라 측정하여, specific activity (U/mg)으로 나타내었다.
2)로 정용하여 최종 분석용 시료를 제조하였다. 아미노산 자동분석기(Biochrom 30, Pharmacia Biotech, London, England)를 통해 각 ARF-BTCH의 유리된 아미노산을 분석하고 아미노산 조성(%, g/100 g ofprotein) 및 함량(mg/100 mL of BTCH)으로 나타내었다.
5)를 혼합한 다음, 앞서의 aminopeptidase 활성 측정방법(50℃, 1 h)에 따라 측정하여, specific activity (U/mg)으로 나타내었다. 아울러 HPE의 LeuPNA의 활성에 대한 relative activity (%)로도 나타냄으로써 UF system을 통한 분획효과에 대하여도 살펴보았다.
, Tokyo, Japan)로 구성된 UF system의 container에 2 L의 HPE를 주입하고, 주입압력 10 bar 및 사출압력 20 bar로 pump의 압력을 설정한 다음, 30-50 mL/min의 crossflow rate로 한외여과를 실시하였다. 이 과정에서 각각 400 mL의 retentate fraction (RF, ]10 kDa) 및 1,550 mL의 permeate fraction (PF; [10kDa)을 회수하였다. 이들 UF fractions의 분획효과는 단백질 농도, 천연 및 합성 기질에 대한 효소활성을 측정하여 total activity 및 회수율로서 검토하였다.
이 과정에서 각각 400 mL의 retentate fraction (RF, ]10 kDa) 및 1,550 mL의 permeate fraction (PF; [10kDa)을 회수하였다. 이들 UF fractions의 분획효과는 단백질 농도, 천연 및 합성 기질에 대한 효소활성을 측정하여 total activity 및 회수율로서 검토하였다.
1% (v/v) trifluoroacetic acid (TFA)가 함유된 acetonitrile 용액을 이동상으로 하여 linear gradient (0-45% 범위)로 용출하였다. 이때 유속은 0.7mL/min, 용출시간은 60 min, UV detector (_L-2400, HitachiCo., Tokyo, Japan)의 파장은 214 nm로 하여 각 반응시간 별가수분해물의 주요 peak area (%)와 HPLC (high performanceliquid chromatography) profile의 변화에 대하여 검토하였다.
5)를 1/6,000 (효소/기질비)의 비율로 효소반응 혼합액을 조제하여 반응시킨(50℃, 8 h) 다음, 효소 불활성화를 위해 80℃에서 20분간 가열처리하였다. 이를 원심분리하여 얻은 상층액은 관능검사를 통해 2% (w/v) Gly-phe 쓴맛용액의 쓴맛강도에 준하는 BTCH로 제조하였다.
(2014b)의 방법에 따라 제조하였다. 즉, 0.2% (w/v)trypsin과 2% (w/v) casein이 용해되어 있는 0.1 M sodiumphosphate buffer (pH 7.5)를 1/6,000 (효소/기질비)의 비율로 효소반응 혼합액을 조제하여 반응시킨(50℃, 8 h) 다음, 효소 불활성화를 위해 80℃에서 20분간 가열처리하였다. 이를 원심분리하여 얻은 상층액은 관능검사를 통해 2% (w/v) Gly-phe 쓴맛용액의 쓴맛강도에 준하는 BTCH로 제조하였다.
즉, 20 μL의 효소 용액과 1 mL의 0.2mM 기질이 용해되어 있는 0.1 M sodium phosphate buffer(pH 7.5)를 혼합 및 반응(50℃, 1 h) 시킨 다음, 반응 혼액에 0.3mL의 33% (v/v) acetic acid를 가하여 실활 시킨 후, 정치(30min) 및 원심분리(1,460 g, 20 min)한 다음 흡광도를 측정(파장 410 nm)하여 검토하였다.
즉, 20 μL의 효소 용액과 2 mL의 1% (w/v) azocasein 기질이 용해되어 있는 0.1 M sodium phosphate buffer (pH 7.0)를 혼합 및 반응(50°C, 1 h) 시키고, 이 반응액에 동량 (2 mL)의 5% (w/v) trichloroacetic acid (TCA) 용액을 가하여 실활 시킨 후, 정치(30 min) 및 원심분리(1,460 g, 20 min) 한 다음, 상층액의 흡광도를 측정(파장410 nm)하여 검토하였다.
한편 ARF의 LeuPNA의 분해활성에 미치는 NaCl의 영향은 10-20 μL의 RF와 1 mL의 0.5 mM LeuPNA가 함유하는 0.1 Msodium phosphate buffer (pH 7.5)에 NaCl의 최종농도가 0-4.5M이 되도록 첨가하여, 앞서의 aminopeptidase 활성 측정방법(50℃, 1 h)에 따라 측정하였다.

대상 데이터

실험에 사용한 국내산 살 오징어(common squid Todarodespacificicus; length, 53.7±6.8 cm; weight, 411.5±28.5 g) hepatopancreas (HP; length, 18.5±4.5 cm; weight, 86.8±5.8 g)는 부산광역시 소재의 SJ수산에서 동결상태로 분양받아, 냉동상태(-70℃)로 보관하여 두고 실험에 사용하였다.
쓴맛 casein 가수분해물의 조제를 위한 trypsin (EC3.4.21.4;porcine pancreas)과 효소활성 측정용 기질로서 azocasein, casein, _L-leucine-p-nitroanilide (LeuPNA), _L-arginine-pnitroanilide (ArgPNA), _L-lysine-p-nitroanilide (LysPNA), Lproline-p-nitroanilide (ProPNA), _L-methionine-p-nitroanilide(MetPNA), _L-phenylalanine-p-nitroanilide (PhePNA), _L-glutamic acid-p-nitroanilide (GluPNA), _L-valine-p-nitroanilide(ValPNA), _L-alanine-p-nitroanilide (AlaPNA) 및 _L-glycine-pnitroanilide (GlyPNA), 그리고 쓴맛 표준물질로서 glycylphenylalanine (Gly-phe) 등은 Sigma-Aldrich Co. (St. Louis, MO, USA) 제품을 구입하였고, 기타 시약은 분석급으로 구입하여 사용하였다. 한편, UF system의 구성은 분획용 한외여과 막(10kDa molecular weight cut off)은 pellicon XL filter (50 cm²PLCGC 10K regenerated cellulose, Milipore Co.
즉, 냉동상태의 시료를 부분해동 및 마쇄한 다음, 마쇄한 HP (600 g)에 대하여 3배량(v/w)의 탈 이온수를 가하여 균질기(Polytron PT 1200E, Kinematica AG, Lucerne, Switzerland)로 균질화 및 교반(20℃, 6 h) 하여 추출하였다. 이 어서 HPE에 대해 0.2배량(v/v)의 에틸에테르를 가하여 분액여두를 통해 3회 반복하여 탈지한 다음, 원심분리(Supra 22K, Hanil Science Co., Daejeon, Korea; 12,000 g, 20 min)하여 얻어진 상층액을 탈지한 살 오징어 HPE로서 효소활성 및 ultrafiltration (UF) system을 이용한 분획용 시료로 사용하였다.

데이터처리

모든 실험은 최소 3회 이상 반복 실시하였으며, 평균(mean)과 표준편차(standard deviation)로 나타내었다.

이론/모형

0) buffer는 Dawson et al.(1986)의 방법에 따라 각각 제조하여 사용하였다.
Aminopeptidase의 활성은 LeuPNA외 9종의 N-terminalblocked p-nitroanilide 기질로 사용하여 Kim et al. (2008b)의 방법에 따라 측정하였다. 즉, 20 μL의 효소 용액과 1 mL의 0.
단백질 농도는 Lowry et al. (1951)의 비색법에 따라 bovineserum albumin을 표준 단백질로 하여 구한 검량곡선으로부터 측정하였다.
살 오징어(T. pacificicus) HPE는 Kim et al. (2014b)의 방법에 따라 제조하였다. 즉, 냉동상태의 시료를 부분해동 및 마쇄한 다음, 마쇄한 HP (600 g)에 대하여 3배량(v/w)의 탈 이온수를 가하여 균질기(Polytron PT 1200E, Kinematica AG, Lucerne, Switzerland)로 균질화 및 교반(20℃, 6 h) 하여 추출하였다.
앞서 언급한 UF system을 이용하여 HPE로부터 분획한 ARFfraction의 쓴맛 개선 효과를 살펴보기 위하여 기질로 사용한BTCH의 조제는 Nishiwaki et al. (2002)의 방법을 다소 수정한Kim et al. (2014b)의 방법에 따라 제조하였다. 즉, 0.

성능/효과

ARF의 aminopeptidase 활성은 0.5 M NaCl (약 2.9% 수준)에서는 크게 영향을 받지 않았으나, 이보다 농도를 증가시키는 경우 점차적으로 감소하는 경향을 나타내었고, 4.5 M (약 26.3%)의 식염이 존재하는 경우 최대 활성의 37%만을 나타내었다.
따라서 HPLC profiles 상에서 상대적으로 친수성이 강한 peaks(1-5)의 증가는 소수성이 강한 peaks (6-8)에 분포하는 peptides의 소수성 N 말단 아미노산이 ARF의 작용으로 유리되어 상대적으로 소수성이 약해지면서 peaks 1-5의 증가로 이어진 것이라 판단되었다(Fig. 2).
31배로 ARF에 의해 방출된 총 아미노산 함량이 증가하였다. 17종의 아미노산 모두 ARF의 가수분해에 의해 함량이 증가한 것으로 나타났으며, 특히 Cys, His 및 Phe를 제외한 14종의 유리된 아미노산 함량이 최소 2배이상 함량이 증가한 것으로 나타났다. 아울러 방출된 아미노산함량의 증가 더불어, BTCH에 비하여 2배 이상의 두드러진 아미노산 조성(%)의 증가를 보인 아미노산은 Asp, Tyr, Arg, Met, Ile 및 Leu이었으며, 조성비를 유지하거나 다소 증가한 아미노산은 Thr, Ser, Glu, Lys, Ala 및 Val로서 이들 유리된 아미노산들은 ARF의 기질 특이성과 밀접한 관련성이 있는 것으로 판단되었다.
5%를 차지하였다. ARF 처리 BTCH08은 3,915.2mg/100mL, BTCH16은 4,268.1 mg/100 mL 그리고 BTCH246,328.5 mg/100 mL로서 BTCH에 비하여 가수분해시간의 경과에 따라 각각 2.05배, 2.23배 및 3.31배로 ARF에 의해 방출된 총 아미노산 함량이 증가하였다. 17종의 아미노산 모두 ARF의 가수분해에 의해 함량이 증가한 것으로 나타났으며, 특히 Cys, His 및 Phe를 제외한 14종의 유리된 아미노산 함량이 최소 2배이상 함량이 증가한 것으로 나타났다.
2와 Table 4에 나타내었다. ARF 처리 BTCH의 HPLC chromatogram 상에서 상당히 많은 peak들이 검출되었으나, 가수분해시간에 따라 변화 두드러진 peak는 8개로 동정되었다. BTCH의 profile의 경우, 분석시 사용한 칼럼(C18)과 이동상(0-45% acetonitrile)의 특성에 따라 retention time (0-60 min)이 길어질수록 상대적으로 소수성이 강한 peptide 획분들이 용출된 것으로 추정되었으며(peak 6-8), 이들 peak 6-8이 casein 가수분해물의 쓴맛을 내게 하는 peptide 획분으로 판단되었다.
ARF는 20-55°C 범위에서 80-100%의 활성이 유지되어 안정하였고, 60°C에서 활성이 87.2%로 감소하였으며, 그 이상의 온도에서는 급격히 저하하여 23%이하의 활성을 나타내었다.
살 오징어 간췌장 HPE로부터 한외여과공정을 통해 분획한ARF 및 PF의 첨가비율과 가수분해 시간에 따른 BTCH (쓴맛tryptic casein 가수분해물)에 대한 쓴맛개선 효과를 1% GlyPhe 쓴맛 표준용액에 대한 쓴맛평가로 살펴본 결과는 Table 3과 같다. ARF는 효소/기질의 비율이 1/2,000과 1/1,000 일 때, 가수분해 16시간에 이르기까지 쓴맛에 대한 변화가 없었으며, PF의 경우 1/200, 1/100 및 1/50 일 때 가수분해 시간에 관계없이 7명의 panel member 모두가 1% Gly-phe 용액 보다 쓴맛이 강하다고 평가하여 쓴맛 개선 효과가 전혀 인지되지 않았다. 그러나, ARF에 대한 기질의 비율이 1/500과 1/200은 1%Gly-phe 용액과 쓴맛이 강하다고 평가한 panel이 가수분해 8시간에서 2명, 그리고 16시간에서 1명만이었으며, 24에서 panelmember 모두가 1% Gly-phe 보다 쓴맛이 약하거나, 느끼지 못하여 쓴맛 개선 효과가 확연히 인정되었다.
9배)하였다. HPE 및 ARF 모두 극성아미노산인 GluPNA, 소수성 아미노산인 MetPNA, LeuPNA 및 AlaPNA에 대한 분해활성이 두드러졌으며, 10종의 선택적 합성기질에 대해 활성의 강도에는 차이가 있었지만 모두 분해활성을 나타냄으로서 광범위한 기질특이성이 확인되었다.
살 오징어 간췌장 유래 HPE 및 한외여과 ARF의 10종의 선택적 합성기질에 대한 분해활성을 측정하여 기질 특이성을 검토한 결과는 Table 2와 같다. HPE의 LeuPNA 기질에 대한 분해활성(9.72 U/mg 및 100%)을 기준으로 하여 HPE 및 ARF의 합성기질에 대한 상대활성 (%)은 HPE의 경우, GluPNA가 249%로 가장 강한 분해활성을 보였고, 다음으로 MetPNA(161%), LeuPNA (100%), AlaPNA (86%) 순이었으며, ArgPNA, LysPNA, PhePNA, ProPNA, GlyPNA 및 ValPNA는 9-47%의 분해활성을 나타내었다. 한외여과 ARF의 경우, MetPNA가 308%로 가장 강한 분해활성을 나타내었으며, 다음으로 GluPNA (282%), LeuPNA (186%), AlaPNA (160%), ArgPNA (69%)의 순이었으며, PhePNA, LysPNA, ProPNA, GlyPNA 및 ValPNA는 1.
7%이었다. Total activity는 PF가 70,480 U로 PF(8,525 U)에 비하여 약 8.3배 정도 높아, ARF에는 ArgPNA를 분해할 수 있는 aminopeptidase도 다량 분포하고 있으리라 판단되었다. Arginine aminopeptidase (EC 3.
8%로 분획되었다. UFs (ARF 및 PF)의 azocasein에대한 specific activity는 ARF가 6.76 U/mg으로, PF의 1.36 U/mg에 비하여 약 5.0배정도 강하였으며, HPE의 specific activity (2.63 U/mg)에 비하여도 2.6배 정도 높아 한외여과 처리에 의한 endoprotease의 분획효과가 인정되었다. 한편 UFs의 HPE에 대한 총 회수율(%) 및 total activity (U)는 ARF가 각각98.
, 2006)가 분포하고 있으리라 추정되었다. UFs의 LeuPNA에 대한 specific activity, 정제도 및 회수율은 HPE에 대하여, ARF의 경우 각각 18.11 U/mg, 1.9배및 71.0%이었고, PF의 경우 각각 0.35 U/mg, 0.04배 및 1.8%이었다. 또한, total activity는 ARF가 190,880 U로 PF (4,883U)에 비하여 약 39.
1A와 같다. pH 5-10 범위에서, RF의 분해활성은 92-100%의 분해활성을 나타내어 가장 안정한 pH범위이었으며, pH 4에서는 83.4%이었으나, pH 3에서는 급격한 활성감소를 보여25%를 나타내었다. 한편, Rakskulthai and Haard (1999)는 오징어 간췌장으로부터 분획한 aminopeptidase 획분은 pH 6-7범위에서, Park et al.
ARF는 효소/기질의 비율이 1/2,000과 1/1,000 일 때, 가수분해 16시간에 이르기까지 쓴맛에 대한 변화가 없었으며, PF의 경우 1/200, 1/100 및 1/50 일 때 가수분해 시간에 관계없이 7명의 panel member 모두가 1% Gly-phe 용액 보다 쓴맛이 강하다고 평가하여 쓴맛 개선 효과가 전혀 인지되지 않았다. 그러나, ARF에 대한 기질의 비율이 1/500과 1/200은 1%Gly-phe 용액과 쓴맛이 강하다고 평가한 panel이 가수분해 8시간에서 2명, 그리고 16시간에서 1명만이었으며, 24에서 panelmember 모두가 1% Gly-phe 보다 쓴맛이 약하거나, 느끼지 못하여 쓴맛 개선 효과가 확연히 인정되었다. 또한 ARF의 첨가비율을 높인 실험군(1/100 이상)은 1% Gly-phe 용액과 쓴맛이 유사하다고 평가한 panel이 가수분해 8시간에서 1명만이었고, 이 후의 반응시간에서는 전원이 쓴맛을 감지하지 못하였다.
아울러 방출된 아미노산함량의 증가 더불어, BTCH에 비하여 2배 이상의 두드러진 아미노산 조성(%)의 증가를 보인 아미노산은 Asp, Tyr, Arg, Met, Ile 및 Leu이었으며, 조성비를 유지하거나 다소 증가한 아미노산은 Thr, Ser, Glu, Lys, Ala 및 Val로서 이들 유리된 아미노산들은 ARF의 기질 특이성과 밀접한 관련성이 있는 것으로 판단되었다. 또한 가수분해시간에 따른 아미노산의 조성비는 감소하였으나, 아미노산 함량이 증가한 Pro Gly 및 Phe도 관련성이 있을 것으로 추정되었다. 따라서, 이러한 결과는 앞서의 합성기질에 대한 기질 특이성(Table 2)을 그대로 반영한 결과임이 최종적으로 확인되었다.
또한 본 실험의 10 kDa 한외 여과막을 이용한 한외여과 공정은 살 오징어 간췌장 추출물(HPE)의 부피를 20% 수준으로 낮추는 농축효과뿐만 아니라, 저분자량(PF)의 획분을 효과적으로 제거할 수 있었고, endoprotease 및 aminopeptidase 분해활성으로 살펴본 회수율 및 분획/정제효과가 우수한 것으로 나타났다. 이상의 결과와 보고에서 오징어 간췌장의 한외여과 ARF는 endoprotease의 분해 특성 보다는 aminopeptidase의 분해특성이 상대적으로 우수하였고, ArgPNA에 비하여 상대적으로 LeuPNA를 특이적으로 분해할 수 있는 aminopeptidase가 다량분포하고 있다고 판단되어, 쓴맛 가수분해물 중 peptide 말단의 소수성 아미노산을 유리시켜 맛 증강 및 쓴맛개선을 시키는 품질 개선제로 이용 가능할 것으로 판단되었다.
8%이었다. 또한, total activity는 ARF가 190,880 U로 PF (4,883U)에 비하여 약 39.1배 정도 높아, ARF에는 LeuPNA를 분해할 수 있는 aminopeptidase가 다량 분포하고 있으리라 추정되었다. Leucine aminopeptidase (EC 3.
따라서, 이러한 결과는 앞서의 합성기질에 대한 기질 특이성(Table 2)을 그대로 반영한 결과임이 최종적으로 확인되었다. 또한, 총 아미노산 조성에 대한 소수성 아미노산의 비율(%)는 BTCH (50.6%)에 비하여 ARF-BTCHs(08-24)는 39.5-41.4%로 감소하여, 앞서의 HPLC profile의 결과(Fig 2와 Table 4)와 일치하였으며, 쓴맛에 관여하는 소수성 아미노산의 감소를 확인할 수 있었다.
살 오징어 간췌장 유래 한외여과 ARF에 의한 가수분해시간별 BTCHs의 아미노산의 변화를 함량(mg/100 mL) 및 조성(%)으로 Table 5에 나타내었다. 먼저, 가수분해시간별에 따른 방출된 총 아미노산 함량(released amino acid)은 쓴맛 가수분해물인 BTCH가 1,912.2 mg/100 mL이었으며, 이중에서 Phe의 함량이 35.5%를 차지하였다. ARF 처리 BTCH08은 3,915.
17종의 아미노산 모두 ARF의 가수분해에 의해 함량이 증가한 것으로 나타났으며, 특히 Cys, His 및 Phe를 제외한 14종의 유리된 아미노산 함량이 최소 2배이상 함량이 증가한 것으로 나타났다. 아울러 방출된 아미노산함량의 증가 더불어, BTCH에 비하여 2배 이상의 두드러진 아미노산 조성(%)의 증가를 보인 아미노산은 Asp, Tyr, Arg, Met, Ile 및 Leu이었으며, 조성비를 유지하거나 다소 증가한 아미노산은 Thr, Ser, Glu, Lys, Ala 및 Val로서 이들 유리된 아미노산들은 ARF의 기질 특이성과 밀접한 관련성이 있는 것으로 판단되었다. 또한 가수분해시간에 따른 아미노산의 조성비는 감소하였으나, 아미노산 함량이 증가한 Pro Gly 및 Phe도 관련성이 있을 것으로 추정되었다.
2-59%의 분해활성을 나타내었다. 이 상의 결과에서, 한외여과 공정을 통하여 분획한 ARF는 HPE에비하여, ProPNA, ValPNA 및 GlyPNA의 분해활성은 감소한반면, 나머지 7종의 합성기질에 대한 분해활성은 증가(1.1-1.9배)하였다. HPE 및 ARF 모두 극성아미노산인 GluPNA, 소수성 아미노산인 MetPNA, LeuPNA 및 AlaPNA에 대한 분해활성이 두드러졌으며, 10종의 선택적 합성기질에 대해 활성의 강도에는 차이가 있었지만 모두 분해활성을 나타냄으로서 광범위한 기질특이성이 확인되었다.
(1989)은 aminopeptidase가 bitter fraction 중 특이적으로 Pro과 Asp 등과 같은 몇몇 종류의 아미노산을 유리시키지 못한다고 보고한 바 있다. 이상의 ARF의 기질특이성, 관능검사, HPLC profile 및 ARF에 의해 방출된 아미노산의 조성의 결과로 미루어 보아, peptide에 의해 야기된 가수분해물의 쓴맛은 살 오징어 간췌장 유래 한외여과 ARF (]10 kDa)에 대하여 기질의 비율을 1/500으로 한 다음 16시간 이상 가수분해시키는 경우 쓴맛을 개선시킬 수 있으리라 판단되었다.
로 부터 aminopeptidase를 정제하여 온도안정성을 살펴본 결과 55°C에서 최대 활성의 약 80% 이상을 유지하였다고 보고한 바 있다. 이상의 aminopeptidase에 대한 여러 연구자들의 연구 결과와 본 실험의 결과 간에 온도 안정성에 있어 차이가 없는 것으로 확인되었으며, 비교적 넓은 온도 범위에서 안정하였다.
8% 및 18,755 U에 비하여 월등히 높은 수준이었다. 이상의 endoprotease의 분해활성에 대한 결과로 미루어 보아, 한외여과 처리 ARF에는 주로 수산 동물의 내장에 분포하고 있는 trypsin, chymotrypsin 및 pepsin 유사효소 등과 같은 소화관련 endoprotease (Heu and Ahn, 1999;Bezerra et al., 2005; Li et al., 2006)가 분포하고 있으리라 추정되었다. UFs의 LeuPNA에 대한 specific activity, 정제도 및 회수율은 HPE에 대하여, ARF의 경우 각각 18.
, 1987a). 이상의 결과로 미루어 보아 살 오징어간췌장 유래 한외여과 ARF는 단백질 가수분해물이나 속성 액젓의 쓴맛 개선제로 이용하고자 하는 경우 효소/기질의 비율을 1/500으로 하여 16시간이상 가수분해 시키거나 또는 1/100 이 상으로 하여 8시간 이하의 가수분해 처리를 하는 것이 적절하리라 판단되었다.
, 1979). 이상의 결과와 보고로 미루어 보아 살 오징어 간췌장 ARF는 식염농도가높은 속성액젓(식염농도 25%내외)의 쓴맛 개선에 적용하고자 하는 경우, 식염이 없는 가수분해물에서 보다는 약 3배 정도의 효소량을 추가적으로 첨가하거나, 가능한 낮은 식염 농도에서 적용하는 것이 효과적이라 판단되었다.
또한 본 실험의 10 kDa 한외 여과막을 이용한 한외여과 공정은 살 오징어 간췌장 추출물(HPE)의 부피를 20% 수준으로 낮추는 농축효과뿐만 아니라, 저분자량(PF)의 획분을 효과적으로 제거할 수 있었고, endoprotease 및 aminopeptidase 분해활성으로 살펴본 회수율 및 분획/정제효과가 우수한 것으로 나타났다. 이상의 결과와 보고에서 오징어 간췌장의 한외여과 ARF는 endoprotease의 분해 특성 보다는 aminopeptidase의 분해특성이 상대적으로 우수하였고, ArgPNA에 비하여 상대적으로 LeuPNA를 특이적으로 분해할 수 있는 aminopeptidase가 다량분포하고 있다고 판단되어, 쓴맛 가수분해물 중 peptide 말단의 소수성 아미노산을 유리시켜 맛 증강 및 쓴맛개선을 시키는 품질 개선제로 이용 가능할 것으로 판단되었다.
, 2014a, 2014b). 이상의 연구보고에 따르면, 오징어 간췌장에는 다량의 aminopeptidases가 분포하고 있으며, 이들 효소는 쓴맛개선효과가 있는 것으로 나타났다.

후속연구

따라서, 오징어 가공부산물인 간췌장으로부터 한외여과 막을 이용하여 경제적이고 효율적인 aminopeptidase 획분을 얻기 위한 분획조건과 이렇게 얻어진 aminopeptidase UF 획분의 효소적 특성 및 쓴맛 개선효과에 대한 평가가 필요하다.
이 연구의 결과에서도 ARF는 MetPNA, LeuPNA, GluPNA및 AlaPNA에 대해 강한 분해활성을 나타내어, peptides 말단의 아미노산들 중 Met, Leu 및 Ala 등과 같은 소수성 아미노산(Ishibashi et al., 1987; Liu and Yasuda, 2005)의 용이한 절단에 의해 식품의 쓴맛 개선에 일익을 담당할 수 있으리라 판단되었다.
0 범위에서 안정하였다고 보고한 바 있다. 이와 같은 결과와 보고로 미루어 보아 살 오징어의 ARF는 넓은 pH 영역에서 안정성을 나타내어 산업적 및 효율적 이용이 가능하리라 판단되었다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	한외여과 공정의 장점은 무엇인가?	한외여과 공정(ultrafiltration, UF)은 크로마토그래피 및 전기영동과 같은 공정에 비하여 대량 및 연속처리가 용이한 장점이 있을 뿐만 아니라 최종산물의 순도 및 생산성에 있어서 경제적인 방법이다(Li et al., 2006).
	오징어는 어디에서 가장 많은 소비가 이루어지는 수산자원인가?	오징어는 우리나라, 일본을 비롯한 아시아에서 가장 많은 소비가 이루어지는 수산자원이다. 이들은 소비자들에게 아미노산, 무기질, 비타민 등 풍부한 영양성분, 타우린 및 콜라겐 등과 같은 건강기능 성분이 다량 함유되어 있고, 근육의 특성상 어류와는 다른 특유의 조직감과 식미를 가지고 있어 선호도가 높은 수산 식품이다(Kim et al.
	한외여과 공정은 어디에 이용되고 있는가?	, 2006). 이러한 UF 공정은 난백의 lysozyme (Ghosh et al., 2000), surimi 수세액의 단백질분해효소(Dewitt and Morrissey, 2002), 감자 및 과일주스의 천연단백질(Zwijnenberg et al., 2002), 어류내장의 단백질분해효소와 가수분해물(Gildberg, 1992) 그리고 닭 혈액의 혈장단백질(Torreset al., 2002)과 같은 단백질 분리 및 분획에 널리 이용되고 있다.

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저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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