[논문]HaCaT 피부 각질세포의 산화적 스트레스에 대한 다정큼나무 에틸 아세테이트 분획물의 세포 보호 효과

양은주; 김혜란; 장경수; 장정현

doi:10.5352/jls.2020.30.8.688

HaCaT 피부 각질세포의 산화적 스트레스에 대한 다정큼나무 에틸 아세테이트 분획물의 세포 보호 효과
The Protective Effects of an Ethyl Acetate Fraction of Raphiolepsis indica Against Oxidative Stress in HaCaT Keratinocytes 원문보기

생명과학회지 = Journal of life science, v.30 no.8, 2020년, pp.688 - 694

양은주 (대구한의대학교 임상병리학과) , 김혜란 (대구한의대학교 임상병리학과) , 장경수 (부산가톨릭대학교 임상병리학과) , 장정현 (대구한의대학교 임상병리학과)

초록
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제주에서 자생하는 식물인 다정큼나무는 장미과에 속하는 관목으로 다정큼나무 잎 에탄올 추출물에서 높은 총페놀 함량이 확인되었다. 이를 바탕으로 본 연구에서는 다정큼나무 추출물에서 헥산, 디클로로메탄, 에틸 아세테이트, 부탄올, 물을 이용하여 분획물을 제조하고, 5가지 분획물의 항산화효과를 확인해보고자 하였다. 특히, 외부환경요인 및 자외선 등을 통해 산화적 스트레스가 많이 발생하는 피부각질세포에서의 항산화효과 및 세포보호효과를 확인하고자 사람 각질세포인 HaCaT세포를 이용하였다. 항산화능은 총 플라보노이드 함량 및 2-azino-bis 3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid (ABTS) 라디칼 소거능을 통해 관찰하였고 HaCaT 세포보호효과는 세포에 과산화수소(H₂O₂)와 추출물을 처리한 다음 3-[4, 5-dimethylthiazol-2-yl]-2, 5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) assay를 통해 확인하였다. 다정큼나무 잎 추출물 및 5가지 분획물 중 에틸 아세테이트 분획물에서 가장 높은 총플라보노이드 함량 및 가장 낮은 라디칼 잔여량이 관찰되었고 H₂O₂에 의한 HaCaT 세포의 산화적 스트레스를 가장 많이 차단하여 높은 생존율을 보였다. 이를 토대로 다정큼나무 잎 에틸 아세테이트 분획물은 높은 항산화 효과를 가지고 있어 사람 각질세포의 산화적 스트레스로부터 세포를 보호하는 효과를 가지고 있음이 확인되었다. 따라서, 본 연구 결과는 다정큼나무 잎 에틸 아세테이트 분획물을 이용하여 산화적 스트레스로 인한 피부 손상을 억제하는 기능성 물질 소재로 활용할 수 있을 것으로 제시한다.

Abstract ▼ AI-Helper

In a previous study, the total phenolic content in ethanol extracts of medicinal plants that naturally grow on Jeju Island were analyzed with the extracts of Raphiolepsis indica leaf found to have the highest. The current study was carried out to evaluate the total flavonoid content, radical-scavenging activity, and the protective effect of R. indica extracts and solvent fractions on oxidative stress in HaCaT keratinocytes. More specifically, total flavonoid content and 2-azino-bis 3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid (ABTS) radical-scavenging activity were measured to assess anti-oxidative activity, and protective effects against hydrogen peroxide (H2O2) were determined by 3-[4, 5-dimethylthiazol-2-yl]-2, 5-diphenyltetrazolium bromide assay on the HaCaT cells. Of the various fractions analyzed, the ethyl acetate extract of R. indica showed the highest total flavonoid content (149.13 mg/g extracts) and the lowest remaining ABTS. In addition, the ethyl acetate fraction was significantly more resistant against H2O2 than the negative control. Our results therefore suggest that an ethyl acetate fraction of R. indica protects HaCaT cells against oxidative stress and could prove useful for developing functional cosmetic materials.

주제어

표/그림 (6)

$Fig. 1. Preparation of fractions from Raphiolepsis indica.$ 그림 Fig. 1. Preparation of fractions from Raphiolepsis indica.
$Table 1. Total flavonoids content of extract and fractions from Raphiolepsis indica$ 표 Table 1. Total flavonoids content of extract and fractions from Raphiolepsis indica
그림 Fig. 2. ABTS radical remained rate of extract from Raphiolepsis indica.
$Table 2. ABTS radical remained rate of fractions from Raphiolepsis indica$ 표 Table 2. ABTS radical remained rate of fractions from Raphiolepsis indica
$Table 3. Cell viability of ethyl acetate and butanol fraction from Raphiolepsis indica$ 표 Table 3. Cell viability of ethyl acetate and butanol fraction from Raphiolepsis indica
$Fig. 3. Cell protection ability of ethyl acetate and butanol fraction from Raphiolepsis indica.$ 그림 Fig. 3. Cell protection ability of ethyl acetate and butanol fraction from Raphiolepsis indica.

AI 본문요약
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문제 정의

하지만 이러한 방어시스템에도 지속적인 외부 자극에 노출되면 과잉의 활성산소종이 발생하여 결국 산화적 스트레스를 유발하고 이로 인해 DNA 손상, 세포막 변성 및 세포 죽음을 유발하여 피부 노화 및 질병을 유발한다[26]. 그래서 본 연구에서는 사람 각질세포인 HaCaT 세포를 이용하여 과산화수소(H₂O₂)를 처리한 다음 산화적 스트레스에 대한 다정큼나무 분획물의 항산화 효과를 확인하고자 하였다. H₂O₂는 외내적 요인에 의해 체내에 생성되고 세포막을 통과하여 금속이완과 반응하여 또 다른 활성산소종을 생성시켜 세포 손상을 증가시킨다[8].
하지만, 각질세포에 대한 항산화 효과 및 그 외 다양한 생리학적 효능 평가에 대한 연구는 여전히 미비한 실정이다. 따라서, 본 연구에서는 다정큼나무의 잎 추출물로 라디칼 소거능 및 총 플라보노이드 함량을 확인하고, 헥산, 디클로로메탄, 에틸 아세테이트, 부탄올, 물 분획물을 이용하여 항산화효과 및 각질세포에 대한 보호효과를 확인하여 천연 항산화제 개발에 필요한 기초자료를 제공하고자 본 실험을 수행하였다.
77%의 세포 생존율이 관찰되어 세포독성이 있음을 확인하였다(Table 3). 따라서, 이후 HaCaT 세포에 처리하는 다정큼나무 추출물의 농도는 세포독성을 나타내지 않는 0.2 mg/ml 이하의 농도로 선정하여 실험하고자 하였다.
이 플라보노이드는 세포에서 NF-κB의 활성을 조절하여 항산화, 항염증, 항알러지 효과를 보이는 다양한 생물학적 활성을 가지고 있다[1, 27]. 본 연구에서도 다정큼나무의 항산화 효과를 확인하기 위해 대표적인 항산화 물질인 플라보노이드를 함유하고 있는지 확인하였다. 또한 각각의 용매로 인해 추출된 추출물의 플라보노이드 함량을 각각 확인하여 비교하였다.
한국의 경우에는 육지와 다른 환경적 요인들로 인해 제주에 특이적으로 7,800여종 이상의 식물이 자생하고 있으며, 이 식물들에 대한 다양한 생리활성 연구가 많이 진행되고 있다[17]. 현재까지 일부 효능들이 확인되고 있지만 여전히 부족한 실정으로 본 연구에 앞서 제주 자생식물들로부터 추출물을 제조하여 생리활성을 탐색하였다. 그 중 항산화 효능이 있는 페놀 함량을 확인한 결과 다정큼나무 잎의 에탄올 추출물에서 높은 함량의 페놀이 확인하였다[11].

제안 방법

Table 1에서 다정큼나무의 에틸 아세테이트 분획물에서 플라보노이드가 가장 높은 농도로 관찰되었기 때문에 항산화 효과와의 상관관계를 확인하고자 ABTS를 이용한 라디칼 소거능을 관찰하였다. ABTS는 청록색의 시약으로 항산화물질과 반응하여 양이온 라디칼이 소거되면서 무색으로 변하게 된다[5].
분말 건조된 시료에 에탄올로 2회 반복하여 추출하고 여과하여 얻어진 추출물을 감압농축하고 동결 건조시켰다. 건조된 에탄올 추출물에 약 10배의 증류수와 동량의 헥산으로 분획하고 감압 농축 후 헥산분획물을 얻고, 동일한 방법을 통해 디클로로메탄, 에틸 아세테이트, 부탄올 그리고 물 층의 분획물을 얻었다(Fig. 1). 추출물 및 분획물은 70% 에탄올을 이용하여 10 mg/ml 농도로 제조하여 사용되었다.
다정큼나무 잎 추출물 및 분획물의 총 플라보노이드 함량을 측정하기 위해 0.1% 다정큼나무 잎 추출물 및 분획물 0.5 ml에 diethylene glycol (Junsei Cemicals, Japan) 5 ml을 혼합하였다. 이 후 1 N NaOH를 0.
다정큼나무 잎 추출물 및 분획물의 항산화 효과를 확인하기 위해 플라보노이드 함량을 측정하였다. 플라보노이드는 식물의 이차대사산물의 일종으로 두 개의 페닐 고리 구조를 가지고 있는 물질이다[25].
본 연구에서도 다정큼나무의 항산화 효과를 확인하기 위해 대표적인 항산화 물질인 플라보노이드를 함유하고 있는지 확인하였다. 또한 각각의 용매로 인해 추출된 추출물의 플라보노이드 함량을 각각 확인하여 비교하였다. 다정큼나무 잎 추출물의 총 플라보노이드 함량은 75.
세포 배양은 5% CO₂, 37℃ 온도의 조건으로 배양되었다. 배양된 세포에 대한 다정큼나무 잎 분획물의 세포독성 정도를 확인하기 위해 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) assay를 변형하여 측정하였다[7]. 우선 96 well plate에 1×10⁴ cells/ml의 세포부유액을 100μl씩 분주 후 5% CO₂, 37℃ 온도의 조건으로 24시간 배양되었다.
라디칼 소거능이 확인된 분획물이 세포에서 직접적으로 항산화효과를 나타내는지 확인하고자 하였고 각 분획물의 진정한 항산화효과를 확인하기 위해서는 세포독성을 보이지 않는 농도를 우선적으로 확인하는 과정이 필요하다. 이를 확인하기 위해 다정큼나무 분획물 중 라디칼 소거능을 보인 에틸 아세테이트와 부탄올 분획물을 사람의 각질세포주인 HaCaT 세포에 농도별로 처리하였고 세포독성이 있는지 확인하고자 MTT assay를 실시하였다. 다정큼나무 분획물 중 에틸 아세테이트, 부탄올 분획물은 0.
이후 다정큼나무 잎 분획물의 최종농도가 0.025, 0.05, 0.1, 0.2 mg/ml이 되도록 제조하여 각 well에 100 μl씩 분주하여 5% CO2, 37℃ 온도의 조건으로 48시간 배양하였다.
다정큼나무 잎 추출물은 70% 에탄올을 이용하여 추출되었다. 이후, 다정큼나무 분획물 제조는 분획용 헥산, 디콜로로메탄, 에틸 아세테이트, 부탄올 그리고 물을 사용하여 용매 극성에 따라 순차적 추출법을 이용하였다. 분말 건조된 시료에 에탄올로 2회 반복하여 추출하고 여과하여 얻어진 추출물을 감압농축하고 동결 건조시켰다.
H₂O₂는 외내적 요인에 의해 체내에 생성되고 세포막을 통과하여 금속이완과 반응하여 또 다른 활성산소종을 생성시켜 세포 손상을 증가시킨다[8]. 일단, 다정큼나무의 에틸 아세테이트, 부탄올 분획물을 이용하여 H₂O₂로 유도된 HaCaT 세포의 산화적 손상에 대한 세포보호효과가 있는지 확인하기 위해 세포생존율을 관찰하였다. 그 결과, 에틸 아세테이트 분획물 0.
8 mg/ml로 희석된 다정큼나무 잎 추출물 및 분획물 190 μl와 혼합하여 실온 암실에서 6분간 반응시켰다. 최종적으로 Tecan Infinite F50 (Tecan, switzerland)을 이용하여 750 nm에서 흡광도를 측정하였다. 양성 대조군으로는 Quercetin (Sigma-Aldrich, USA)를 사용하였다.
최종적으로 배지 제거 후 dimethyl sulfoxide (DMSO) 200 μl를 분주하고 Tecan Infinite F50 (Tecan, switzerland)을 이용하여 560 nm에서 흡광도를 측정하였다.

대상 데이터

본 실험에 사용된 세포는 사람각질세포인 HaCaT 세포로 기본 배지는 Dulbecco's modified Eagle's medium (Hyclone, USA)을 사용하였고, 기본 배지에 0.1 mM non-essential amino acids (GIBCO, USA), 10% fetal bovine serum (GIBCO, USA) penicillin-streptomycin (GIBCO, USA)을 첨가하여 배양하였다.
최종적으로 Tecan Infinite F50 (Tecan, switzerland)을 이용하여 750 nm에서 흡광도를 측정하였다. 양성 대조군으로는 Quercetin (Sigma-Aldrich, USA)를 사용하였다.
다정큼나무 잎 분획물 제조

제주에 자생하고 있는 다정큼나무 잎을 2006년 03월 채집하여 채집된 시료를 증류수로 수세한 후 물기를 제거하고 2주간 음건하였다. 이 후, 분쇄하여 추출용 시료로 사용하였다.
이 후 Tecan Infinite F50 (Tecan, switzerland)을 이용하여 420 nm에서 흡광도를 측정하였다. 표준물질로는 naringin (Sigma-Aldrich, USA)을 사용하여 표준곡선을 작성하여 총 플라보노이드 함량을 환산하였다.

데이터처리

본 연구의 실험 결과는 3회 반복하여 평균±표준편차로 나타냈다.

이론/모형

HaCaT 세포의 산화적 스트레스에 대한 다정큼나무 잎 분획물의 세포 보호 효과를 확인하기 위해 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) assay로 세포 생존율을 확인하였다[7]. 96 well plate에 1X10⁴ cells/ml의 세포 부유액을 100 μl씩 분주 후 5% CO₂, 37℃ 온도의 조건으로 24시간 배양하고, 이후 다정큼나무 잎 분획물의 최종농도가 0.
다정큼나무 잎 추출물 및 분획물의 라디칼 소거능은 2-azino-bis 3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid (ABTS) assay를 이용하여 측정하였다[10]. 7 mM ABTS (Sigma-Aldrich, USA)와 2.

성능/효과

일단, 다정큼나무의 에틸 아세테이트, 부탄올 분획물을 이용하여 H₂O₂로 유도된 HaCaT 세포의 산화적 손상에 대한 세포보호효과가 있는지 확인하기 위해 세포생존율을 관찰하였다. 그 결과, 에틸 아세테이트 분획물 0.05, 0.1, 0.2 mg/ml에서 30.97, 43.36, 59.17%의 세포 생존율을 나타내며 물질을 처리하지 않은 대조군에 비해 세포생존율이 증가한 것을 확인하였다(Fig. 3A). 또한 부탄올 분획물 0.
93 mg/g extract로 확인하였다(Table 1). 다정큼나무 분획물 중 에틸 아세테이트 분획물에서 가장 높은 총 플라보노이드 함량이 관찰되었다. 이는 다정큼나무의 에틸 아세테이트 분획물의 항산화 효과가 다른 분획물에 비해 높을 것으로 기대할 수 있고, 플라보노이드가 포함되는 페놀계 화합물 분석을 통해 항산화 효과와 상관관계에 대한 추가적인 연구가 필요할 것으로 사료된다.
또한 각각의 용매로 인해 추출된 추출물의 플라보노이드 함량을 각각 확인하여 비교하였다. 다정큼나무 잎 추출물의 총 플라보노이드 함량은 75.70 mg/g extract로 확인하였고, 다정큼나무 헥산, 디클로로메탄, 에틸 아세테이트, 부탄올, 물 분획물의 플라보노이드 함량은 각각 37.80, 49.86, 149.13, 110.36, 38.93 mg/g extract로 확인하였다(Table 1). 다정큼나무 분획물 중 에틸 아세테이트 분획물에서 가장 높은 총 플라보노이드 함량이 관찰되었다.
다정큼나무 잎 추출물 및 각 분획물과 ABTS를 반응시켜 라디칼 잔여량을 확인한 결과는 다음과 같이 확인되었다. 다정큼나무 추출물은 0.1 mg/ml 농도에서는 라디칼 소거능을 확인할 수 없었고 0.2, 0.4, 0.8 mg/ml 농도에서 89.93, 66.13, 46.06% 라디칼 잔여능을 확인하였다(Fig. 2). 헥산 분획물은 0.
33 %의 라디칼 잔여능을 확인하며 라디칼 소거능을 가지고 있음을 확인하였다. 또한 물 분획물은 0.8 mg/ml에서 91.22%의 라디칼 잔여능을 확인하였다. 양성 대조군을 사용된 Quercetin은 0.
3A). 또한 부탄올 분획물 0.05, 0.1, 0.2 mg/ml에서도 30.09, 33.63, 42.48%의 세포 생존율이 관찰되었지만 에틸 아세테이트에 의해 세포생존율이 더 높게 관찰되었다(Fig. 3B). 이는 다정큼나무의 추출물 중에서 에틸 아세테이트 분획의 추출물이 과산화수소로 발생한 HaCaT 세포의 세포 손상에 대한 보호효과가 가장 높다는 것을 나타낸다.
18%의 라디칼 잔여능을 확인하였다. 반면, 에틸 아세테이트 분획물은 0.1, 0.2, 0.4, 0.8 mg/ml 농도에서 각각 91.33, 73.16, 33.97, 20.57%의 라디칼 잔여능을 확인하며 모든 농도에서 유의적으로 가장 높은 라디칼 소거능을 확인하였다. 부탄올 분획물은 0.
57%의 라디칼 잔여능을 확인하며 모든 농도에서 유의적으로 가장 높은 라디칼 소거능을 확인하였다. 부탄올 분획물은 0.1, 0.2, 0.4, 0.8 mg/ml 농도에서 각각 94.00, 86.67, 45.68, 37.33 %의 라디칼 잔여능을 확인하며 라디칼 소거능을 가지고 있음을 확인하였다. 또한 물 분획물은 0.
양성 대조군을 사용된 Quercetin은 0.1, 0.2, 0.4, 0.8 mg/ml에서 7.85, 7.40, 7.37, 7.24%의 라디칼 잔여능을 확인하며 농도가 증가할수록 라디칼을 소거하는 경향을 보였다(Table 2).
위의 결과들을 종합하면 다정큼나무 분획물 중 에틸 아세테이트 분획물에서 가장 높은 총 플라보노이드 함량 및 라디칼 소거능을 확인하였고 이로 인해 산화적 스트레스로부터 HaCaT 세포를 보호하는 효과를 나타냈음을 보여준다. 추가적인 연구를 통해 에틸 아세테이트 분획물의 화합물 분석 및 세포 보호 관련 기전 규명을 위한 연구가 필요할 것으로 보인다.
2 mg/ml 농도에서 각각 대조군 대비 100% 이상의 세포 생존율을 나타내며 세포 독성을 나타내지 않았다(Table 3). 하지만, 0.4 mg/ml 농도에서는 에틸아세테이트 분획물 처리군은 86.19%, 부탄올 분획물 처리군에서는 91.77%의 세포 생존율이 관찰되어 세포독성이 있음을 확인하였다(Table 3). 따라서, 이후 HaCaT 세포에 처리하는 다정큼나무 추출물의 농도는 세포독성을 나타내지 않는 0.
2). 헥산 분획물은 0.1, 0.2, 0.4, 0.8 mg/ml 농도에서 라디칼 소거능을 확인할 수 없었고, 디클로로메탄 분획물은 0.4, 0.8 mg/ml 농도에서 96.93, 78.18%의 라디칼 잔여능을 확인하였다. 반면, 에틸 아세테이트 분획물은 0.

후속연구

추가적인 연구를 통해 에틸 아세테이트 분획물의 화합물 분석 및 세포 보호 관련 기전 규명을 위한 연구가 필요할 것으로 보인다. 본 연구 결과는 다정큼나무 에틸 아세테이트 분획물의 항산화 소재로서 개발 가능성을 제시하며, 앞으로 항산화기능을 포함한 천연 항산화제 및 기능성 물질을 개발하는데 적용할 수 있을 것으로 사료된다.
다정큼나무 분획물 중 에틸 아세테이트 분획물에서 가장 높은 총 플라보노이드 함량이 관찰되었다. 이는 다정큼나무의 에틸 아세테이트 분획물의 항산화 효과가 다른 분획물에 비해 높을 것으로 기대할 수 있고, 플라보노이드가 포함되는 페놀계 화합물 분석을 통해 항산화 효과와 상관관계에 대한 추가적인 연구가 필요할 것으로 사료된다.
위의 결과들을 종합하면 다정큼나무 분획물 중 에틸 아세테이트 분획물에서 가장 높은 총 플라보노이드 함량 및 라디칼 소거능을 확인하였고 이로 인해 산화적 스트레스로부터 HaCaT 세포를 보호하는 효과를 나타냈음을 보여준다. 추가적인 연구를 통해 에틸 아세테이트 분획물의 화합물 분석 및 세포 보호 관련 기전 규명을 위한 연구가 필요할 것으로 보인다. 본 연구 결과는 다정큼나무 에틸 아세테이트 분획물의 항산화 소재로서 개발 가능성을 제시하며, 앞으로 항산화기능을 포함한 천연 항산화제 및 기능성 물질을 개발하는데 적용할 수 있을 것으로 사료된다.

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Yamamoto, Y. and Gaynor, R. B. 2001. Therapeutic potential of inhibition of the NF- ${\kappa}B$ pathway in the treatment of inflammation and cancer. J. Clin. Investig. 107, 135-142.

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저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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