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문제 정의
- 따라서 본 연구는 땅콩 속껍질 추출물에 대한 α-glucosidase 억제활성 및 억제 kinetic을 평가하고, 추출물에 존재하는 성분을 Quadrupole-Orbitrap Mass Spectrometer (UPLC-QOrbitrap-MS)를 통해 분석하여 땅콩 속껍질의 건강기능성에 대한 기초 자료를 제공하고자 한다.
제안 방법
- α-Glucosidase 저해 효과가 우수한 땅콩 속껍질 추출물에 대한 성분 분석은 초고성능 액체 크로마토그래피 (UPLC)를 이용해 분리된 성분에 대한 quadrupole-orbitrap mass를 분석하였다.
- Orbitrap MS는 m/z 150 - 1,000 사이 양이온 스캔 모드로 sheath gas flow rate 50 arbitrary units (AU), auxiliary gasflow rate 15 AU, spray voltage 2.5 ㎸, capillary 온도 270℃, S-lens RF level 50, aux 가스 히터온도 400℃로 설정하였으며 auto MS2 분석은 분해능 17,500과 isolation window 3.0 m/z로 설정하여 분석하였다.
- 특히 추출물 농도가 높을수록 그 변화는 뚜렷하게 나타났다. 땅콩 속껍질 추출물 처리농도별 시간 경과에 따른 p-nitrophenol 생성 정도에 대한 data 값을 식 (2)에 대입하여 vi, vs, 및 kobs (vi에서 vs로 전이되는 겉보기 일차속도 상수) 값을 측정하였다. 따라서 추출물 농도별 산출된 각각의 kobs 값은 식 (3)에 대입하여 그래프로 도식한 결과 농도 의존성 hyperbolic 상관을 보였다 (Fig.
- 땅콩 속껍질 추출물에 대한 α-glucosidase 저해 모드를 분석하기 위해 steady state 상태에서 10 분간 효소 반응을 관측하였다.
- 땅콩 속껍질 추출물에 대한 시간 의존성 저해 (timedependent inhibition) 양상을 보이는 slow-binding 저해 kinetic 평가의 경우 매 5 초 간격으로 10 분 동안 저해제 농도를 달리하여 α-glucosidase에 의해 유리되는 p-nitrophenol 함량을 400 ㎚에서 측정하였다.
- 땅콩 속껍질 추출물에 함유된 기능성 성분 분석은 QExactive Focus Hybrid quadrupole-orbitrap mass (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA)가 결합된 UPLCUltimate 3000 (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA)를 이용하여 분석하였다.
- , Wonju,Korea)를 이용하여 상온에서 250 rpm으로 24 시간 추출하였다. 땅콩 속껍질 추출물은 Rotary Evaporator (EYELA,Tokyo Rikakikai Co., Ltd., Tokyo, Japan)를 이용해 농축하고 동결건조장치 FDU-2100 (EYELA, Tokyo Rikakikai Co.,Ltd., Tokyo, Japan)로 건조하였다. 건조된 추출물 분말은 각종 활성 실험을 위한 시료로 이용하였다.
- 또한 추출물은 α-glucosidase의 활성부위에 결합한 이후 이성질화 시킨 후 천천히 해리되는 slow-binding 형태의 저해 메카니즘을 확인하였다.
- 모드 분석은 기질인 PNP-G 농도를 400 μM로 고정하고 추출물 농도별 (100, 80, 40, 20, 10 ㎍/㎖) 처리에 따른 α-glucosidase에 의한 p-nitrophenol로 가수분해 되는 속도를 400 ㎚에서 5 초 간격으로 10 분간 측정하였다.
- 분리 분석에 사용한 칼럼은 Acquity BEH C18 (100 ㎜ × 2.1 ㎜, 1.7 ㎛, Waters Co., MA, Milford, USA), 용매는물 (0.1% formic acid, 용매 A)과 methanol (0.1% formic acid, 용매 B)을 이용한 기울기 용매 조건 (0 min, 2% B; 2min, 2% B; 25 min, 18% B; 35 min, 28% B; 50 min, 35% B; 55 min, 35% B; post run, 5 min), 유속은 0.3㎖/min로 하여 설정하였다.
- 신팔광 땅콩 (Arachis hypogaea L.) 속껍질의 80% 에탄올추출물에 대해 혈당 조절 및 당뇨병 치료제의 주요 target 효소인 α-glucosidase 저해활성을 측정하였다.
- 신팔광 땅콩 속껍질 추출물에 대한 α-glucosidase 저해활성은 Ha 등 (2012)이 수행한 방법을 다소 변형하여 효소기질반응에 의한 초기 반응속도를 37℃ 조건에서 M2espectrophotometer (SpectraMax®, Sunnyvale, CA, USA)로 측정하였다.
- 실험에 사용된 추출물 농도는 100, 80, 40, 20 및 10 ㎍/㎖로 하였고 기질 농도는 최종 400 μM로 하였다.
- 0)에 녹인 α-glucosidase 10 ㎕ 첨가하여 빠르게 교반 후 매3 초 간격으로 1 분 동안 효소의 활성에 의해 기질로부터 유리되어 나오는 p-nitrophenol 함량을 400 ㎚에서 측정하였다.실험에 사용된 추출물 농도는 단계별 희석을 통해 10 ㎍/㎖에서 0.2 ㎍/㎖ 농도범위에서 저해활성을 측정하였다.
- 양성 대조군으로는 α-glucosidase 저해제로 알려진 acarbose 및catechin을 사용하여 그 저해효능을 평가하였다.
대상 데이터
- , Tokyo, Japan)로 건조하였다. 건조된 추출물 분말은 각종 활성 실험을 위한 시료로 이용하였다.
- 본 실험에 사용된 α-glucosidase (EC 3.2.1.20, frombaker’s yeast), p-nitrophenyl-α-D-glycopyranoside (PNP-G),NaH2PO4, Na2HPO4·7H2O, dimethyl sulfoxide (DMSO), ethanol, formic acid, acetic acid, catechin 및 acarbose는 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)에서 구입하여 사용하였다.
- 본 연구에 사용된 땅콩 (Arachis hypogaea L.)은 농촌진흥청 국립식량과학원에서 육성한 신팔광 (Pae et al., 2016) 품종을 사용하였으며, 2018년 국립식량과학원 남부작물부에서기본실물로 생산되는 것을 실험재료로 사용하였다. 수확된 종자는 수분이 5% - 7% 정도 될 정도로 건조한 뒤 탈각하여실험 전까지 4℃에 보관하였다.
- Louis, MO, USA)에서 구입하여 사용하였다. 분석용 acetonitrile, methanol 및 물은 J. T. Baker (Phillipsburg, NJ, USA)에서 구매하였다.
- 실험에 사용한 신팔광 땅콩 속껍질은 분석 전 수작업으로 분리하고 Tube Mill (IKA®, Staufen, Germany)로 분쇄하였다.
데이터처리
- 분석된 데이터는 Sigma Plot 13.0 (SPSS Inc., Chicago,IL, USA)의 비선형 회귀프로그램을 사용하여 각 곡선에 대한 매개변수 vi (초기속도), vs (정상상태 속도), kobs (vi에서 vs로 전이되는 겉보기 일차속도 상수), A (400 ㎚에서의 흡광도), A0 (베이스라인 편차 교정을 위한 상수) 및 #(겉보기 Ki)를 구하였다. 사용한 비선형 회기분석 식은 아래와 같다.
- 실험 결과 값은 평균 ± 표준편차로 나타내었다.
- 저해 모드 분석은 Sigma Plot의 Enzyme KineticsModule을 이용하였으며, 통계적 유의수준은 p < 0.05에서 SAS EG (SAS Institute Inc., Cary, NC, USA) 프로그램으로 분석하였다.
- 효소 저해 활성 실험은 3 반복으로 실험하였으며, 데이터 분석은 Sigma Plot 13.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA)을이용하여 분석하였다. 실험 결과 값은 평균 ± 표준편차로 나타내었다.
성능/효과
- 1에서와 같이 추출물 농도가 증가함에 따라 α-glucosidase 활성을억제함을 알 수 있다. 그 결과 추출물 농도에 따른 효소 활성정도를 Langmuir 방정식에 적용하여 IC50 값은 1.3 ㎍/㎖으로계산되었다. 양성 대조군으로 사용한 acarbose 및 catechin은Table 1에 나타낸 바와 같이 IC50 값이 각각 400.
- 따라서 땅콩 속껍질의 에탄올 추출물의 αglucosidase 억제 활성이 양성 대조군인 acarbose의 300 배 및 catechin의 28 배 이상 강한 활성을 보임을 알 수 있었다.
- 땅콩 속껍질 추출물 농도가 증가함에 따라 반응시간이 경과됨에 따라 초기 속도 (vi) 뿐만 아니라 정상상태 속도 (vs)도감소시키는 경향을 보였다 (Fig. 2). 특히 추출물 농도가 높을수록 그 변화는 뚜렷하게 나타났다.
- 1 [M + H] peak는 전형적인 catechin 및epicatechin으로 확인되었다. 또한 MS 및 MS2 스펙트럼을 분석 한 결과 총 24 종류의 proanthocyanidin (PAC) 계열의 화합물이 있음을 확인하였다. PAC 화합물들은 catechin 또는입체이성체 (stereoisomer)인 epicatechin unit이 dimers 또는polymers 형태로 결합된 화합물이다.
- 또한 추출물은 α-glucosidase의 활성부위에 결합한 이후 이성질화 시킨 후 천천히 해리되는 slow-binding 형태의 저해 메카니즘을 확인하였다. 또한 UPLC-Q-Orbitrap MS분석을 통해땅콩 속껍질 추출물에는 catechin, epicatechin 및 24 종의PAC 계열의 화합물들이 존재함을 밝혔다. 특히 Ha 등 (2018)및 Kim 등 (2014)의 선행 연구에서도 catechin을 비롯한proanthocyanidin 계열 화합물들이 강한 α-glucosidase 억제활성을 보였고 PAC B-type dimer인 gambiriin D 성분 또한억제 kinetic 연구 결과 slow binding type 저해제임을 밝혔다.
- 마지막으로 tR 23.2 분에 보이는 m/z 864.2 [M + H]peak의 MS2 fragmentation ion 중 m/z 287.1은 QM 분열에 의해 생성된 이온이며, HRF fragmentation에 의해 생성된 m/z 425.1 이온 피이크가 나타남에 따라 PAC A-type의 trimers화합물임을 알 수 있으며, tR 25.6, 27.1, 32.1 및 32.5 분의 MS fragmentation 패턴도 동일하게 관찰되었다. PAC A 및 B-type의 dimers와 trimers의 주요 MS2 fragmentation은 Fig.
- 이러한 결과로 땅콩 속껍질에 존재하는 성분은 장내 α-glucosidase와 가역적인 slow-binding 결합을 통해 glucose의 유리를 지연시킴으로 혈장 glucose 수치를 감소시킬 것으로 사료된다.
- 이러한 결과를 종합하면 땅콩 속껍질 에탄올 추출물은 혈당상승 및 당뇨병 질환 개선을 위한 주요 target 효소인 αglucosidase에 강한 억제효과 (IC50 = 1.3 ㎍/㎖)를 보였다.
후속연구
- 하지만 일반적으로 땅콩은 종자를 삶거나 볶아서 대부분 섭취 하고 있으며 이러한 과정 중 땅콩속껍질도 함께 섭취가 되고 있다. 따라서 열 가공 처리 후 땅콩 속껍질의 성분변화 및 α-glucosidase 저해활성에 대한 추가연구가 필요할 것으로 사료된다.
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