[논문]한국산 동백종자 초임계 추출물의 피부 항산화 및 항노화 연구

김희택; 김태준; 김이화; 곽병문

doi:10.6114/jkood.2020.33.4.032

한국산 동백종자 초임계 추출물의 피부 항산화 및 항노화 연구
Anti-oxidant and Anti-aging Effect of Extracts from Seed of Camellia japonica L. by Supercritical Fluid Extraction 원문보기

韓方眼耳鼻咽喉皮膚科學會誌 = The journal of Korean Medicine Ophthalmology & Otolaryngology & Dermatology, v.33 no.4, 2020년, pp.32 - 43

김희택 (세명대학교 한의과대학 한방안이비인후피부과) , 김태준 (세명대학교 한의과대학 한방안이비인후피부과) , 김이화 (세명대학교 한의과대학 경락경혈학교실) , 곽병문 (세명대학교 한의과대학 경락경혈학교실)

Abstract ▼ AI-Helper

Objectives : The aim of this study was to investigate the anti-oxidant and anti-aging effect of the seed of Camellia japonica L. extracted by supercritical CO2. Methods : The cell viability was performed by MTT assay. Nitric oxide (NO) production was performed by NO assay. The anti-oxidant effect was performed by beta-carotene bleaching assay and the intracellular proteome was analyzed expression of each 15 proteins by 2-D electrophoresis. Results : Fatty acid analysis of extract from Camellia japonica L. has shown oleic acid was 84%. And the antioxidant effect was about 186% compared with alpha-tocoperol(0.1%) by beta carotene bleaching assay. In 2D PAGE analysis, fifteen protein changes in five mechanisms which was collagen synthesis pathway, MMPs, ECM-cell interaction, cytokine, antioxidant enzymes were analyzed. Conclusions : On this study extract from seed of Camellia japonica L. by supercritical extraction could be used as a antioxidant and antiaging substance for the skin.

주제어

표/그림 (12)

그림 Fig. 1. The Process Flow Diagram for the Supercritical Extraction from Camellia japonica L. The conditions used for the extraction from CJL were pressure of 350 bar, temperatures of 60 ℃, flow of 140 ㎖/min, particle size of 800-1000um.
그림 Fig. 2. The Kinetic Graph of Extraction Rate from Camellia japonica L.Supercritical CO₂ flow was 145 ㎖/min, extraction time was 180min, temperature was at 60℃, pressure was 350 bar.
그림 Fig. 4. Inhibition of Nitric Oxide Production on RAW 264.7 cells by Extracts from Camellia japonica L. NO production was LPS activated RAW 264.7 cell. The concentrations of sample were 1, 5, 10, 100, 200, 500 ㎎/L. Incubated time of RAW 264.7 cell was 24hrs. The data was obtained from 3 independent experiments. ***p<0.001, **p<0.01, *p<0.05 vs control.
그림 Fig. 3. Gas chromatography of fatty acid standard and extracts from Camellia japonica L. Chromatogram of extract from CJL. GC conditions: 170℃ to 220℃ at 2℃/min., FID: 230℃, Split ratio: 20:1. (A) Fatty acid standard, (B) Fatty acid from CJL extract.
표 Table 1. Fatty acid composition of each part of extracts from Camellia japonica L.
그림 Fig. 5. Effect of Antioxidant Activity by Extracts from Euphorbia lathyris L. The concentrations of sample were 1, 10 and 100% of CJL. Alpha-tocoperol(0.1%) was used as a control. The data was obtained from 3 independent experiments.
그림 Fig. 6. 2D-PAGE Gel. Control(A), CJL Extract1(B). Gel image of proteins extracted from NF cell treated with 500 ppm of CJL extract.
그림 Fig. 7. Effects of CJL Extract to Expression of Enzymes of Collagen Synthesis Pathway. The expression of protein from the human dermal fibroblast cells, which was treated with CJL, was compared with control.
그림 Fig. 8. Effects of CJL Extract to Expression of MMPs. The expression of protein from the human dermal fibroblast cells, which was treated with CJL, was compared with control.
그림 Fig. 9. Effect of CJL Extract to Expression of Proteins related ECM-cell Interaction. The expression of protein from the human dermal fibroblasts cells, which was treated with CJL, was compared with control.
그림 Fig. 10. Effect of CJL Extract to Expression of Cytokine. The expression of protein from the human dermal fibroblast cells, which was treated with CJL, was compared with control.
그림 Fig. 11. Effect of CJL Extract to Expression of Antioxidant Enzymes. The expression of protein from the human dermal fibroblast cells, which was treated with CJL, was compared with control.

AI 본문요약
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문제 정의

冬栢油에 대한 실험적 연구가 적은 것은 本草學에서 冬栢油의 사용례가 적었던 것에 기인한 것으로 생각된다. 이에 본 연구는 冬栢油의 피부 섬유아세포와 대식세포를 통하여 피부 항노화, 항산화, 항염 효과를 평가하였다. 본 연구의 실험 결과에서 보듯 beta carotene의 노란색의 산화도를 보아 항산화능을 판단하는 항산화실험, 과잉으로 생산되면 조직의 손상, 유전자 변이 신경손상 등을 일으키는²⁸⁾ Nitric oxide의 발생량을 확인하기 위한 항염효과 실험을 통한 효능결과 외 실험 결과에서 거론했듯이 섬유아세포 내 기작의단백질 중 콜라겐 합성에 도움을 주는 P3H3, P4HA2, P4HA3, P4H2, P4H3, PDI, Integrin beta-1, integrin beta-3가 모두 증가되고, 감소됨으로서 콜라겐 합성에 도움이 되는 MMP-3, MMP-13, Interleukin-1는 모두 감소되는 것을 확인하였다.

제안 방법

Ettan DALTsix electrophoresis unit(GE healthcare, USA)에 SDS buffer (Tris, Glycine, SDS, DDW)를 넣어주고 4℃를 유지하면서 순환시켜 주고 SDS gel 위에 IPG strip 을 올려놓은 후 agarose solution을 넣어 SDS gel 과 IPG strip 을 고정시켜준 후 전압을 걸어 전기영동을 시작하여 1단계에서는 10㎃로 1시간 단백질을 정렬시키며, 2단계에서는 40㎃ 4시간 단백질을 분리하였다. 2D-PAGE가 끝난 gel은 silver nitrate staining을 통해 염색하여 분석하였다.
Beta carotene bleaching assay(BCB)는 항산화제인 alpha-tocopherol과 함께 비교 분석하였다. Betacarotene을 녹인 chloroform 용액에 linoleic acid와 PEG-40(가용화제)을 섞어 evaporator로 chloroform을 완전히 제거한다.
분석 장비로는 HP 5890 system(HP, 19251A, USA)를 사용하였고 flame ionization detector (FID)를 사용하였다. GC로 분석하기 위해 methylation을 하였다. Fatty acid Standard(C14, C16, C18, C18:1, C18:2, C18:3)는 BF3 method를 사용하였고 추출물은 methylation으로 2N-KOH/MeOH를 사용하였다.
Gas chromatography(GC)를 이용하여 동백초임계추출물의 지방산을 분석하였다. 분석 장비로는 HP 5890 system(HP, 19251A, USA)를 사용하였고 flame ionization detector (FID)를 사용하였다.
1% N-1-naphthylenediamine dihydrochloride, 5% phosphoric acid)을 혼합한 후 10분 동안 반응시켰다. Microplate reader를 이용하여 540㎚에서 흡광도를 측정하여 nitric oxide 생성량을 측정하였다.
RAW 264.7 cell을 이용하여 동백종자초임계추출물의 nitric oxide 생성 억제 능력을 측정하였다. 분양받은 RAW 264.
고정된 유리판 사이에 질소를 퍼지한 후 12.5% gel solution(monomer stock, 4× resolving buffer, DDW, 10% SDS, 10 % APS, TEMED)을 넣어준 후 4시간 동안 굳혀서 사용하였다.
동백종자초임계추출물들은 gas chromatography를 통하여 6종 지방산 (C14, C16, C18, C18:1, C18:2, C18:3)을 분석하였다. 지방산 조성은 oleic acid (C18:1)가 84%가량의 가장 많은 조성을 보였다.
항산화 반응의 관련한 메커니즘은 매우 다양하게 있으며 원인에 따른 메커니즘 자체도 매우 다르다. 또 다양한 항염 물질들이 다양한 염증반응 메커니즘 중 어떠한 부분에 작용을 하여 항염반응을 나타내는지를 확인하는 것도 어려운 일이기 때문에 이런 한계를 극복하고자 전체 proteome을 분석하여 만들어진 동백종자초임계추출물이 어떤 메커니즘에서 작용하여 항염 효능을 나타내는지 human dermal fibroblast cell(NF cell) 에 동백종자초임계추출물을 적용하고 단백질을 추출해 알아보았다. Control과 sample의 단백질 spot의 모습은 아래 그림에 나타내었다(Fig.
본 연구에서는 동백종자초임계추출물이 가지는 기본 적인 조성과 세포내 항염 효과와 피부 섬유아세포에 적용하여 단백질 변화를 확인하여 다음의 결론을 얻었다.
7 cell을 5×10⁴cell/well 농도로 96 well plate에 분주한 후 24 시간 동안 배양 하여 1㎎/L 농도의 LPS를 처리하였다. 분석할 샘플을 phenol red가 포함되지 않은 DMEM에 PEG40 hydrogenated castor oil을 이용하여 emulsion을 만들고 DMEM을 사용하여 1, 5, 10, 50, 100, 200, 500㎎/L의 농도로 용해시킨 후 LPS 처리된 RAW 264.7 cell에 2.5㎕씩 첨가하여 37℃, 5% 이산화탄소에서 배양하였다. 24시간 배양 후 상등액을 분리한 후 100㎕의 상층액과 100㎕의 Griess 시약(1% sulfanilamide, 0.
이와 같은 화상에 대해 한의학에서 사용한 冬栢油의 경우에도 화상상처 부위의 염증 반응에 대한 항염, 항산화 효과 및 결손피부부위 회복에 있어서 중요한 콜라겐과 관련된 항노화 효과가 있을 것으로 생각되나, 이런 효과에 대한 연구가 많지 않았다. 이에 冬栢을 이용하여 천연 추출방법이라고 알려진 초임계 이산화탄소 추출방법을 사용하여 추출해 효능을 확인하였다.
다시 원심 분리하여 상등액을 얻은 후 단백질을 정량하였다. 일차 전기영동을 위해 immobilized pH gradient(IPG) strip에 rehydration solution (urea, thiourea, CHAPS, DTT, Glycerol, DDW, bromophenol blue, 2 % pharmalyte)을 첨가하여 빛이 차단된 조건에서 12시간 동안 rehydration 시킨뒤 Ettan IPGphor3(GE healthcare, USA)에 strip을 올려놓은 후 cup loading 방식으로 100㎍ 단백질, DNase, pI marker를 loading 한 후 미네랄 오일을 첨가한다. 1단계에서는 500 V로 750Vhr, 2단계에서는 1,000V로 800Vhr, 3단계에서는 10,000V로 18,000Vhr, 4단계에서는 10,000V로 110,000Vhr 총 17시간 일차 전기영동한다.
초임계 추출은 추출기 부피 기준 2L추출기를 사용하여 추출하였다(Fig. 1). 추출기에 파쇄된 동백종자를 넣고 pre-heater를 통과하면서 추출 조건에 맞는 온도의 이산화탄소가 조건에 맞게 가열된 추출기 바닥 쪽으로 들어가게 된다.
기체가 된 이산화탄소는 냉각기를 지나게 되면서 액화가 되어 저장소로 이동하여 액체 상태로 저장되어지며 이 액체 이산화탄소는 가압기를 통하여 재사용이 되는 시스템으로 사용하였다. 추출은 10분마다 한 번씩 진행하여 추출물을 얻었다^1,2).
항노화 효능 평가를 위한 proteome을 분석하기 위하여 2D-PAGE를 실시하였다. 분석에 사용된 cell은 human dermal fibroblasts cell을 사용하였으며 동백 종자초임계추출물을 DMSO(dimethylsulfoxide)에 100㎎/L의 농도로 용해시킨 후 cells에 2.

대상 데이터

항노화 효능 평가를 위한 proteome을 분석하기 위하여 2D-PAGE를 실시하였다. 분석에 사용된 cell은 human dermal fibroblasts cell을 사용하였으며 동백 종자초임계추출물을 DMSO(dimethylsulfoxide)에 100㎎/L의 농도로 용해시킨 후 cells에 2.5㎕씩 첨가하여 37℃, 5% 이산화탄소에서 배양하였다. 24시간 배양 후 원심분리하여 cells pellet을 얻고 DPBS (Dulbecco’s phosphate buffer saline)로 3회 washing 한다.
Fatty acid Standard(C14, C16, C18, C18:1, C18:2, C18:3)는 BF3 method를 사용하였고 추출물은 methylation으로 2N-KOH/MeOH를 사용하였다. 분석에 쓰인 column은 Supelco SP-2340 Fused Silica Capillary Column(30m, 0.25㎜(I.D), 0.20um(Film))을 사용하였다.
분양받은 RAW 264.7 cell을 페니실린(10 U/㎖), 10% Fetal bovine serum(FBS)가 첨가된 Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) 배지에서 37℃, 5% 이산화탄소가 유지된 인큐베이터에서 배양하였다.
실험에 사용된 동백종자는 서울 경동시장 자연초에서 구매하여 수분 5%미만으로 건조하였다. 건조된 동백종자는 추출에 사용하기 위하여 roll mill을 이용하여 800-1000um의 사이즈로 파쇄하여 사용하였다.

이론/모형

GC로 분석하기 위해 methylation을 하였다. Fatty acid Standard(C14, C16, C18, C18:1, C18:2, C18:3)는 BF3 method를 사용하였고 추출물은 methylation으로 2N-KOH/MeOH를 사용하였다. 분석에 쓰인 column은 Supelco SP-2340 Fused Silica Capillary Column(30m, 0.

성능/효과

1. 초임계 이산화탄소를 이용하여 동백종자를 추출하였을 때 350 bar 60℃ 조건에서 약 25%의 초임계추출물을 얻을 수 있었고, 지방산 분석결과 불포화지방산인 올레익산이 84%로 가장 높은 조성을 보였다.
1% 대비 추출물을 단독으로 사용하였을 때 약 186%의 능력을 보여주는 것을 확인하였다. 10% 추출물 농도에서는 control의 약 65% 정도의 항산화 능력을 확인할 수 있는 것으로 보아 저 농도에서도 확실한 항산화 능력을 볼 수 있을 것으로 나타났다
2. Nitric oxide(NO)억제효과와 beta-carotene을 이용한 항염, 항산화 평가에서 모두 농도 의존적으로 효과가 있는 경향을 보였다. NO 억제율은 약 20%을 보였고 최고농도에서 0.
3. Human dermal fibroblast cell에 동백종자초임계추출물을 처리 해 단백질의 변화량을 확인한 결과 콜라겐 합성을 억제하는 효소 단백질의 양은 처리 후 감소되는 반면 합성에 필요한 단백질은 대부분 상승하는 경향을 확인하였다.
7-11). 5가지 메커니즘 상의 단백질이 모두 변화된 것을 확인하였다.
Interleukin-1(IL-1)는 type I, III의 pro-collagen mRNA의 정상 상태 수준을 감소시키고 면력이나 조직 리모델링, 재생 과정, 염증반응 등 필수적인 생물학적 과정에 관여 되고 있으며 본 실험에서 control대비 감소됨을 확인 할 수 있었다¹⁸⁾.
NO발생량을 농도 의존적으로 줄어드는 것을 볼 수 있었다. MTT assay를 통하여 세포독성이 나타나지 않는 최고농도인 500ppm에서 control 대비 약 25% 가량 NO발생량을 저해하는 것을 확인하였다. MTT 세포독성 결과도 그래프로 함께 나타내었다(Fig.
Nitric oxide(NO)억제효과와 beta-carotene을 이용한 항염, 항산화 평가에서 모두 농도 의존적으로 효과가 있는 경향을 보였다. NO 억제율은 약 20%을 보였고 최고농도에서 0.1% alpha-tocopherol 보다 약 두 배의 효과를 보이는 것을 볼 수 있었다.
동백종자추출물의 NO 억제 결과를 확인해본 결과를 아래 그래프에 나타내었다. NO발생량을 농도 의존적으로 줄어드는 것을 볼 수 있었다. MTT assay를 통하여 세포독성이 나타나지 않는 최고농도인 500ppm에서 control 대비 약 25% 가량 NO발생량을 저해하는 것을 확인하였다.
동백종자는 350 bar 60℃의 초임계 추출 결과에서 250 분에 총 유지 함유량 36% 대비, 75%의 수율을 얻을 수 있었다. 하지만 이 추출물은 5000rpm, 20 분, 5℃ 원심분리하여 물과 왁스를 분리하고 남은 상층의 추출물만 사용하였다.
동백종자초임계추출물의 beta carotene bleaching assay(Fig. 5)에서는 alpha-tocopherol 0.1% 대비 추출물을 단독으로 사용하였을 때 약 186%의 능력을 보여주는 것을 확인하였다. 10% 추출물 농도에서는 control의 약 65% 정도의 항산화 능력을 확인할 수 있는 것으로 보아 저 농도에서도 확실한 항산화 능력을 볼 수 있을 것으로 나타났다
활성산소는 이미 노화의주범으로 알려져 있으며 glutathione(GHS), catalase 은 superoxide dismutase에 의해 분해된 과산화수소를 산소와 물로 분해시키는 역할을 한다. 모두 증가됨에 따라 콜라겐 합성을 촉진하는 것으로 확인하였다. catalase는 control 대비 약 두겁 배 정도의 큰 증가폭을 보였다.
이에 본 연구는 冬栢油의 피부 섬유아세포와 대식세포를 통하여 피부 항노화, 항산화, 항염 효과를 평가하였다. 본 연구의 실험 결과에서 보듯 beta carotene의 노란색의 산화도를 보아 항산화능을 판단하는 항산화실험, 과잉으로 생산되면 조직의 손상, 유전자 변이 신경손상 등을 일으키는²⁸⁾ Nitric oxide의 발생량을 확인하기 위한 항염효과 실험을 통한 효능결과 외 실험 결과에서 거론했듯이 섬유아세포 내 기작의단백질 중 콜라겐 합성에 도움을 주는 P3H3, P4HA2, P4HA3, P4H2, P4H3, PDI, Integrin beta-1, integrin beta-3가 모두 증가되고, 감소됨으로서 콜라겐 합성에 도움이 되는 MMP-3, MMP-13, Interleukin-1는 모두 감소되는 것을 확인하였다. 이는 피부에서 콜라겐의 합성을 촉진하거나 도우면서 화상상처가 수복되는 마지막 단계에서 콜라겐 합성의 균형을 이루어 줄 것으로 생각되었다.
Iso 형인 P4HA2, P4HA3들이 만들어 내는 효소인 P4H2, P4H3와 protein disulfide isomerase (PDI)도 증가할수록 콜라겐 합성에 도움을 준다^15,16). 상단 그래프 상의 결과로 위에서 언급한 6가지 단백질 중 P3H2와 P4H3 단백질이 50%에서 100% 이상 증가 됨을 확인 할 수 있었고 P3H3는 2배 이상 증가되는 것을 확인하였다(Fig. 7).
MMP-3, MMP-13은 콜라겐합성과정에서 세포외기질의 분해에 관여하여 control 대비 모두 감소했을 때 콜라겐 합성에 효과가 있다고 볼 수 있다. 실험결과에서는 두 단백질 모두 감소한 것을 확인 할 수 있었고 특히 MMP-13에서는 80%이상 매우 크게 감소되는 것을 확인 할 수 있었다.

후속연구

이는 피부에서 콜라겐의 합성을 촉진하거나 도우면서 화상상처가 수복되는 마지막 단계에서 콜라겐 합성의 균형을 이루어 줄 것으로 생각되었다. 이와 같은 항노화, 항산화, 항염 효과를 가지는 CJL의 경우 《醫宗損益》⁵⁾에서 사용 된 용례와 같이 화상에 대한 외용제 및 항노화 항산화능을 이용한 현대적 피부외용 소재로서 활용할 수있을 것으로 사료된다. 또한 본 연구에서는 초임계이산화탄소 추출방법은 추출에 의한 화학적인 반응이 없는 장점이 있으며, 상온에서 기체 상태인 이산화탄소를 사용함으로서 상온에서 모두 날아가기 때문에 잔존용매가 없다.
용매의 순수함, 저렴함, 무독성, 비인화성을 특징으로 하고 있으며 본래 친환경적인 물질을 사용함에 따라 현대의 소비자들의 믿음을 크게 반영할 수 있는 천연물 추출방법이다. 초기 장비의 세팅금액이 큰 단점이 있지만 물과 알코올과 다르게 비극성 물질만 추출할 수있어 비극성 물질의 효능만 확인하였기 때문에 CJL에 대한 극성 별 효능을 더 연구하게 된다면 범용성 소재로서 사용할 수 있기에, 향후 추가적인 연구가 필요할 것으로 생각된다.

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저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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