[논문]제주도 탈염 용암해수 재배로 제조한 브로콜리 추출물의 신경 세포 보호 효과

이진설; 장윤비; 최지선; 정재준; 강승우

doi:10.12925/jkocs.2020.37.3.448

제주도 탈염 용암해수 재배로 제조한 브로콜리 추출물의 신경 세포 보호 효과
Neuroprotective effects of Extract of Broccoli, Cultivated in Desalinated Magma Seawater, on neuron-like SH-SY5Y cells 원문보기

Journal of the Korean Applied Science and Technology = 한국응용과학기술학회지, v.37 no.3, 2020년, pp.448 - 462

이진설 ((주)아리바이오) , 장윤비 ((주)아리바이오) , 최지선 ((주)아리바이오) , 정재준 ((주)아리바이오) , 강승우 ((주)아리바이오)

초록
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식이 영양에 의한 충분한 영양분 섭취는 치매에 의한 뇌 인지 기능의 저하의 위험성을 줄일 수 있는 중요한 수단이다. 설포라판은 뇌 인지 기능 개선효과가 있는 것으로 알려져 있는 영양 성분으로, 설포라판이 다량으로 포함된 브로콜리 추출물은 인지 기능 개선 효과가 좋을 것으로 기대된다. 본 연구에서는 제주도 탈염 용암해수 재배로 제조한 브로콜리 추출물이 뇌 인지 기능 개선 효과를 가지고 있는지 시험하였다. 제주도 용암해수는 유용 미네랄 (아연, 바나듐, 게르마늄)이 풍부해서, 용암 해수에서 재배한 작물은 유용미네랄 함량이 높은 것으로 알려 져 있다. 제주도 탈염 용암 해수를 사용해서 재배한 브로콜리 추출물의 화학 조성 중 설포라판과 글루코라판 성분을 분석하기 위해 LC-Q-orbitrap 질량 분석기를 사용하였고, 설포라판의 정량 분석을 위해 HPLC 를 사용하였다. 브로콜리 추출물의 신경 세포 사멸 억제 효과와 항 염증 효과를 시험하기 위해 SH-SY5Y 세포를 사용한 실험을 수행하였고, 시냅스 가소성 촉진 효과를 시험하기 위해 SH-SY5Y 세포에서 시냅스 가소성 관련 단백질의 발현 변화와 아세틸콜린 분해 효소의 활성 변화를 측정하였다. 이러한 실험들을 수행한 결과 탈염 염지하수로 재배한 브로콜리 추출물은 신경 세포 사멸 억제 효과와 항염증 효과가 있음을 확인 하였고, 시냅스 가소성 관련 단백질 발현을 증가 시키고 아세틸콜린 분해 효소의 활성을 억제해서 시냅스 가소성을 증가 시키는 효과가 있는 것을 확인 하였다. 이상의 결과들은 제주도 탈염 용암해수로 재배한 브로콜리 추출물이 치매에 의한 뇌 인지 기능 저하를 억제하는 좋은 식이 영양분으로 사용될 수 있는 가능성을 제시하였다.

Abstract ▼ AI-Helper

Dietary nutrition is a critical lifestyle factor that can reduce the risk of future cognitive impairments caused by dementia. Accumulating evidence suggests that dietary supplementation with Sulforaphane may help the prevention of cognitive impairments and dementia. Thus, Sulforaphane-enriched broccoli extract would hold promise to improve cognitive impairments of dementia patients. Here, we have used broccoli extracts, prepared from broccoli cultivated in Magma Seawater, to test if the broccoli extracts can be dietary supplement to improve cognitive impairments. Magma Seawater originated from Jeju Island, Korea is unique in terms of containing high concentrations of usable minerals (Zinc, Vanadium and Germanium etc.). Broccoli, grown in Magma Seawater, would contain Sulforaphane and the extra amount of usable minerals. The chemical compositions of the broccoli extracts were analyzed using LC-Q-orbitrap to detect Sulforaphane and Glucoraphanin. Analysis method based on HPLC was developed for measurement of sulforaphane levels in the broccoli extracts. We have tested if the broccoli extracts have anti-apoptotic and anti-inflammatory effects on neuron-like SH-SY5Y cells. In addition, we examined if the broccoli extracts are able to upregulate expression of synaptic plasticity-associated proteins (BDNF and phospho-CREB) and to inhibit acetylcholine esterase (AchE) activity. We have shown that the broccoli extracts inhibited the apoptotic pathway and inflammatory responses. Finally, we present evidence showing that AchE activity was inhibited by the broccoli extracts, but expression of BDNF and phospho-CREB was upregulated. Taken together, these findings suggest that the broccoli extracts from Magma Seawater-grown broccoli would be a good source of dietary nutrition to improve cognitive impairments in the future.

주제어

표/그림 (8)

그림 Fig. 1. Qualitative peak identification of Sulforaphane and Glucoraphanin in Magma Seawater broccoli extracts by High-resolution Accuracy Mass spectrometer (HRAM).
표 Table 1. Qualitative peak identification of Sulforaphane and Glucoraphanin in Magma Seawater broccoli extracts by High-resolution Accuracy Mass spectrometer (HRAM)
그림 Fig. 2. Cytotoxicity test of broccoli extracts, prepared from broccolis cultivated in desalinated magma seawater of Jeju island(korea), in differentiated neuron-like SH-SY5Y cells.
표 Table 2. Summary of Sulforaphane validation results by HPLC in Magma Seawater broccoli extracts
그림 Fig. 3. Inhibitory effects of Magma Seawater broccoli extracts against Aβ-induced apoptosis in differentiated neuron-like SH-SY5Y cells.
그림 Fig. 4. Anti-inflammatory effects of Magma Seawater broccoli extracts against H₂O₂-induced activation of NF-κB transcriptional factor in differentiated neuron-like SH-SY5Y cells.
그림 Fig. 5. Inhibitory effects of Magma Seawater broccoli extracts against H₂O₂-induced inflammatory responses in differentiated neuron-like SH-SY5Y cells.
그림 Fig. 6. Inhibition of Acetylcholinesterase (AchE) activity and enhancement of BDNF secretion by Magma Seawater broccoli extracts in differentiated neuron-like SH-SY5Y cells.

AI 본문요약
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문제 정의

탈염 과정을 거쳐 만들어진 탈염 용암해수로 식물을 재배할 경우, 일반 농업용수 재배시 보다 식물 내 미네랄 함량이 증가하는 것이 확인되었으며, 여러 기능성 2차 대사산물들을 증가되어 식물의 성장 속도를 향상시키는 것으로 보고되었다 [8]. 본 연구에서는 탈염 용암해수를 이용한 브로콜리 재배로 유용 미네랄이 다량 함유된 브로콜리를 생산을 할 수 있는 장점이 있다는 것에 착안해서, 용암해수로 재배한 브로콜리의 추출물이 알쯔하이머성 치매 환자들의 인지 기능 개선에 효과적인 천연 식의약소재로 활용할 수 있는 가능성을 확인하고자 하였다.

제안 방법

Aβ1-42 monomer를 1% FBS(HyCloneTM), 1% P/S(HyCloneTM)을 함유하는 DMEM/F12 Complete Medium(HyCloneTM)에 human Aβ 1-42(Abcam, Cambridge, MA, USA)를 1μM 혹 은 10 μM이 되도록 첨가하여 37℃, 5% CO2 조건 하에 3시간 동안 저장해서 Aβ oligomer 가 형성되도록 하였다.
Aβ1-42 oligomer를 72시간 동안 37℃, 5% CO2 조건 하에서 처리하고, 증류수에 녹인 다른 농도 (10, 50 그리고 100 μg/ml)의 브로콜리 추출물을 24시간 동안 37℃, 5% CO2 조건 하에 단독 혹은 병용 처리하였다.
HPLC (Agilent 1100 series; Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA)을 이용한 브로콜리 추출물 시료 내 Sulforaphane 기준 및 시험방법 확립을 위한 분석을 진행하였다. 시료를 50% 에탄올(Honeywell, Ulsan, Republic of Korea)에 용해한 후 Synergi Fusion C18(4 μm, 4.
3A). N-Acetylcysteine (NAC)는 강력한 항산화제로서 신경세포 사멸 억제 효과를 가지고 있기 때문에, 양성 대조군으로 사용하였다. 브로콜리 추출물에 의한 세포 사멸 억제는 cleaved PARP/Total PARP, cleaved Caspase-3/Total Caspase-3, Bax/Bcl2의 비율을 감소시키는 효과가 있다 (Fig.
NE-PER™ Nuclear and Cytoplasmic Extraction Kit (Thermo Fisher Scientific, MA, USA)을 사용하여 핵과 세포질 단백질을 분리 추출하였다.
SH-SY5Y 세포를 10% FBS(HyCloneTM)와 1% P/S(HyCloneTM)을 함유한 DMEM/F12 Complete Medium(HyCloneTM)를 배양 후, neuron-like differentiation을 위해서 세포배양 배지를 1% FBS(HyCloneTM), 1% P/S (HyCloneTM), 10 μM all-trans-retinoic acid (RA; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)를 포함하는 DMEM/F12 분화용 배지로 교체해 주었다.
TBS-T solution으로 3회 세척 후 SuperSignal™ West Femto Maximum Sensitivity Substrate(Thermo Fisher Scientific)에 넣고 각각 알맞은 시간만큼 발색시킨 후 LuminoGraph Ⅰ(WSE-6100, Atto) 장비를 사용하여 스캔 후 Image J Software(NIH, Bethesda, MD, USA)를 이용하여 단백질의 양을 산출하였다.
UPLC(Ultimate 3000; Thermo Fisher Scientific)로 높은 압력에서 샘플 내 성분을 용출되게 한 후, Orbitrap을(Q Exactive plus; Thermo Fisher Scientific) 탑재한 고분해능 질량분석기(High-resolution Accuracy mass spectrometer)를 이용해 검출된 화합물을 chromatogram 에 표시하였다 (Fig. 1). 검출된 성분 중 현재 브로콜리 추출물의 지표성분으로 지정한 Sulforaphane, Glucoraphanin을 동시에 확인할 수 있었다.
UPLC/Q-Orbitrap(Ultimate 3000; Q Exactive plus; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)을 이용한 용암 해수 재배 브로콜리 추출물 시료 내 성분 규명(Identification)을 위한 분석을 진행하였다. 분석 결과의 다양성을 기하기 위해 질량분석기 조건은 Positive mode와 Negative mode를 병행하여 분석하였으며, 각 분석 mode에 사용한 LC 용매로는 Positive mode는 0.
세포 배양액을 Pierce Protein Concentrator PES, 3K MWCO (Thermo Fischer Scientific, MA, USA)를 사용하여 4℃ 에서 4000rpm에서 30분 동안 원심 분리 를 하여 농축하였다. 농축된 세포 배양액을 Human BDNF ELISA Kit (Abcam, MA, USA) 에 포함된 96 well microplate에 분주하여 상온에서 3시간 동안 반응시키고, Kit에 포함된 Wash Solution으로 4회 세척하고 Biotinylated Anti-Human BDNF Detector Antibody를 가하여 상온에서 1시간 동안 반응시켰다. Wash Solution으로 4회 세척하고, HRP-StreptavidinSolution과 상온에서 45분 동안 반응 시킨 후 Wash Solution으로 4회 세척하였다.
45, 규격 : 68 x 500L, 형대 : Double Open, 재질 : PP)로 여과 후 얻어진 여과액은 45℃에서 추출액이 30~40 brix가 될 때까지 농축을 진행하였다. 농축이 완료된 후 동결건조기(ilShinBioBase Co. Ltd., Gyeonggi, Korea)를 이용하여 건조 시료 (Sulforaphane 2700ppm)를 제조하였다.
Cell(BioRad)과 Transfer buffer(Tris/Glycine Buffer(BioRad), 20% methanol(Duksan Pure Chemical)를 사용하여 PVDF membrane(Bio-Rad)으로 단백질 증착을 수행한다. 단백질이 증착된 PVDF membrane을 5%(w/v) skim milk solution(Tris Buffered Saline(TBS) Buffer(Bio-Rad), 0.1% Tween 20(Bio-Rad), 5% Difco^TM Skim Milk(BD Bioscience, San Jose, CA, USA))으로 60분 동안 blocking 하였다. 인산화된 단백질의 경우는 3%(w/v) BSA(bovine srum albumin) solution(TBS Buffer(Bio-Rad), 0.
따라서, 100μg/ml를 최대 농도 처리 조건으로 하여, 브로콜리 추출물에 의한 신경세포 사멸 억제 와 염증반응 억제 그리고 시냅스 가소성 증가 실험을 수행하였다.
본 연구에서는 탈염 용암해수를 이용한 브로콜리 재배로 유용 미네랄이 다량 함유된 브로콜리 추출물을 Q-Orbitrap Mass spectrometer로 성분을 규명하고, HPLC로 기준 및 시험방법을 설정하여 표준화하였고, 알쯔하이머성 치매 발병에 중요한 Aβ 단백질에 의해 유도되는 신경 세포 사멸을 억제하는 실험 결과를 얻었다.
분석 결과의 다양성을 기하기 위해 질량분석기 조건은 Positive mode와 Negative mode를 병행하여 분석하였으며, 각 분석 mode에 사용한 LC 용매로는 Positive mode는 0.1% formic acid(Daejung, Siheung, Republic of Korea)가 포함된 물 (용매 A)과 Acetonitrile (용매 B; Honeywell, Ulsan, Republic of Korea)을 사용했으며, Negative mode는 10 mM ammonium formate(Daejung, Siheung, Republic of Korea)와 0.1% formic acid(Daejung)가 포함된 물 (용매 A)과 Acetonitrile (용매 B; Honeywell)을 사용하여 분석하였다.
Louis, MO, USA)를 포함하는 DMEM/F12 분화용 배지로 교체해 주었다. 분화 3일째에 배지를 새 DMEM/F12 분화용 배지로 교체해 주었고, 분화 6일째 다양한 실험 조건으로 새 DMEM/F12 분화용 배지 첨가하여 교체해 주고 신경세포 사멸, 신경세포 염증 반응, 시냅스 가소성 관련 실험을 진행하였다.
분화한 SH-SY5Y 세포에 기존 세포 배양액을 제거하고 Aβ1-42 oligomer를 72시간 동안 37℃, 5% CO2 조건 하에서 처리한 후 증류수에 녹인 다른 농도 (10, 50 그리고 100 μg/ml)의 브로콜리 추출물을 포함하는 DMEM/F12 Complete Medium(HyCloneTM)를 24 시간 동안 37℃, 5% CO2 조건 하에 단독 혹은 병용처리 하였다.
분화한 SH-SY5Y 세포에서 기존 세포 배양액을 제거하고 300 μM H2O2(Sigma-Aldrich)와 증류수에 녹인 다른 농도 (10, 50 그리고 100 μ g/ml)의 브로콜리 추출물을 포함하는 DMEM/ F12 Complete Medium(HyCloneTM)를 24 시간 동안 37℃, 5% CO2 조건 하에 단독 혹은 병용 처리 하였다.
브로콜리 추출물에 의한 세포 독성 평가를 위해, 신경 세포처럼 분화한 SH-SY5Y 세포에 각기 다른 농도의 브로콜리 추출물을 24시간, 48시간, 72 시간 동안 처리한 후 세포 생존율을 측정하였다. 최대 125μg/ml의 농도에서 72시간 처리 조건에서도 세포 독성이 나타나지 않음을 확인하였다.
브로콜리 추출물을 증류수에 다른 농도 (0, 15.6, 31.3, 62.5, 125, 250, 500 그리고 1000 μg/mL)로 녹여서 준비하고, 분화한 SH-SY5Y 세포에 24시간, 48시간, 72시간 동안 처리한 후 Cell Counting Kit-8 (Dojindo Molecular Technologies, Japan)를 사용하여 세포 생존율을 측정하였다.
탈염 용암해수(desalinated magma seawater) 수경재배 브로콜리 새싹(Broccoli Sprout)은 ‘(주) 비케이바이오(Jeju, Korea)’에서 제공받았다. 수경 재배 조건은 육상생물 생산 시스템(Smart farm) 에서 온도 22~25℃와 습도 40~60% 범위 내에 배양되었으며, 브로콜리 새싹은 새싹 재배기에서 2일(암조건)간 발아 후 5일간 재배하였다. 브로콜리 새싹 제조 공정 및 실험을 (주)비케이바이오 (Jeju, Korea)에서 수행하였다.
시료를 50% 에탄올(Honeywell, Ulsan, Republic of Korea)에 용해한 후 Synergi Fusion C18(4 μm, 4.6×250 mm; Phenomenex) 역상 컬럼으로 0.1% formic acid(Daejung)가 포함된 물 (용매 A)과 Acetonitrile (용매 B; Honeywell)을 사용하여 분석하였다.
유속은 0.2 mL/min, 컬럼 온도는 40℃, autosampler 온도 10℃, 시료 주입량 5 μL로 분석하였다.
준비된 단백질과 4x Laemmli Buffer(Bio-Rad, Hercules, CA, USA)을 3:1 비율로 혼합한 후에 95℃에서 10분간 끓여 단백질을 변성시킨 다음 얼음에서 식혀 western blot sample을 준비하였다. 적정한 SDS-PAGE gel을 Mini-Protein Ⅱ Dual-Slab Apparatus(Bio-Rad)에 위치시킨 후 running buffer(tris/glycine/SDS buffer; BioRad)를 채워주고 protein size marker(Bio-Rad) 와 각 샘플들을 stacking gel의 각 well에 분주하여 전기영동해 분자량에 따라 단백질을 분리하였다.

대상 데이터

Cytotoxicity test of broccoli extracts, prepared from broccolis cultivated in desalinated magma seawater of Jeju island(korea), in differentiated neuron-like SH-SY5Y cells. Experiments were performed in triplicate. The percentage of cell viability was normalized against the no treatment control at 24h.
Cell lysates were analyzed by western blotting with the appropriate antibodies (B, C, D) Graphical representation of the ratios of cleaved/total caspase-3, cleaved/total PARP and Bax/Bcl-2 protein levels. Experiments were performed in triplicates. Error bars denote the standard deviation of the mean (SD), and the P-values were obtained using the Student’s t-test.
SH-SY5Y human neuroblastoma cell line은 American Type Culture Collection(ATCC; Manassas, VA, USA)로부터 구매하였고 10% fetal bovine serum(FBS; Australian Orgin,HyCloneTM, Logan, UT, USA)과 1% penicillin/streptomycin(P/S; HyCloneTM)을 함유 한 DMEM/F12 Complete Medium(HyCloneTM) 를 사용하여 37℃, 5% CO2조건 하에 CO2 incubator(311-TIF, Thermo Fisher Scientific Forma®, MA, USA)에서 배양하였다.
분석 시 사 용한 컬럼은 Luna Omega PS C18(1.6 μm, 2.1×150 mm; Phenomenex, Torrance, CA, USA) 역상 컬럼이며, 분리 분석 조건은 다음과 같다.
수경 재배 조건은 육상생물 생산 시스템(Smart farm) 에서 온도 22~25℃와 습도 40~60% 범위 내에 배양되었으며, 브로콜리 새싹은 새싹 재배기에서 2일(암조건)간 발아 후 5일간 재배하였다. 브로콜리 새싹 제조 공정 및 실험을 (주)비케이바이오 (Jeju, Korea)에서 수행하였다. 브로콜리 새싹 원물을 pulsed electric field (PEF) (Elea, DIL, Quakenbrueck, Germany)로 0-10kJ에서 1~5초 동안 처리하였으며, PEF 처리 후 epithiospecifier protein (ESP) 불활성을 위해 정제수 첨가 후 80℃에서 10분간 가열 후 Myrosinase 활성을 위해 37℃로 냉각 후 2시간 동안 반응시켰다.
Western blot analysis를 위해서 사용한 1차 항체는 다음과 같다. 세포 사멸 관련 1차항체는 caspase-3(Abcam, Cambridge, MA, USA), cleaved caspase-3(Abcam), PARP(Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA), cleaved PARP(Cell Signaling Technology), BAX(Cell Signaling Technology), Bcl-2(Cell Signaling Technology)를 사용하였다. 세포 염증 관련 1차 항체는 NF-_κB p65(Cell Signaling Technology), Cox-2(Cell Signaling Technology), p44/42 MAPK(Erk1/2; Cell Signaling Technology), p-p44/42 MAPK(Erk1/2; Thr202/Tyr204; Cell Signaling Technology), SAPK/JNK(Cell Signaling Technology), p-SAPK/JNK(Thr183/Tyr185; Cell Signaling Technology), p38 MAPK(Cell Signaling Technology), p-p38 MAPK (Thr180/Tyr182; Cell Signaling Technology)를 사용하였다.
세포 염증 관련 1차 항체는 NF-κB p65(Cell Signaling Technology), Cox-2(Cell Signaling Technology), p44/42 MAPK(Erk1/2; Cell Signaling Technology), p-p44/42 MAPK(Erk1/2; Thr202/Tyr204; Cell Signaling Technology), SAPK/JNK(Cell Signaling Technology), p-SAPK/JNK(Thr183/Tyr185; Cell Signaling Technology), p38 MAPK(Cell Signaling Technology), p-p38 MAPK (Thr180/Tyr182; Cell Signaling Technology)를 사용하였다.
세포 염증 관련 1차 항체는 NF-_κB p65(Cell Signaling Technology), Cox-2(Cell Signaling Technology), p44/42 MAPK(Erk1/2; Cell Signaling Technology), p-p44/42 MAPK(Erk1/2; Thr202/Tyr204; Cell Signaling Technology), SAPK/JNK(Cell Signaling Technology), p-SAPK/JNK(Thr183/Tyr185; Cell Signaling Technology), p38 MAPK(Cell Signaling Technology), p-p38 MAPK (Thr180/Tyr182; Cell Signaling Technology)를 사용하였다. 시냅스 가소성 관련 일차 항체는 CREB(Cell Signaling Technology), p-CREB(Ser133) (Cell Signaling Technology)를 사용하였다. Western blot loading control에 대한 일차항체는 전체 포 단백질은 GAPDH(Cell Signaling Technology), 핵 단백질은 lamin B1(Cell Signaling Technology) 을 사용하였다.
조건 하에 단독 혹은 병용 처리 하였다. 양성 대조군으로는 항산화제인 1mM N-Acetylcysteine (NAC, Sigma-Aldrich) 를 사용하였다.
1% Tween 20(Bio-Rad), 5% Difco^TM Skim Milk(BD Bioscience, San Jose, CA, USA))으로 60분 동안 blocking 하였다. 인산화된 단백질의 경우는 3%(w/v) BSA(bovine srum albumin) solution(TBS Buffer(Bio-Rad), 0.1% Tween 20(Bio-Rad), 3% BSA(Sigma-Aldrich)을 사용하였다.
준비된 단백질과 4x Laemmli Buffer(Bio-Rad, Hercules, CA, USA)을 3:1 비율로 혼합한 후에 95℃에서 10분간 끓여 단백질을 변성시킨 다음 얼음에서 식혀 western blot sample을 준비하였다. 적정한 SDS-PAGE gel을 Mini-Protein Ⅱ Dual-Slab Apparatus(Bio-Rad)에 위치시킨 후 running buffer(tris/glycine/SDS buffer; BioRad)를 채워주고 protein size marker(Bio-Rad) 와 각 샘플들을 stacking gel의 각 well에 분주하여 전기영동해 분자량에 따라 단백질을 분리하였다.
탈염 용암해수(desalinated magma seawater) 수경재배 브로콜리 새싹(Broccoli Sprout)은 ‘(주) 비케이바이오(Jeju, Korea)’에서 제공받았다.

데이터처리

실험에서 얻은 결과에 대해서는 평균치±표준 편차(mean±SD)로 나타내었고, 각 실험군과 유 의성의 차이는 Student's T-Test로 분석해 P value 값이 0.05, 0.01 미만일 때 통계적으로 유 의한 차이가 있는 것으로 판정하였다.
Error bars denote the standard deviation of the mean (SD), and the P-values were obtained using the Student’s t-test.

성능/효과

4B, 4D). H2O2에 의해 유도된 염증 반응은 인산화된 p-ERK1/2(Thr202/Tyr204), p-SAPK/JNK(Thr 183/Tyr185)/p-p38 MAPK(Thr180/Tyr182)의 발현도 증가시키는 것을 Western blot 실험으로 확인하였고, 용암해수 브로콜리 추출물에 의해 인산화가 감소하는 것을 확인하였다 (Fig. 5A). 용암해수 브로콜리 추출물에 의해 p-ERK1/2(Thr202/Tyr204)/total ERK1/2, p-SAPK/JNK (Thr183/Tyr185)/total SAPK/JNK, p-p38 MAPK(Thr180/Tyr182)/total p38 MAPK 비율 이 100 μg/mL 처리 조건에서 감소하여, 유의미한 신경 염증 억제 효능이 있는 것을 확인하였다 (Fig.
SH-SY5Y 세포 외부로 배출되는 BDNF의 발현을 ELISA 실험 방법으로 측정 했는데, Aβ 단백질에 의해 감소된 BDNF의 배출이 용암 해수 브로콜리 추출물 50, 100 μ g/mL 처리 조건에서 유의미하게 증가하였다 (Fig.6B).
Sulforaphane을 정량하기 위한 HPLC 분석법을 검증하기 위해 5.5~165 ug/mL 농도 범위 내에서 분석하여 상관계수 0.99951을 얻었다, 직선성 결과에 의하여 계산된 검출한계 (LOD) 는 3.572 ug/mL, 정량한계 (LOQ)는 10.826 ug/mL 으로 측정되었다. 분석법의 재현성을 검토하기 위해 3종의 농도 조건으로 분석한 결과 정확도는 96.
1). 검출된 성분 중 현재 브로콜리 추출물의 지표성분으로 지정한 Sulforaphane, Glucoraphanin을 동시에 확인할 수 있었다. Sulforaphane은 분자량 177.
노화가 진행됨에 따라 필수적으로 축적되는 신경 염증 반응도 뇌인지 기능 저하와 밀접한 관계가 있는데, 탈염 용암해수 브로콜리 추출물이 신경 염증도 억제하는 효과가 있음을 확인하였다. 그 이외에도 탈염 용암해수 브로콜리 추출물이 뇌인지 기능 유지에 필수적인 시냅스 가소성 조절에 중요한 역할을 하는 신경 전달 물질인 ACh를 분해하는 효소인 AchE의 효소 활성을 억제하고, 신경 전달 물질 중 하나인 BDNF의 발현을 증가시키는 효과도 확인하였다. 탈염 용암해수 브로콜리 추출물에 의해 BDNF를 포함하는 신경 전달 물질의 발현을 증가시키는 CREB 전사 인자의 활성도 증가함을 확인하였다.
본 연구에서는 탈염 용암해수를 이용한 브로콜리 재배로 유용 미네랄이 다량 함유된 브로콜리 추출물을 Q-Orbitrap Mass spectrometer로 성분을 규명하고, HPLC로 기준 및 시험방법을 설정하여 표준화하였고, 알쯔하이머성 치매 발병에 중요한 Aβ 단백질에 의해 유도되는 신경 세포 사멸을 억제하는 실험 결과를 얻었다. 노화가 진행됨에 따라 필수적으로 축적되는 신경 염증 반응도 뇌인지 기능 저하와 밀접한 관계가 있는데, 탈염 용암해수 브로콜리 추출물이 신경 염증도 억제하는 효과가 있음을 확인하였다. 그 이외에도 탈염 용암해수 브로콜리 추출물이 뇌인지 기능 유지에 필수적인 시냅스 가소성 조절에 중요한 역할을 하는 신경 전달 물질인 ACh를 분해하는 효소인 AchE의 효소 활성을 억제하고, 신경 전달 물질 중 하나인 BDNF의 발현을 증가시키는 효과도 확인하였다.
826 ug/mL 으로 측정되었다. 분석법의 재현성을 검토하기 위해 3종의 농도 조건으로 분석한 결과 정확도는 96.6~98.9% 범위를 나타내었고, 정밀도는 5회 반복 분석 시 0.55~0.99% 범위로 측정되었다 (Table 2). 확립한 분석법으로 브로콜리 추출물을 분석한 결과 sulforaphane의 함량은 2700~3000 ppm을 나타내었다.
신경세포처럼 분화한 SH-SY5Y 세포에 1μM Aβ oligomer 단백질을 처리하면 AChE의 효소 활성이 증가하는데, 용암 해수 브로콜리 추출물은 50, 100 μg/mL 처리 조건에서 유의미한 AchE 활성 억제 효과가 있었다 (Fig. 6A).
용암해수 브로콜리 추출물에 의해 p-ERK1/2(Thr202/Tyr204)/total ERK1/2, p-SAPK/JNK (Thr183/Tyr185)/total SAPK/JNK, p-p38 MAPK(Thr180/Tyr182)/total p38 MAPK 비율 이 100 μg/mL 처리 조건에서 감소하여, 유의미한 신경 염증 억제 효능이 있는 것을 확인하였다 (Fig. 5B, 5C, 5D).
용암해수 브로콜리 추출물이 처리 농도 50, 100 μg/mL 조건에서 브로콜리 추출물의 NF-κB-p65 전사 인자의 세포핵 내로의 이동 억제와 Cox-2의 발현 억제에 유의미한 효과가 있었다 (Fig. 4B, 4D).
이러한 실험 결과는 용암해수 브로콜리 추출물이 처리 농도 50, 100 μg/mL 조건 에서 유의미한 신경 세포 사멸 억제 효능이 있는 것을 나타낸다.
인산화된 pCREB-Ser133 발현이 Aβ 단백질에 의해 감소되지만, 용암 해수 브로콜리 추출물 50, 100 μg/mL 처리 조건에서 유의미하게 증가하는 것을 확인하였다 (Fig. 6C, 6D).
최대 125μg/ml의 농도에서 72시간 처리 조건에서도 세포 독성이 나타나지 않음을 확인하였다.
그 이외에도 탈염 용암해수 브로콜리 추출물이 뇌인지 기능 유지에 필수적인 시냅스 가소성 조절에 중요한 역할을 하는 신경 전달 물질인 ACh를 분해하는 효소인 AchE의 효소 활성을 억제하고, 신경 전달 물질 중 하나인 BDNF의 발현을 증가시키는 효과도 확인하였다. 탈염 용암해수 브로콜리 추출물에 의해 BDNF를 포함하는 신경 전달 물질의 발현을 증가시키는 CREB 전사 인자의 활성도 증가함을 확인하였다. 이러한 연구 결과들은 탈염 용암해수를 이용해 재배한 브로콜리 추출물이 알쯔하이머성 치매 환자의 인지 기능 개선을 위한 효과적인 천연 식의약소재로 활용될 수 있음을 제안한다.
99% 범위로 측정되었다 (Table 2). 확립한 분석법으로 브로콜리 추출물을 분석한 결과 sulforaphane의 함량은 2700~3000 ppm을 나타내었다.

후속연구

탈염 용암해수 브로콜리 추출물에 의해 BDNF를 포함하는 신경 전달 물질의 발현을 증가시키는 CREB 전사 인자의 활성도 증가함을 확인하였다. 이러한 연구 결과들은 탈염 용암해수를 이용해 재배한 브로콜리 추출물이 알쯔하이머성 치매 환자의 인지 기능 개선을 위한 효과적인 천연 식의약소재로 활용될 수 있음을 제안한다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	용암해수는 무엇인가?	용암해수(Magma Seawater)는 제주 동부지역에 부존하는 염지하수로 현무암층에 의해 여과되어 화산 암반에서 유래한 유용 미네랄(아연, 바나듐, 게르마늄 등)을 다량 함유하고 있는 제주만이 보유한 독특한 수자원이다 [7]. 탈염 과정을 거쳐 만들어진 탈염 용암해수로 식물을 재배할 경우, 일반 농업용수 재배시 보다 식물 내 미네랄 함량이 증가하는 것이 확인되었으며, 여러 기능성 2차 대사산물들을 증가되어 식물의 성장 속도를 향상시키는 것으로 보고되었다 [8].
	SFN이 알쯔하이머성 치매 환자의 기억력을 개선하는 것은 어떤 효과에서 기인하는가?	브로콜리, 양배추, 콜리플라워 등의 십자화과 식물에 존재하는 Sulforaphane (1-isothiocyanato4-[methylsulfinyl]-butane, SFN)은 AD 치매 동물 모델에서 Aβ 단백질의 축적을 억제하고 신경 세포 사멸을 억제해서 인지 기능 개선 효과가 있음이 보고 되었다 [4-5]. 알쯔하이머성 치매 환자의 기억력 악화는 Aβ 단백질의 과도한 축적에 의한 시냅스 가소성의 감소로 인해 발생하는데, SFN이 신경 세포에서 시냅스 가소성 유지에 중요한 Brain-derived neurotrophic factor (BDNF) 의 발현을 증가시키는 효과가 있음이 알려져 있다 [6].
	알쯔하이머병에서 Aβ 단백질과 인산화된 타우 단백질의 비정상적 축적은 어떤 연관성으로 인지 기능의 저하를 야기하는가?	알쯔하이머병 (Alzheimer’s disease, AD)은 전체 치매 사례의 60-80%를 차지하는 것으로 추정되고, 뇌 조직에 아밀로이드 베타 (Amyloidβ, Aβ) 단백질과 인산화된 타우 (Tau) 단백질 이 비정상적으로 축적되어 뇌조직 퇴행을 일으키면서 급격한 뇌인지 기능의 퇴화를 일으키는 것으로 알려져 있다 [2]. Aβ 단백질에 의해 유발되는 신경세포 사멸과 시냅스 가소성의 감소는 인지 기능 저하와 밀접한 관계가 있고, 노화에 의해 축적되는 산화스트레스가 일으키는 염증반응은 인지 기능 저하를 가속화시키기도 한다 [3]. 브로콜리, 양배추, 콜리플라워 등의 십자화과 식물에 존재하는 Sulforaphane (1-isothiocyanato4-[methylsulfinyl]-butane, SFN)은 AD 치매 동물 모델에서 Aβ 단백질의 축적을 억제하고 신경 세포 사멸을 억제해서 인지 기능 개선 효과가 있음이 보고 되었다 [4-5].

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표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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