본 연구는 싸리나무의 기능성 식의약품 개발을 위해 부위별 최적의 에탄올 추출조건을 탐색하고 HPLC-DAD 분석방법에 대한 밸리데이션을 실시하였다. 싸리나무뿌리 추출물로부터 반복적인 크로마토그래피 기법으로 주요성분을 분리하여 NMR, MS와 같은 기기분석 data를 해석하여 xanthoangelol 화합물임을 확인하였다. Xanthoangelol를 표준물질로 선정하여 HPLC-DAD 분석법이 타당한지를 검토하기 위하여 직선성, 일간 일내 정확성, 정밀성 검출한계 및 정량한계를 확인하는 분석법 밸리데이션을 수행하였다. Xanthoangelol 분석은 ZORBAX Eclipse plus C18 (4.6×150 mm, 5 ㎛) 칼럼과 기울기 용출(gradient elution) 방법으로, 370 nm 파장에서 다른 물질의 간섭 없이 안정되게 분석되는 것을 확인하였다. 기능성 소재로 적용하기에 적합한 물과 에탄올을 이용해 농도별(water, 30, 50, 70, 95% EtOH)로 추출하고 xanthoangelol의 함량을 분석하였으며, 에탄올 비율에 따라 대상 성분의 추출율을 조절함으로써 기능성 바이오 식의약품 원료 개발을 위한 기초 자료로 활용할 수 있을 것으로 생각한다.
본 연구는 싸리나무의 기능성 식의약품 개발을 위해 부위별 최적의 에탄올 추출조건을 탐색하고 HPLC-DAD 분석방법에 대한 밸리데이션을 실시하였다. 싸리나무뿌리 추출물로부터 반복적인 크로마토그래피 기법으로 주요성분을 분리하여 NMR, MS와 같은 기기분석 data를 해석하여 xanthoangelol 화합물임을 확인하였다. Xanthoangelol를 표준물질로 선정하여 HPLC-DAD 분석법이 타당한지를 검토하기 위하여 직선성, 일간 일내 정확성, 정밀성 검출한계 및 정량한계를 확인하는 분석법 밸리데이션을 수행하였다. Xanthoangelol 분석은 ZORBAX Eclipse plus C18 (4.6×150 mm, 5 ㎛) 칼럼과 기울기 용출(gradient elution) 방법으로, 370 nm 파장에서 다른 물질의 간섭 없이 안정되게 분석되는 것을 확인하였다. 기능성 소재로 적용하기에 적합한 물과 에탄올을 이용해 농도별(water, 30, 50, 70, 95% EtOH)로 추출하고 xanthoangelol의 함량을 분석하였으며, 에탄올 비율에 따라 대상 성분의 추출율을 조절함으로써 기능성 바이오 식의약품 원료 개발을 위한 기초 자료로 활용할 수 있을 것으로 생각한다.
This study was undertaken to determine the characteristics of xanthoangelol, the major chalcone constituent derived from the extracts of different parts of Lespedeza bicolor. Xanthoangelol was isolated from the root extract using column chromatography and used as a standard for quantitative analysis...
This study was undertaken to determine the characteristics of xanthoangelol, the major chalcone constituent derived from the extracts of different parts of Lespedeza bicolor. Xanthoangelol was isolated from the root extract using column chromatography and used as a standard for quantitative analysis. The structure of the isolated compound was established based on spectroscopic evidence. The HPLC-DAD method was validated for specificity, linearity, precision, accuracy, limit of detection, and limit of quantitation. The calibration curve of xanthoangelol had significant linearity (R2>0.9999). Limit of detection and limit of quantitation 0.018 and 0.059 ㎍/mL, respectively. The relative standard deviation values of precision test, and intra- and inter-day tests were less than 0.22 and 0.40%, respectively. In the recovery test, the accuracy ranged from 98.98-102.78% with RSD values less than 0.13%. The method validation parameters indicate the applicability of the HPLC method for quality control of food or drug formulations containing L. bicolor.
This study was undertaken to determine the characteristics of xanthoangelol, the major chalcone constituent derived from the extracts of different parts of Lespedeza bicolor. Xanthoangelol was isolated from the root extract using column chromatography and used as a standard for quantitative analysis. The structure of the isolated compound was established based on spectroscopic evidence. The HPLC-DAD method was validated for specificity, linearity, precision, accuracy, limit of detection, and limit of quantitation. The calibration curve of xanthoangelol had significant linearity (R2>0.9999). Limit of detection and limit of quantitation 0.018 and 0.059 ㎍/mL, respectively. The relative standard deviation values of precision test, and intra- and inter-day tests were less than 0.22 and 0.40%, respectively. In the recovery test, the accuracy ranged from 98.98-102.78% with RSD values less than 0.13%. The method validation parameters indicate the applicability of the HPLC method for quality control of food or drug formulations containing L. bicolor.
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문제 정의
Xanthoangelol은 신경 암세포와 백혈병 세포주에서 항암효과, 종양 프로모토 활성과 전이에 대한 억제 효능 및 항염작용으로 인한 비만 억제 효능과 다양한 범위에서 항산화 작용이 있다고 알려져 있다(Akihisa 등, 2003; Kimura와 Baba, 2003; Li 등, 2016; Sumiyoshi 등, 2015; Tabata K, 2005). 본 연구에서는 생리학적 기능성과 이용 가능성이 있는 싸리나무 유효성분 xanthoangelol를 부위별 최적의 추출 조건 탐색, HPLC-DAD 분석법을 확립하여 기능성 소재 개발을 위한 기초자료를 제공하고자 한다.
제안 방법
HPLC-DAD 시스템을 사용하여 크로마토그래피 분석을 수행하였다. 이 장비는 펌프, DAD 검출기 및 자동 샘플러로 구성되었다.
잎, 줄기 및 뿌리 95% 에탄올 추출물에 대한 크로마토그램과 UV 스펙트럼을 비교 분석한 결과 줄기와 뿌리 껍질추출물에서만 xanthoangelol 화합물을 확인할 수 있었다. Xanthoangelol은 다양한 생리활성이 보고된 만큼 기능성 식품 소재로 활용하기에 적합한 물과 에탄올로 추출 하여 정량분석을 실시하였다. 추출용매에 따른 싸리나무 줄기와 뿌리의 xanthoangelol 정량분석 결과는 Table 4와 같다.
833 min에서 single peak로 단일물질임을 확인하였다. 구조 동정을 위해 NMR 분석과 HREIMS 측정을 실시하였으며 이들 결과를 토대로 구조를 결정하였다. UV spectrum 측정 결과 210, 370 nm 파장의 peak를 확인했으며(Fig.
분석하고자 하는 xanthoangelol의 농도 범위를 포함하는 농도에 비례하여 HPLC로 분석한 피크 면적 값을 관계로 검량선을 측정 하였고 상관계수(R2) 값을 이용하여 직선성을 확인하였다.
싸리나무 부위별(줄기/뿌리) 수피를 균질하여 분쇄하여 50 mesh 의 체를 통과한 미세입자를 선별하여 건시료 5 g에 50 mL의 water, 30, 50, 70, 95% EtOH을 사용하여 25±5 ℃로 2 h씩 초음파 추출한 후 상층액을 취하고 0.45 μm PTFE syringe filter(Advantech, CA, USA)로 여과하여 HPLC 분석에 사용하였다.
싸리나무 유효성분인 xanthoangelol를 지표성분으로 제안하고 이의 분석법을 개발하였다. 특이성 시험을 통해 분석 대상 물질을 다른 물질의 간섭 없이 분리될 수 있도록 370 nm의 검출 파장으로 ZORBAX Eclipse plus C 18(4.
대상 데이터
본 실험에 사용된 싸리나무는 경북 봉화군 문수산 일대에서 2018년에 채집하여 음건하여 사용하였으며, 국립백두대간수목원 송세규 박사가 동정하였다. 그 표본(BDNA-2018-302)은 국립백두 대간수목원 표본실에 보관하였다.
데이터처리
HPLC-DAD 분석법의 재현성 및 정확도를 검증하기 위해 ICH Guideline에 기초하여 직선성(linearity), 검출한계(LOD, limit of detection) 및 정량한계(LOQ, limit of quantitation) 측정, 반복 실험을 통한 정밀성(precision) 평가, 회수율(recovery) 시험을 통한정확성(accuracy) 평가를 실시하였다(ICH harmonized tripartite guideline, 2005).
모든 분석은 3회 이상 반복 수행하였고, 결과는 평균±표준편차(mean±SD)로 기술하였다. 각 실험 결과는 SAS program (Statistical Analysis System, version 8.1, SAS Institute Inc., NC, USA)을 이용하여 one-way ANOVA와 Duncan’s multiple-range test (p<0.05)로 비교하였다.
모든 분석은 3회 이상 반복 수행하였고, 결과는 평균±표준편차(mean±SD)로 기술하였다. 각 실험 결과는 SAS program (Statistical Analysis System, version 8.
정밀성, 정확성을 평가하기 위해 함량분석과 동일한 추출조건 에서 세 가지 농도(15.63, 31.25, 62.50 μg/mL)를 제조 및 추출하여 RSD 값을 분석하였으며 Intra-, Inter-day의 RSD 값은 Table 3 과 같이 0.06-0.22, 0.13-0.40% 범위로 나타났다. Xanthoangelol의정확성 평가를 위해 15.
정밀성은 균일한 검체로부터 여러 번 채취 한 시료를 정해진 조건에 따라 측정하였을 때 측정값들 사이의 근접성(분산 정도) 를 나타내는 것으로 intra-day는 하루 동안 3회 반복측정해서 나온 표준편차를 평균치를 나눈 상대표준편차로 나타내었으며, interday는 2일간 3회 반복 측정한 후 얻은 표준편차를 평균치로 나눈 상대표준편차로 나타내었다. 정확성은 시험방법에 따른 측정값이 표준값에 근접한 정도를 말하는 것으로 반복 측정한 시료의 회수율과 상대표준편차 값(RSD)으로 정확성을 평가하였다.
정밀성은 균일한 검체로부터 여러 번 채취 한 시료를 정해진 조건에 따라 측정하였을 때 측정값들 사이의 근접성(분산 정도) 를 나타내는 것으로 intra-day는 하루 동안 3회 반복측정해서 나온 표준편차를 평균치를 나눈 상대표준편차로 나타내었으며, interday는 2일간 3회 반복 측정한 후 얻은 표준편차를 평균치로 나눈 상대표준편차로 나타내었다. 정확성은 시험방법에 따른 측정값이 표준값에 근접한 정도를 말하는 것으로 반복 측정한 시료의 회수율과 상대표준편차 값(RSD)으로 정확성을 평가하였다.
성능/효과
13%로 나타났다. Precision 및 accuracy는 모두 2% 이내의 높은 재현성을 나타내었으며 이와 같은 결과를 토대로 본 분석법의 표준화가 가능함을 확인하였다(Table 3).
n-Hexane, ethyl acetate를 사용하여 column chromatography를 통해 분리한 화합물 xanthoangelol은 노란색 분말이며 HPLC chro-matogram 확인 결과 retention time 28.833 min에서 single peak로 단일물질임을 확인하였다. 구조 동정을 위해 NMR 분석과 HREIMS 측정을 실시하였으며 이들 결과를 토대로 구조를 결정하였다.
본 시험법의 검증 과정을 통하여 xanthoangelol에 대한 상기 HPLC-DAD 분석법이 싸리나무 부위별 추출물의 정량 분석에 이용하기에 충분한 것을 알 수 있었다. 잎, 줄기 및 뿌리 95% 에탄올 추출물에 대한 크로마토그램과 UV 스펙트럼을 비교 분석한 결과 줄기와 뿌리 껍질추출물에서만 xanthoangelol 화합물을 확인할 수 있었다.
추출용매에 따른 싸리나무 줄기와 뿌리의 xanthoangelol 정량분석 결과는 Table 4와 같다. 싸리나무 줄기와 뿌리 모두 95% EtOH에서 xanthoangelol의 함량이 127.41, 437.42 μg/mL로 가장 높은 것으로 나타났고 두 용매의 조성에서 EtOH 비율이 높아질수록 xanthoangelol 함량 또한 증가하는 것을 확인하였다. Water에서는 xanthoangelol이 추출되지 않아 크로마토그램에서 확인할 수 없었다.
1의 carbonyl carbon이 H-β, H-α, H-6'와 correlation을 확인함으로써 위치를 확정 지을 수 있었다. 이상의 연구결과로부터, 싸리나무 메탄올 추출물로부터 xanthoangelol으로 동정하였으며, 기타 1D/2D NMR spectral data가 보고된 문헌치와 일치함을 확인 하였다.
후속연구
Water에서는 xanthoangelol이 추출되지 않아 크로마토그램에서 확인할 수 없었다. 이상의 결과는 싸리나무의 대표적인 기능성 물질인 xanthoangelol에 대한 추출 및 분리, 분석에 관한 기초자료로서 다양한 식의약 소재로의 개발 시에 활용 가능할 것으로 생각된다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
싸리나무(Lespedeza bicolor)의 특징은?
싸리나무(Lespedeza bicolor)는 전국 산야에서 2-3 m 높이로 흔히 자라고 7-8월에 꽃이 피고 하나의 잎자루에 3개씩의 잎이 달리고 작은 잎이 타원형이며 엽맥의 연장인 짧은 침상의 돌기가 있는 콩과의 낙엽관목으로 우리나라와 일본, 대만에 주로 분포한다. 싸리나무는 특유의 약리효과가 뛰어나 진해, 거담, 만성 기관지염, 지혈, 해열 등의 치료 및 이뇨제와 건비제 등으로 사용되고 있으며 민간요법으로 피부질환 치료제로 이용해 왔다(Korea National Arboretum, 2012; Lee, 1972).
싸리나무의 의학적 용도는?
싸리나무(Lespedeza bicolor)는 전국 산야에서 2-3 m 높이로 흔히 자라고 7-8월에 꽃이 피고 하나의 잎자루에 3개씩의 잎이 달리고 작은 잎이 타원형이며 엽맥의 연장인 짧은 침상의 돌기가 있는 콩과의 낙엽관목으로 우리나라와 일본, 대만에 주로 분포한다. 싸리나무는 특유의 약리효과가 뛰어나 진해, 거담, 만성 기관지염, 지혈, 해열 등의 치료 및 이뇨제와 건비제 등으로 사용되고 있으며 민간요법으로 피부질환 치료제로 이용해 왔다(Korea National Arboretum, 2012; Lee, 1972). 싸리나무에 관한 연구는 꾸준하게 발표되고 있으며, 부위별(잎, 줄기, 뿌리) 추출물의 자유라디칼 소거 활성, 산화적 스트레스, 멜라닌 생합성에 관여하는 tyrosinase 억제 활성 및 면역 활성 등이 보고된 바 있다(Lee 등, 2005a; Lee 등, 2005b; Lee 등, 2011; Lee과 Jhoo 2012; Lee 등, 2016; Ryu 등, 2007).
싸리나무의 약리적 기능에 대한 연구한 것은?
최근 연구 결과에 따르면 추출물로부터 주성분/미량성분 분리·정제 및 구조 확인과 동시에 그 약리적 기능에 관한 연구도 활발히 진행 중이다. Woo 등(2011)에 따르면 뿌리에서 3종의 신규 화합물 포함한 6개의 단일 화합물은 bacterial neuraminidas를 저해함으로써 항박테리아성을 가지고, Do 등(2017)은 줄기에 존재하는 17개의 metabolite가 methylglyoxal (MGO)에 의해 유도된 advanced glycation end products (AGE)를 저해함으로 endothelial dysfunction의 예방 또는 치료제로의 이용 가능성을 연구하였다. Ullah(2017)는 싸리나무 지상부와 지하부 추출물의 phytochemical을 분석하였고 Human lung carcinoma cell (LU-1)과 human prostate carcinoma (LnCaP) cell line에 가능성 있는 천연의 항암 후보 물질이 될 수 있을 것이라 제시하였다.
참고문헌 (20)
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