Skeletonema pseudocostatum의 세포는 규산질 성분의 돌기에 의한 사슬 형태로, 길이는 6~17.3 ㎛였고, 엽록체는 세포 당 1~2개를 포함하고 있었다. 주사전자현미경 관찰결과 Skeletonema 종을 구분할 수 있는 가장자리 받침돌기끝(terminal fultoportula process)은 끝이 갈라지거나, 갈고리 모양이었고, 길이가 1.67±0.5 ㎛이고, 개각의 가장자리에 위치해 있으며, 개수는 8.10±1.1개로 개각의 크기에 따라 다양하게 나타났다. 말단세포 입술돌기(terminal rimoportula process)는 두꺼운 원통형의 나팔관 모양으로, 개각의 중앙 근처에 위치하였고, 길이는 1.1±0.6 ㎛였으며, 개수는 1개였다. 연결세포 받침돌기(intercalary fultoportula process)는 대부분 1 : 1 결합으로 서로 맞물려 있는 형태였고, 1 : 2 결합도 종종 발견되었다. 계통분석 결과는 형태적 특징이 유사한 종 간의 유전학적 거리가 가깝다는 것을 나타냈고, 지리적 기원이 다른 동일 종의 경우, 유전적 차이를 보이지 않았다. 이는 S. pseudocostatum은 지리적 위치와 상관없이 유전적 차이가 나타나지 않는 단일계통(monophyly)이라는 것을 의미한다.
Skeletonema pseudocostatum의 세포는 규산질 성분의 돌기에 의한 사슬 형태로, 길이는 6~17.3 ㎛였고, 엽록체는 세포 당 1~2개를 포함하고 있었다. 주사전자현미경 관찰결과 Skeletonema 종을 구분할 수 있는 가장자리 받침돌기끝(terminal fultoportula process)은 끝이 갈라지거나, 갈고리 모양이었고, 길이가 1.67±0.5 ㎛이고, 개각의 가장자리에 위치해 있으며, 개수는 8.10±1.1개로 개각의 크기에 따라 다양하게 나타났다. 말단세포 입술돌기(terminal rimoportula process)는 두꺼운 원통형의 나팔관 모양으로, 개각의 중앙 근처에 위치하였고, 길이는 1.1±0.6 ㎛였으며, 개수는 1개였다. 연결세포 받침돌기(intercalary fultoportula process)는 대부분 1 : 1 결합으로 서로 맞물려 있는 형태였고, 1 : 2 결합도 종종 발견되었다. 계통분석 결과는 형태적 특징이 유사한 종 간의 유전학적 거리가 가깝다는 것을 나타냈고, 지리적 기원이 다른 동일 종의 경우, 유전적 차이를 보이지 않았다. 이는 S. pseudocostatum은 지리적 위치와 상관없이 유전적 차이가 나타나지 않는 단일계통(monophyly)이라는 것을 의미한다.
Morphology of a strain of unspecified Skeletonema species established from Korean coast was examined by light, fluorescence and scanning electron microscopy, and SSU(small subunit) and LSU(large subunit) rDNA of the strain were also sequenced. The specimen was characterized by solitary or short chai...
Morphology of a strain of unspecified Skeletonema species established from Korean coast was examined by light, fluorescence and scanning electron microscopy, and SSU(small subunit) and LSU(large subunit) rDNA of the strain were also sequenced. The specimen was characterized by solitary or short chains, and each cell contained 1-2 chloroplasts. The valve face was slightly convex, and the terminal fultoportula processes (TFPPs) were open and showed narrow distal ends that could be truncated or spiny with claw-like protrusions. The basal part of the TFPPs was tubular and oblique to the cell axis. The intercalary fultoportula processes (IFPPs) were also narrow, completely open, and joined in a 1 : 1 junction. Occasionally, one IFPP was connected with two opposing IFPPs. The morphological features of the specimen were identical to those of Skeletonema pseudocostatum. Molecular phylogeny based on SSU rDNA revealed that the Korean strain is nested within a clade comprising S. pseudocostatum and S. tropicum. However, based on D1-D2 LSU rDNA sequences, a clade including S. pseudocostatum and a Korean strain was separated from the S. tropicum clade. This indicates that the Korean strain can be identified as S. pseudocostatum. This species represents the first record from Korean coastal waters.
Morphology of a strain of unspecified Skeletonema species established from Korean coast was examined by light, fluorescence and scanning electron microscopy, and SSU(small subunit) and LSU(large subunit) rDNA of the strain were also sequenced. The specimen was characterized by solitary or short chains, and each cell contained 1-2 chloroplasts. The valve face was slightly convex, and the terminal fultoportula processes (TFPPs) were open and showed narrow distal ends that could be truncated or spiny with claw-like protrusions. The basal part of the TFPPs was tubular and oblique to the cell axis. The intercalary fultoportula processes (IFPPs) were also narrow, completely open, and joined in a 1 : 1 junction. Occasionally, one IFPP was connected with two opposing IFPPs. The morphological features of the specimen were identical to those of Skeletonema pseudocostatum. Molecular phylogeny based on SSU rDNA revealed that the Korean strain is nested within a clade comprising S. pseudocostatum and S. tropicum. However, based on D1-D2 LSU rDNA sequences, a clade including S. pseudocostatum and a Korean strain was separated from the S. tropicum clade. This indicates that the Korean strain can be identified as S. pseudocostatum. This species represents the first record from Korean coastal waters.
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문제 정의
본 연구는 한국해양과학기술원의 해양식물플랑크톤 기탁등록보존기관에서 보존하고 있는 Skeletonema 속의 배양주(strain)를 이용하여 종의 형태적 특징과 계통분류학적 특성을 분석하였다. 그 결과, 분석 종이 국내에서는 기록되어 있지 않은 S.
제안 방법
PCR 산물은 1% agarose gel에 전개하고 Midori Green Advance (NIPPON Genetics, Co., Ltd., Tokyo, Japan)로 염색하여 UV 하에서 DNA 밴드를 확인하였고, QIAquick PCR purification kit (Qiagen, Valencia, CA)를 사용하여 PCR 산물을 정제한 후 ABI PRISM® 3700 DNA Analyzer (Applied Biosystems, USA)을 사용하여 염기서열을 분석하였다.
S. pseudocostatum의 Genomic DNA (gDNA) 추출을 위해 대수성장기의 배양주 1 mL을 1.5 mL tube에 분주하여 원심분리기로 침전시킨 후 상등액을 제거하고 세포만 농축하여 -20℃의 냉동실에 보관하였다. 농축된 배양주의 gDNA은 DNeasy Plant Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA)를 사용하여 매뉴얼에 따라 추출되었다.
S. pseudocostatum의 SSU rDNA 염기서열은 Alverson et al. (2005) 및 Sarno et al. (2005)을 참고하여 총 40개, LSU rDNA는 Sarno et al. (2005)을 참고하여 총 36개의 정렬된 염기서열 정보를 추가한 후 MEGA v. 7.0.26 프로그램을 사용하여 매뉴얼로 정렬하였다. 정렬된 염기서열의 적합한 유전자 모델을 찾기 위해 MEGA v.
S. pseudocostatum의 군체(chain) 길이와 모양, 엽록체 구조 등의 형태적 특징은 광학현미경(Primo Vert, Zeiss, Germany)과 형광현미경(Axio Imager 2; Zeiss, Germany) 으로 관찰하였고, 돌기(process)의 구조와 위치 등의 미세구조는 전계방출형 주사전자현미경( JSM7600, Jeol, Tokyo, Japan)으로 관찰하였다. 주사전자현미경 관찰을 위해 S.
농축된 배양주의 gDNA은 DNeasy Plant Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA)를 사용하여 매뉴얼에 따라 추출되었다. Small subunit (SSU) rDNA 유전자 부위의 염기서열 분석을 위해 forward primer: SSU11+(5ʹ-TGATCCTGCCAG TAGTCATACGCT-3ʹ), reverse primer: SSU1147-(5ʹ-AG TTTCAGCCTTGCG ACCATAC -3ʹ)을 사용하였고 (Alverson et al. 2007), large subunit (LSU) rDNA는 forward primer: LSU D1R(5ʹ-ACCCGCTGAATTTAAGCATA3ʹ), reverse primer: LSU R2 (5ʹ-ATTCGGCAGGTGAGTTG TTAC-3ʹ)를 이용하여(Takano and Horiguchi 2006), PCR 을 수행하였다. PCR 반응액의 경우 5 μL 10X Ex Taq Buffer (Mg2+plus), 1.
pseudocostatum 배양주는 최종농도 2%인 Lugol 용액으로 고정한 후, 에탄올 시리즈(10, 30, 50, 70, 90, 99, 99%) 로 시료를 15분씩 탈수하였고, 임계점 건조법(critical point drying method) (Spi-DryTM Regular Critical Point Dryer, SPI Supplies, West Chester, PA, USA)을 통해 건조하였다. 건조된 시료는 aluminum stub에 고정하고 백금코팅(platinum)하여 5~15Kv, 8.0mm working distance 하에서 관찰하였다.
26 프로그램을 사용하여 최대유사분석(Maximun-likelihood analysis; ML)을 분석하였다. 그리고, 계통수의 유연 관계를 평가하기 위해 1,000회의 bootstrap을 수행하였다. 베이즈 추론 (Bayesian Inference; BI)은 MrBayes 3.
5 mL tube에 분주하여 원심분리기로 침전시킨 후 상등액을 제거하고 세포만 농축하여 -20℃의 냉동실에 보관하였다. 농축된 배양주의 gDNA은 DNeasy Plant Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA)를 사용하여 매뉴얼에 따라 추출되었다. Small subunit (SSU) rDNA 유전자 부위의 염기서열 분석을 위해 forward primer: SSU11+(5ʹ-TGATCCTGCCAG TAGTCATACGCT-3ʹ), reverse primer: SSU1147-(5ʹ-AG TTTCAGCCTTGCG ACCATAC -3ʹ)을 사용하였고 (Alverson et al.
(2005, 2007)의 분석 결과에 의하면, Skeletonema 속은 종에 따라 TFPP와 TRPP의 개수 및 길이, IFPP 결합, 둘레띠 모양 등의 형태가 다르다. 이에 따라 S. pseudocostatum을 포함한 8종의 Skeletonema의 미세구조를 비교하였다(Table 1). S.
pseudocostatum의 군체(chain) 길이와 모양, 엽록체 구조 등의 형태적 특징은 광학현미경(Primo Vert, Zeiss, Germany)과 형광현미경(Axio Imager 2; Zeiss, Germany) 으로 관찰하였고, 돌기(process)의 구조와 위치 등의 미세구조는 전계방출형 주사전자현미경( JSM7600, Jeol, Tokyo, Japan)으로 관찰하였다. 주사전자현미경 관찰을 위해 S. pseudocostatum 배양주는 최종농도 2%인 Lugol 용액으로 고정한 후, 에탄올 시리즈(10, 30, 50, 70, 90, 99, 99%) 로 시료를 15분씩 탈수하였고, 임계점 건조법(critical point drying method) (Spi-DryTM Regular Critical Point Dryer, SPI Supplies, West Chester, PA, USA)을 통해 건조하였다. 건조된 시료는 aluminum stub에 고정하고 백금코팅(platinum)하여 5~15Kv, 8.
대상 데이터
Thalassiosira rotula (AJ633505) and Thalassiosira sp. (AJ633506) were selected as the outgroup. The numbers on each node are the bootstrap values (%) and the Bayesian Posterior Probability (PP).
S. pseudocostatum은 1998년 5월 8일에 욕지도(34°38ʹ 30.2ʺN, 128°16ʹ22.7ʺE)에서 20 μm 망목 크기의 식물플랑 크톤 네트를 수평 예인하여 채집되었다.
데이터처리
그리고, 계통수의 유연 관계를 평가하기 위해 1,000회의 bootstrap을 수행하였다. 베이즈 추론 (Bayesian Inference; BI)은 MrBayes 3.1.2를 사용하였고, 분석이 완료된 이후에는 분석결과를 바탕으로 하여 각 종 간의 계통유연관계를 밝히는 분자계통도를 작성하였고, 분자계통도의 확인은 MEGA 프로그램으로 수행하였다.
26 프로그램을 사용하여 매뉴얼로 정렬하였다. 정렬된 염기서열의 적합한 유전자 모델을 찾기 위해 MEGA v. 7.0.26 프로그램에 서 Modeltest를 수행하였고, 최적 모델은 SSU rDNA의 경우 TIM3+G(A:C:G:T=0.2867 : 0.1822 : 0.2397 : 0.2914; p-inv=0; gamma shape=0.3090), LSU rDNA는 GTR+I (A :C: G : T=0.2573 : 0.1962 : 0.2932 : 0.2534; p-inv=0.6370; gamma shape=0)을 선정하여 MEGA v. 7.0.26 프로그램을 사용하여 최대유사분석(Maximun-likelihood analysis; ML)을 분석하였다. 그리고, 계통수의 유연 관계를 평가하기 위해 1,000회의 bootstrap을 수행하였다.
이론/모형
S. pseudocostatum의 단일 군체는 모세관 방법으로 분리하였고, 온도 20℃, 염분 33 psu 및 광량 100 μmol m-2 s-1 하에 f/2 배지에서 배양하였다.
성능/효과
Maximum-likelihood (ML) tree showing the phylogenetic position of Skeletonema pseudocostatum based on partial nuclear-encoded SSU rDNA sequences. Pleurosira laevis (AF525670), Lithodesmium undulatum (Y10569), Helicotheca tamesis (X85385), Ditylum brightwellii (X8538) and Porosira pseudodenticulata (X85398) was selected as the outgroup. The numbers on each node are the bootstrap values (%) and the Bayesian Posterior Probability (PP).
Skeletoenma 속의 진화적 유연관계는 4개의 그룹(Group) 으로 구분되었고(Figs. 3, 4), S. pseudocostatum는 S. tropicum 과 함께 Group A에 포함되었다. Skeletonema 속은 형태적으로 유사성을 보였던 만큼, 종간 유전적 거리도 가까웠는데, 특히 S.
연결세포 받침돌기(intercalary fultoportula process)는 대부분 1 : 1 결합으로 서로 맞물려 있는 형태였고, 1 : 2 결합도 종종 발견되었다. 계통분석 결과는 형태적 특징이 유사한 종 간의 유전학적 거리가 가깝다는 것을 나타냈고, 지리적 기원이 다른 동일 종의 경우, 유전적 차이를 보이지 않았다. 이는 S.
(2009)은 국내 연안에 출현하는 Skeletonema 종들을 대상으로 주사전자현미경을 이용하여 구체적인 형태적 특징을 관찰하였다. 그 결과, S. dohrnii, S. marioni, S. subsalsum, S. tropicum 등 4종을 확인하였지만 기존에 빈번하게 보고되어 온 S. costatum의 출현은 확인하지 못했다. 따라서, 국내 연안에서 출현하는 Skeletonema 종은 구체적인 형태 분석과 함께 분자계통학적 연구를 통해 동정을 명확히 할 필요가 있다.
본 연구는 한국해양과학기술원의 해양식물플랑크톤 기탁등록보존기관에서 보존하고 있는 Skeletonema 속의 배양주(strain)를 이용하여 종의 형태적 특징과 계통분류학적 특성을 분석하였다. 그 결과, 분석 종이 국내에서는 기록되어 있지 않은 S. pseudocostatum으로 확인되어, 그 출현을 기록한다.
주사전자현미경 관찰 결과 Skeletonema 종을 구분할 수 있는 가장자리 받침돌기 끝(terminal fultoportula process)은 끝이 갈라지거나, 갈고리 모양이었고, 길이가 1.67±0.5 μm이고, 개각의 가장 자리에 위치해 있으며, 개수는 8.10±1.1개로 개각의 크기에 따라 다양하게 나타났다.
이는 SSU rDNA을 통한 계통학적 분석으로 두 종을 구분할 수 없다는 것을 의미한다. 하지만 LSU rDNA 구간의 염기서열 분석 결과에서 S. tropicum는 S. pseudocostatum과 함께 Group A로 구분되었지만, 유전적 거리에서 차이를 나타내었고, 유사도 분석(similarity analysis)결과 본 배양주와 97% 일치하는 결과를 보였다. 이처럼 SSU rDNA 결과에서는 구분되지 않았던 S.
한편, LSU rDNA 염기서열의 유사도 분석(similarity analysis)결과 본 배양주는 여러 지역에서 기록된 분리주의 염기서열과 100% 일치하는 결과를 보였다. 이는 S.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
Skeletonema 속은 어떻게 명명되었는가?
Skeletonema 속은 바베이도스 주변의 에오세 후기 퇴적물로부터 관찰된 Skeletonema barbadense Grev.을 기준 종(type species)으로 하여 명명되었다(Greville 1865). Greville (1866)은 홍콩 연안에서 발견된 돌말류 표본과 요크셔 연안의 해초류(ascidian)의 위장에서 발견된 표본이 동일한 종임을 확인하고, 그 종을 Melosira costata Grev.
S. pseudocostatum Medlin은 S. costatum과 어떤 부분에서 구별되는가?
S. pseudocostatum Medlin은 받침돌기 외부형태, 입술돌기(rimoportula process)의 위치와 유전적 차이에 의해 S. costatum과 구별된다(Medlin et al.
S. pseudocostatum의 군체 돌기(process)의 구조와 위치 등의 미세구조를 관찰하기 위해 전계방출형 주사전자현미경을 사용하였는데, 이를 위해서 어떤 처리를 해줬는가?
pseudocostatum의 군체(chain) 길이와 모양, 엽록체 구조 등의 형태적 특징은 광학현미경(Primo Vert, Zeiss, Germany)과 형광현미경(Axio Imager 2; Zeiss, Germany) 으로 관찰하였고, 돌기(process)의 구조와 위치 등의 미세구조는 전계방출형 주사전자현미경( JSM7600, Jeol, Tokyo, Japan)으로 관찰하였다. 주사전자현미경 관찰을 위해 S. pseudocostatum 배양주는 최종농도 2%인 Lugol 용액으로 고정한 후, 에탄올 시리즈(10, 30, 50, 70, 90, 99, 99%) 로 시료를 15분씩 탈수하였고, 임계점 건조법(critical point drying method) (Spi-DryTM Regular Critical Point Dryer, SPI Supplies, West Chester, PA, USA)을 통해 건조하였다. 건조된 시료는 aluminum stub에 고정하고 백금코팅(platinum)하여 5~15Kv, 8.0mm working distance 하에서 관찰하였다.
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