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문제 정의
- 건강기능식품공전시험법의 액체크로마토그래피/자외부흡 광도를 이용한 아미노산분석법인 폴리감마글루탐산 제2법12) 을 참고하여 전처리 및 기기분석 조건을 변화시켜 최적의 표준화된 시험법을 확립하고자 하였다. 우선 이동상 용매 로 사용되는 20 mM 인산수소이나트륨과 90% 아세토니트릴 비율 82:18을 비율 85:15, 90:10 으로 달리하여 비교 실험하였으며 전처리용매를 0.
- 이에 본 연구에서는 4-hydroxy-L-isoleucine 분석법을 검토하고 시험법 검증 가이드라인11)을 참고하여 밸리데이션 을 수행한 후 국내에서 유통 중인 건강기능식품에 대한 적용성을 확인하여 최적의 분석법을 확립하고자 한다.
제안 방법
- 4-Hydroxy-L-isoleucine 10mg을 정밀히 취하여 증류수에 녹여 표준원액(100 μg/mL)으로 하고, 표준원액을 증류수로 희석하여 5, 10, 20, 40, 60, 80, 100μg/mL의 농도로 희석하여 검량선 작성을 위한 표준용액으로 하였다.
- 4-Hydroxy-L-isoleucine을 분석하기 위해 Photo diode array detector (PDA) (Accela PDA 80, Thermo Fisher Scientific Co., Waltham, MA, USA)가 장착된 Highperformance liquid chromatography (HPLC) (Nanospace SI-2, Shiseido Co., Osaka, Japan)를 사용하였으며 컬럼은 Capcell Pack C18 UG120 (4.6 × 250 mm, 5 μm) (Shiseido Co., Osaka, Japan)이었고, 이동상으로는 Table 1과 같이 20 mM 인산수소이나트륨(pH 7.8, 20 mM 인산이수소나트륨으로 조정)과 90% 아세토니트릴을 85:15 비율로 혼합하여 0.7 mL/min 유속으로 측정파장은 338 nm로 하여 분석하였다.
- 건강기능식품공전시험법의 폴리감마글루탐산 제2법 시험법과 개별인정형 기능성 원료 시험법을 참고하여 0.02 N 염산과 증류수로 전처리조건을 달리하여 분석함량을 비교하였다. 그 결과 표준품 및 시료의 피크면적값과 머무름 시간에 큰 차이가 없어 추출용매를 보다 간편한 시험법인 증류수로 선택하였다[Table 2].
- 건강기능식품공전시험법의 폴리감마글루탐산 제2법에서 이동상 용매를 20 mM 인산수소이나트륨과 90% 아세토니트릴 비율 82:18로 사용하였으나 피크 분리도를 높이기 위해 이동상 비율을 85:15, 90:10 으로 달리하여 표준용액과 시험용액의 피크 분리도를 비교하였다. 그 결과 이동상 비율 85:15로 분석하였을 때 상대적으로 가장 분리도가 높았으며 머무름시간 8.
- 시료에 존재하는 참값과 가까운 농도를 시료에 추가하여 회수율을 측정하였다. 검출한계와 정량한계의 경우 표준용액을 3회 분석한 검량선의 기울기와 y절편 값을 이용하여, 검량선 y절편 값의 표준편차에 3.3배를 곱한 값을 기울기 평균값으로 나눈 것을 검출한계, 10배를 곱한 값에 기울기 평균값으로 나눈 것을 정량한계로 설정하였다. 정밀도는 시료량의 변화에 대한 반복 정밀도(반복성, repeatability)를 확인하기 위하여 1개의 표본시료를 선정하였으며, 시료 100 mg, 150 mg, 200 mg을 취하여 5회 반복 측정하였다.
- 02 N 염산과 증류수로 전처리조건을 달리하여 분석함량을 비교하였다. 그 결과 표준품 및 시료의 피크면적값과 머무름 시간에 큰 차이가 없어 추출용매를 보다 간편한 시험법인 증류수로 선택하였다[Table 2].
- 정밀도는 시료량의 변화에 대한 반복 정밀도(반복성, repeatability)를 확인하기 위하여 1개의 표본시료를 선정하였으며, 시료 100 mg, 150 mg, 200 mg을 취하여 5회 반복 측정하였다. 마지막으로 실험실간 정밀도(reproducibility)를 확인하기 위하여 3개 실험실에서 표본시료를 5회 반복 측정하였다.
- 02 N 염산과 증류수로 비교 실험하였다. 시료량 비교를 위해 시료 채취량을 100, 150, 200 mg으로 비교 실험하였다.
- 3배를 곱한 값을 기울기 평균값으로 나눈 것을 검출한계, 10배를 곱한 값에 기울기 평균값으로 나눈 것을 정량한계로 설정하였다. 정밀도는 시료량의 변화에 대한 반복 정밀도(반복성, repeatability)를 확인하기 위하여 1개의 표본시료를 선정하였으며, 시료 100 mg, 150 mg, 200 mg을 취하여 5회 반복 측정하였다. 마지막으로 실험실간 정밀도(reproducibility)를 확인하기 위하여 3개 실험실에서 표본시료를 5회 반복 측정하였다.
- 정확도는 표준물질 첨가법을 이용하여 비타민 C(10 ng/mL)를 공시험용액으로 회수율을 확인하였고, 표준용액을 첨가하였을 때 최종농도가 20, 40, 60 μg/ mL이 되도록 설정하여 진행하였다. 시료에 존재하는 참값과 가까운 농도를 시료에 추가하여 회수율을 측정하였다. 검출한계와 정량한계의 경우 표준용액을 3회 분석한 검량선의 기울기와 y절편 값을 이용하여, 검량선 y절편 값의 표준편차에 3.
- 시료에서 4-hydroxy-L-isoleucine 성분이 검출되는 농도 범위를 중간값으로 설정하여 총 7개의 농도 5, 10, 20, 40,60, 80, 100 μg/mL를 검토하였다.
- 특이성을 확인하기 위하여 표준품과 시료에서의 분리도 및 머무름 시간을 확인하였다. 직선성은 시료에서 성분이 검출되는 농도범위를 중간값으로 설정하여 총 7개의 농도 5, 10, 20, 40, 60, 80, 100 μg/mL를 검토하였으며, 표준용액만을 이용하여 산출하였고, 시험 시 나타날 수 있는 오차범위를 확인하기 위하여 각 농도에 대해서 3반복 실험을 수행하였다. 정확도는 표준물질 첨가법을 이용하여 비타민 C(10 ng/mL)를 공시험용액으로 회수율을 확인하였고, 표준용액을 첨가하였을 때 최종농도가 20, 40, 60 μg/ mL이 되도록 설정하여 진행하였다.
- 실험실간 정밀도(reproducibility)를 확인하기 위하여 1개의 표본시료를 선정하여 세 실험실에서 각각 5회 반복 측정했다. 4-hydroxy-L-isoleucine에 대한 재현성의 상대표준 편차를 확인한 결과 0.
- 건강기능식품공전시험법의 액체크로마토그래피/자외부흡 광도를 이용한 아미노산분석법인 폴리감마글루탐산 제2법12) 을 참고하여 전처리 및 기기분석 조건을 변화시켜 최적의 표준화된 시험법을 확립하고자 하였다. 우선 이동상 용매 로 사용되는 20 mM 인산수소이나트륨과 90% 아세토니트릴 비율 82:18을 비율 85:15, 90:10 으로 달리하여 비교 실험하였으며 전처리용매를 0.02 N 염산과 증류수로 비교 실험하였다. 시료량 비교를 위해 시료 채취량을 100, 150, 200 mg으로 비교 실험하였다.
- 단, 건강기능식품의 경우 기능성 원료뿐만 아니라 다양한 원료가 복합된 제품으로도 제조되기 때문에 시료량의 설정시 지표성분을 기준으로 설정하는 것이 적절하다. 이에 시료량 최소 100 mg에서 최대 200 mg 칭량함을 기준으로 하여 4-hydroxy-L-isoleucine으로서 최소 1.5 mg 최대 3 mg 인 100, 150, 200 mg으로 시료량 설정을 검토하였다. 분석 결과 표시량 대비 회수율이 90% 이상으로 시료 채취량을 4-hydroxy-L-isoleucine으로서 1.
- 3배를 곱한 값을 기울기 평균값으로 나눈 것을 검출한계, 10배를 곱한 값에 기울기 평균값으로 나눈 것을 정량한계로 설정하였다. 정밀도는 시료량의 변화에 대한 반복 정밀도(반복성, repeatability)를 확인하기 위하여 1개의 표본시료를 선정하였으며, 시료 100 mg, 150 mg, 200 mg을 취하여 5회 반복 측정하였다. 마지막으로 실험실간 정밀도(reproducibility)를 확인하기 위하여 3개 실험실에서 표본시료를 5회 반복 측정하였다.
- 정확도는 표준물질 첨가법을 이용하여 비타민 C(10 ng/mL)를 공시험용액으로 회수율을 확인하였고, 표준용액을 첨가하였을 때 최종농도가 20, 40, 60 μg/ mL이 되도록 설정하여 진행하였다.
- 직선성은 시료에서 성분이 검출되는 농도범위를 중간값으로 설정하여 총 7개의 농도 5, 10, 20, 40, 60, 80, 100 μg/mL를 검토하였으며, 표준용액만을 이용하여 산출하였고, 시험 시 나타날 수 있는 오차범위를 확인하기 위하여 각 농도에 대해서 3반복 실험을 수행하였다.
- 특이성을 확인하기 위하여 표준품과 시료에서의 분리도 및 머무름 시간을 확인하였다. 직선성은 시료에서 성분이 검출되는 농도범위를 중간값으로 설정하여 총 7개의 농도 5, 10, 20, 40, 60, 80, 100 μg/mL를 검토하였으며, 표준용액만을 이용하여 산출하였고, 시험 시 나타날 수 있는 오차범위를 확인하기 위하여 각 농도에 대해서 3반복 실험을 수행하였다.
- 표준물질 첨가법을 이용하여 비타민 C(10 ng/mL)를 공 시험용액으로하여 회수율을 확인하였고, 표준용액을 첨가하였을 때 최종농도가 20, 40, 60 μg/mL이 되도록 설정하여 진행하였다.
- 시료에 존재하는 참값과 가까운 농도를 시료에 추가하여 회수율을 측정하였다. 검출한계와 정량한계의 경우 표준용액을 3회 분석한 검량선의 기울기와 y절편 값을 이용하여, 검량선 y절편 값의 표준편차에 3.3배를 곱한 값을 기울기 평균값으로 나눈 것을 검출한계, 10배를 곱한 값에 기울기 평균값으로 나눈 것을 정량한계로 설정하였다. 정밀도는 시료량의 변화에 대한 반복 정밀도(반복성, repeatability)를 확인하기 위하여 1개의 표본시료를 선정하였으며, 시료 100 mg, 150 mg, 200 mg을 취하여 5회 반복 측정하였다.
대상 데이터
- 4-Hydroxy-L-isoleucine의 표준품은 Boc scientific사 (Shirley, NY, USA)로부터 구입하였고 인산수소이나트륨과 인산이수소나트륨은 Sigma사(St. Louis, MO, USA), 아세 토니트릴은 Merck사(Whitehouse Station, NJ, USA)로부터 HPLC급으로 구입하여 사용하였다. 유도체화에 사용되는 borate buffer (Cas.
- 시료 전처리와 이동상에 사용되는 물은 3차 증류수(Distilled water)로 18.0 MΩ 이상인 것을 사용하였다.
- 0 MΩ 이상인 것을 사용하였다. 시료는 호로파종자추출물을 기능성 원료로 하는 건강기능식품 3건을 인터넷을 통해 구입하였다.
- Louis, MO, USA), 아세 토니트릴은 Merck사(Whitehouse Station, NJ, USA)로부터 HPLC급으로 구입하여 사용하였다. 유도체화에 사용되는 borate buffer (Cas. 5061-3339)와 OPA reagent (Cas. 5061- 3335)는 Agilent Technologes (Santa Clara, CA, USA)로부터 구입하여 사용하였다. 시료 전처리와 이동상에 사용되는 물은 3차 증류수(Distilled water)로 18.
이론/모형
- 수거한 건강기능식품에 대하여 확립된 4-hydroxy-Lisoleucine 시험법을 이용하여 지표성분의 함유량에 대해 적용성 검토를 수행하였다. 그 결과 총 3건의 유통제품에 서 각각 13.
성능/효과
- 실험실간 정밀도(reproducibility)를 확인하기 위하여 1개의 표본시료를 선정하여 세 실험실에서 각각 5회 반복 측정했다. 4-hydroxy-L-isoleucine에 대한 재현성의 상대표준 편차를 확인한 결과 0.5%로 나타났다(Table 6).
- 시료량의 변화에 대한 반복 정밀도(반복성, repeatability) 를 확인하기 위하여 1개의 표본시료를 선정하였으며, 시료 100 mg, 150 mg, 200 mg을 취하여 5회 반복 측정하였다. 각 농도의 상대표준편차(%RSD)를 확인한 결과 1.1, 0.6, 0.5%로 나타났다(Table 5).
- 시료에 존재하는 참값과 가까운 농도를 시료에 추가하여 회수율을 측정하였다. 그 결과 4-hydroxyL-isoleucine에 대한 회수율은 91.7-96.4%로 나타났으며 상대표준편차는 0.2-2.4%로 나타났다(Table 4).
- 건강기능식품공전시험법의 폴리감마글루탐산 제2법에서 이동상 용매를 20 mM 인산수소이나트륨과 90% 아세토니트릴 비율 82:18로 사용하였으나 피크 분리도를 높이기 위해 이동상 비율을 85:15, 90:10 으로 달리하여 표준용액과 시험용액의 피크 분리도를 비교하였다. 그 결과 이동상 비율 85:15로 분석하였을 때 상대적으로 가장 분리도가 높았으며 머무름시간 8.9분으로 상대적으로 적절하여 이동 상 비율 85:15로 기기조건을 선택하였다(Fig. 1).
- 수거한 건강기능식품에 대하여 확립된 4-hydroxy-Lisoleucine 시험법을 이용하여 지표성분의 함유량에 대해 적용성 검토를 수행하였다. 그 결과 총 3건의 유통제품에 서 각각 13.4, 17.4, 25.5 mg/g으로 분석되었고 표시 함량 대비 91-103%로 기준규격에 적합함을 확인하였다(Table 7).
- 2는 표준용액과 시험용액을 분석한 크로마토그램이며 동일한 위치에서 단일 피크가 형성되는지 확인하였다. 그 결과 표준용액과 시험용액에서 4-hydroxy-L-isoleucine의 머무름 시간 8.9분으로 일치함을 확인할 수 있었고 분리된 피크의 정점에서 PDA 스펙트럼 패턴이 표준용액과 시험용액에서 일치함을 확인할 수 있었다.
- 5 mg 최대 3 mg 인 100, 150, 200 mg으로 시료량 설정을 검토하였다. 분석 결과 표시량 대비 회수율이 90% 이상으로 시료 채취량을 4-hydroxy-L-isoleucine으로서 1.5-3 mg으로 선정하였다[Table 3].
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