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문제 정의
- 본 연구에서는 쌀을 원료로 하여 이소말토올리고당을 제조하기 위해 액화반응, 당화·전이 반응의 최적 조건을 조사하였다.
제안 방법
- IMO 제조를 위한 최적 효소농도를 설정하기 위해 7가 지의 실험군을 1, 4.5, 9, 18 및 36시간 동안 반응시켜 당함량을 분석하였다[Table 7, Table 8, Table 9, Table 10, Table 11].
- IMO을 제조하기 위한 최적 당화효소를 선정하기 위하여 서로 다른 당화효소를 사용하여 당화·전이반응을 진행하였다(T+TG, MP+TG, F+TG).
- IMO의 제조를 위하여 당화 및 전이효소를 동시에 첨가하였다. 액화액의 온도를 55℃로 냉각시킨 후 당화효소와 전이효소의 공통조건으로 pH와 온도를 조절하였다.
- 쌀가루 슬러리가 담긴 샘플병을 항온수조에 넣고 진탕하다가 60℃ 가 되면 Termamyl 2X를 첨가하여 급격한 호화를 방지하 였다. Termamyl 2X을 기질 대비 0.025%, 0.05%, 0.075%, 0.1%씩 농도별로 첨가하고 95℃가 되는 순간부터 1시간 마다 액화액을 채취하였고, -80℃에서 냉동보관 하여 이후에 환원당 측정에 사용하였다.
- 1%(v/w) 첨가한 것이다(F+TG). 각 실험군들을 24시간 반응시켜 생성된 IMO의 함량을 조사하였다.
- 최적 효소농도를 설정하기 위해 Maltogenase L, Promozyme D2, Transglucosidase L의 농도를 다르게 하여 7가지 실험군을 설정하였으며, 그 조건은 Table 2와 같았다. 각 효소의 역할을 알아보기 위하여 3개 중 2개의 효소는 상업적 정량을 첨가하였고, 나머지 하나의 효소는 정량의 10배 및 100배로 희석하여 첨가하였다. 또한 3가지 효소 모두 정량을 첨가한 실험군(MAX)을 두어 비교할 수 있게 하였다.
- 정량분석에 사용되는 표준물질중 glucose, maltose, isomaltose, panose, isomaltotriose는 Sigma (Saint Louis, MO, USA)에서 구입하였으며, maltotriose, maltotetraose, maltopentaose, maltohexaose, maltoheptaose, maltooctaose, maltononaose는 Elicityl Oligotech (Crolles, France)에서 구입하였으며, isomaltotetraose, isomaltopentaose는 Toronto Research Chemicals (North York, Cananda)에서 구입하였으며, isomaltohexaose는 Carbosynth (Berkshire, UK)에서 구입하였다. 검량선 작성을 위한 표준용액의 조제를 위해 각 표준물질을 10,000 mg/L 용액으로 제조하였고, 이들을 동량으로 혼합 및 희석하여 사용하였다. 표준용액 및 쌀 당화액은 0.
- 효소반응을 통한 IMO의 제조 시에는 포도당 및 말토올 리고당이 잔존하게 된다. 따라서 말토올리고당과 IMO이 동시에 분석될 필요가 있으며, CAD 검출기를 이용한 당 류의 동시분석을 시도하였다.
- 각 효소의 역할을 알아보기 위하여 3개 중 2개의 효소는 상업적 정량을 첨가하였고, 나머지 하나의 효소는 정량의 10배 및 100배로 희석하여 첨가하였다. 또한 3가지 효소 모두 정량을 첨가한 실험군(MAX)을 두어 비교할 수 있게 하였다. 이들을 60oC에서 1, 4.
- 분석을 위해 glucose, maltose, maltotriose, maltotetraose, maltopentaose, maltohexaose, isomaltose, panose, isomaltotriose, isomaltotetraose, isomaltopentaose, isomaltohexaose 총 12종의 표준물질을 사용하였고, 각 물질의 분리가 효율적으로 이루어질 수 있도록 분석조건을 설정하였다. 동시분석한 당류의 피크를 나타내는 크로마토그램을 Fig.
- 쌀가루 액화액에 0.0015% Maltogenase L, 0.075% Promozyme D2, 0.1% Transglucosidase L을 첨가하여 72시간동안 반응시켰고, 6시간마다 당화액을 채취하여 IMO의 함량을 분석하였다(Fig. 3). Isomaltose는 48시간까지 35.
- IMO의 제조를 위하여 당화 및 전이효소를 동시에 첨가하였다. 액화액의 온도를 55℃로 냉각시킨 후 당화효소와 전이효소의 공통조건으로 pH와 온도를 조절하였다.
- 또한 3가지 효소 모두 정량을 첨가한 실험군(MAX)을 두어 비교할 수 있게 하였다. 이들을 60oC에서 1, 4.5, 9, 18 및 36시간 동안 반응시켰고, IMO 함량을 분석하였다.
- 본 연구에서는 쌀을 원료로 하여 이소말토올리고당을 제조하기 위해 액화반응, 당화·전이 반응의 최적 조건을 조사하였다. 이를 위하여 효소 종류, 효소 농도, 반응 시간에 변화를 주어 이소말토올리고당을 생산하였으며, 조건별로 당 조성 및 함량을 분석하여 가장 효율적인 효소 반응 조건을 탐색하였다.
- 의 방법을 응용 하여, 다음의 3가지 실험군을 설정하였다. 첫 번째 실험군은 액화액을 제조한 후 Transglucosidase L을 0.1%(v/w) 첨가한 것이고(T+TG), 두 번째 실험군은 액화액을 제조한 후 Maltogenase L, Promozyme D2, Transglucosidase L을 각각 0.1%(v/w) 첨가한 것이고(MP+TG), 세 번째 실험군은 액화액을 제조한 후 Fungamyl 800L, Transglucosidase L을 각각 0.1%(v/w) 첨가한 것이다(F+TG). 각 실험군들을 24시간 반응시켜 생성된 IMO의 함량을 조사하였다.
- 64 g/L 까지 생산되었고 isomaltohexaose는 72시간에도 검출되지 않았다. 총 IMO 함량은 36시간에 75.36 g/L가 되고 그 이후로는 유의적인 차이가 없거나, 감소하는 경향을 나타내기 때문에 최적 효소반응 조건은 36시간으로 설정하였다. 36시간 효소 반응한 당액의 구성당 및 함량은 Fig.
- 최적 효소농도를 설정하기 위해 Maltogenase L, Promozyme D2, Transglucosidase L의 농도를 다르게 하여 7가지 실험군을 설정하였으며, 그 조건은 Table 2와 같았다. 각 효소의 역할을 알아보기 위하여 3개 중 2개의 효소는 상업적 정량을 첨가하였고, 나머지 하나의 효소는 정량의 10배 및 100배로 희석하여 첨가하였다.
- 최적 효소반응 시간을 설정하기위해 액화액에 0.0015% Maltogenase L, 0.075% Promozyme D2, 0.1% Transglucosidase L을 첨가하여 60oC에서 72시간 동안 반응시켰으며, 6시간마다 당화액을 채취하여 IMO 함량을 측정하였다.
- 최적의 효소를 탐색하기 위해 Pan 등11)의 방법을 응용 하여, 다음의 3가지 실험군을 설정하였다. 첫 번째 실험군은 액화액을 제조한 후 Transglucosidase L을 0.
- Niu의 연구에서 액화 전분의 dextrose equivalent(DE)가 높으면, 전이반응에서 단위시간당 전환되는 이소말토올리고당의 수율이 증가한다고 보고하였다9). 환원당 함량이 높을수록 전분의 가수분해가 많이 이루어 졌다고 판단하였으므로, Termamyl 2X를 기질대비 0.075% 첨가하여 2시간 동안 반응하는 것을 액화의 최적 조건으로 설정하였다.
- IMO을 제조하기 위한 최적 당화효소를 선정하기 위하여 서로 다른 당화효소를 사용하여 당화·전이반응을 진행하였다(T+TG, MP+TG, F+TG). 효소 첨가 후 0, 12 및 24 시간에 당화액을 채취하여 말토올리고당 및 IMO의 함량 을 분석하였다[Table 4, Table 5, Table 6]. 실험 결과에 나타난 총 당함량에는 당 전이 반응으로 생성되는 중간 산 물(α-1,6 결합과 α-1,4 결합이 섞여있는 올리고당)이나 nigerose, kojibiose, isopanose는 포함되지 않았기 때문에 실제 총 당함량과 일치하지는 않았다.
대상 데이터
- 당화에 사용된 효소는 β-amylase인 Maltogenase L (Novozymes)와 α-1,6 글루코시드결합을 가수분해하는 pullulanase인 Promozyme D2 (Novozymes), α-amylase인 Fungamyl 800L (Novozymes)을 사용하였다. 당 전이에 사용된 효소는 Transglucosidase L (Amano, Nagoya, Japan)을 사용하였다. 효소는 건조 기질 대비량(v/w)으로 첨가해 주었으며, 실험에 사용된 상업용 효소의 최적 활성 조건 및 유래는 Table 1과 같았다.
- 당화에 사용된 효소는 β-amylase인 Maltogenase L (Novozymes)와 α-1,6 글루코시드결합을 가수분해하는 pullulanase인 Promozyme D2 (Novozymes), α-amylase인 Fungamyl 800L (Novozymes)을 사용하였다.
- 19 g/L로 감소하였다. 따라서 IMO 제조를 위한 최적 효소는 Maltogenase L, Promozyme D2, Transglucosidase L의 조합으로 선정되었다.
- 실험에 사용된 쌀가루는 시중에서 판매되고 있는 쌀 함량 100%의 국산 쌀가루를 사용하였다. 쌀가루의 입자 크 기는 180-250 µm이었다.
- 액화에 사용된 효소는 α-amylase 인 Termamyl 2X (Novozymes, Copenhagen, Denmark)를 사용하였다.
- 정량분석에 사용되는 표준물질중 glucose, maltose, isomaltose, panose, isomaltotriose는 Sigma (Saint Louis, MO, USA)에서 구입하였으며, maltotriose, maltotetraose, maltopentaose, maltohexaose, maltoheptaose, maltooctaose, maltononaose는 Elicityl Oligotech (Crolles, France)에서 구입하였으며, isomaltotetraose, isomaltopentaose는 Toronto Research Chemicals (North York, Cananda)에서 구입하였으며, isomaltohexaose는 Carbosynth (Berkshire, UK)에서 구입하였다. 검량선 작성을 위한 표준용액의 조제를 위해 각 표준물질을 10,000 mg/L 용액으로 제조하였고, 이들을 동량으로 혼합 및 희석하여 사용하였다.
- MA, USA)가 사용되었다. 컬럼은 HILICpak VG50 4E (Shodex, Tokyo, Japan)을 사용했으며, 분석 조건은 Table 3과 같았다.
데이터처리
- 통계처리는 Minitab (R17, University Park, PA, USA) 프 로그램을 이용하였고, one way ANOVA 분석을 통해 95% 신뢰구간에서 유의적인 차이를 확인하였다.
- 희석한 시료를 microplate reader (Epoch2, Biotek, Winooski, VT, USA)를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 표준곡선을 작성하기 위해 맥아당을 표준물질로 하여 회귀방정식을 구하였으며, 이를 이용해 시료의 환원당 함량을 계산하였다.
이론/모형
- 환원당은 DNS (3,5-dinitrosalicylic acid) 방법12) 으로 측 정하였다. 시험관에 액화액 1 mL와 DNS시약 3 mL를 넣고 95oC에서 5분간 반응시킨 후 증류수를 첨가하여 냉각시켰다.
성능/효과
- 24시간 동안 당화·전이 반응을 했을 때 MP+TG에서 총 IMO의 함량이 75.02 g/L로 가장 높았고, 특히 isomaltose는 24시간일 때 34.70 g/L이고, panose는 12시간일 때 35.47 g/L로 가장 많이 측정되었다.
- F+TG에서는 isomaltose와 panose의 생성속도가 MP+TG 보다 느린 것으로 보이고, 12시간에 총 IMO가 66.23 g/L로 가장 높았다가, 24시간에는 panose의 감소와 함께 61.19 g/L로 감소하였다. 따라서 IMO 제조를 위한 최적 효소는 Maltogenase L, Promozyme D2, Transglucosidase L의 조합으로 선정되었다.
- IMO의 형성을 시간의 흐름에 따라 보면 isomaltose → isomaltotriose → isomaltotetraose → isomaltopentaose의 순으로 생산되는 것을 확인할 수 있었다.
- Promozyme D2의 농도는 18시간 이상의 장시간 반응 시 총 IMO 함량에 유의적인 차이를 주면서 수율을 높이는 것으로 보였다. Niu 등9)은 pullulanase가 이소말토올리고당의 α-1,6 결합은 가수분해하지 않으면서, 첨가량이 많아질수록 이소말토올리고당의 수율을 증가시킨다고 보고하였다.
- T+TG 반응의 결과에서, Transglucosidase L의 작용에 의해 glucose가 다량 생산되어 24시간에 38.89 g/L까지 증 가하였고, maltotriose, maltotetraose, maltopentaose도 분해 되어 Transglucosidase L이 말토올리고당도 기질로 이용할 수 있다는 것을 확인할 수 있었다15).
- HPLC에서 isocratic 조건으로 분석 시 말토올리고당 등의 당류와 IMO의 분리가 용이하지 않아 정확한 IMO의 함량을 계산하는 것에 어려움이 있다. 그래서 이동상을 gradient 조건으로 흘려주어 피크의 분리능을 높여 분석이 효율적이게 하였다. HPLC-ELSD를 이용하여 말토올리고 당과 IMO를 동시분석한 크로마토그램을 확인하였을 때, 당류의 검출 순서가 본 실험의 결과와 일치하였다14).
- 40 g/L 생산하였다고 보고하였다8). 따라서 IMO 생성의 주요 요인인 Transglucosidase L의 농도는 최대치인 0.1%로 고정하는 것이 바람직하다고 판단되었다.
- Ahn 등15)은 Transglucosidase L의 기질이 말토올리고당일 경우는 maltose가 기질이었을 때와는 달리 panose를 거치지 않고도 isomaltose나 isomaltotriose가 생성 될 수 있음을 보고하였으며, 이는 본 연구의 실험 내용과 유사하였다. 따라서 panose를 주요 생산물로 하면서 반응시간을 짧게 하고자하면 Maltogenase L의 농도를 높게 잡는 것이 좋고, 반응시간을 길게 하여 중합도가 높은 IMO를 생산하고자하면 Maltogenase L의 농도는 낮아도 된다고 사료되었다. 그러나 Maltogenase L 를 아예 사용하지 않으면 isomaltose와 panose의 생성 속도가 느려지기 때문에(Table 4, Table 5 비교) Maltogenase L의 농도는 0.
- Niu 등9)은 pullulanase가 이소말토올리고당의 α-1,6 결합은 가수분해하지 않으면서, 첨가량이 많아질수록 이소말토올리고당의 수율을 증가시킨다고 보고하였다. 본 연구에서는 36시간에서 P 0.0015, P 0.015, MAX 의 총 IMO 함량이 각각 64.39 g/L, 68.88 g/L, 73.23 g/L 으로, 낮은 농도인 0.015% 이하의 농도보다는 높은 농도로 첨가 했을 때 효과가 있다고 판단되었다. 경제적 측면을 고려하여 Promozyme D2의 농도는 0.
- 실험 결과에 나타난 총 당함량에는 당 전이 반응으로 생성되는 중간 산 물(α-1,6 결합과 α-1,4 결합이 섞여있는 올리고당)이나 nigerose, kojibiose, isopanose는 포함되지 않았기 때문에 실제 총 당함량과 일치하지는 않았다.
- 그러나 반대로 Maltogenase L 의 농도가 낮아진다면, maltose의 생산이 줄어들기 때문에 panose의 생산도 줄어들지만 Transglucosidase L이 isomaltose를 acceptor로 이용하여 isomaltotriose로의 전환이 될 수 있는 여분의 활성이 생기기 때문에, 중합도가 높은 IMO의 형성이 더 빨리 이루어지는 것으로 추측되었다. 즉, Maltogenase L과 Transglucosidase L이 동시에 작용하 기 때문에 Maltogenase L의 높은 농도는 대부분 panose의 생산으로 이어져, 오히려 사슬이 긴 IMO 생산에 방해가 된다고 판단하였다. Table 7~Table 11에서 볼 수 있듯이 isomaltotriose, isomaltotetraose, isomaltopentaose는 Maltogenase L의 농도가 낮았던 실험군인 M 0.
- 환원당의 함량은 Termamyl 2X의 농도가 높아질수록 증가하는 경향을 보였고, 1시간 액화했을 때보다 2시간 액화 했을 때 환원당의 함량이 더 높았다[Fig. 1]. 효소의 농 도를 높이는 것보다 시간을 1시간 더 길게 하는 것이 효율적이라고 판단하였다.
- 1]. 효소의 농 도를 높이는 것보다 시간을 1시간 더 길게 하는 것이 효율적이라고 판단하였다. 가장 높은 환원당 함량을 나타내는 조건은 0.
후속연구
- 0015%로 설정하였다. 이는 Maltogenase L 의 농도를 감소시킴으로써 glucose의 함량을 줄일 뿐 아니라 효소 비용도 절감시킬 수 있는 방법이 될 수 있을 것으로 사료된다.
- 전이반응으로 만들어지는 생성물 중 모든 당 분자가 α-1,6 결합이 아니 더라도 하나 이상의 α-1,6 결합을 가지고 있으면 중합도가 같은 분자들을 BDP3 (branched degree of polymerization), BDP4, BDP5 등으로 통칭하여 총 IMO 함량에 포함시키는 연구들이 있으며2,7,17), 본 연구에서도 그러한 당류를 포함시킨다면 IMO의 조성(%)이 더 높게 측정될 것이라 판단되었다.
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