자동화 HPLC/SPE/HPLC 시스템(Sepbox system)을 활용한 고추 잎 (leaf of Capsicum annuum L.) 추출물 분리 및 α-glucosidase 억제 활성 물질 탐색 Rapid separation of Capsicum annuum L. leaf extract using automated HPLC/SPE/HPLC coupling system (Sepbox system) and identification of α-glucosidase inhibitory active substances원문보기
김민선
(Natural Product Informatics Research Center, Korea Institute of Science and Technology)
,
진종범
(Natural Product Informatics Research Center, Korea Institute of Science and Technology)
,
이정환
(Natural Product Informatics Research Center, Korea Institute of Science and Technology)
,
안혜숙
(Marine Biology Research Division, National Marine Biodiversity Institute of Korea)
,
판철호
(Natural Product Informatics Research Center, Korea Institute of Science and Technology)
,
박진수
(Natural Product Informatics Research Center, Korea Institute of Science and Technology)
식물 유래 화합물은 다양한 생리활성과 구조 다양성으로 많은 연구자에게 관심을 받고 있으나 화합물 분리는 많은 시간 소요, 과량의 유기용매 소모와 분리과정 중의 활성성분의 유실 등의 어려움을 겪게 된다. 이러한 점을 극복하기 위하여 HPLC/SPE/HPLC를 결합한 Sepbox 분리시스템을 이용하여 고추잎 추출물에서 288개 분획물을 획득하였고 이 중에서 alpha-glucosidase 저해효능을 가지는 화합물인 luteolin 7-O-glucoside를 효과적으로 확인할 수 있었다. 또한 고추잎에 풍부한 플라보노이드 다당체를 가수분해함에 따라 해당 활성이 증가함을 검증하였다. 그러므로 본 연구결과는 Sepbox 시스템이 생리활성 평가와 결합할 경우 식물 내 유용물질 탐색에 효과적임을 보여주었다.
식물 유래 화합물은 다양한 생리활성과 구조 다양성으로 많은 연구자에게 관심을 받고 있으나 화합물 분리는 많은 시간 소요, 과량의 유기용매 소모와 분리과정 중의 활성성분의 유실 등의 어려움을 겪게 된다. 이러한 점을 극복하기 위하여 HPLC/SPE/HPLC를 결합한 Sepbox 분리시스템을 이용하여 고추잎 추출물에서 288개 분획물을 획득하였고 이 중에서 alpha-glucosidase 저해효능을 가지는 화합물인 luteolin 7-O-glucoside를 효과적으로 확인할 수 있었다. 또한 고추잎에 풍부한 플라보노이드 다당체를 가수분해함에 따라 해당 활성이 증가함을 검증하였다. 그러므로 본 연구결과는 Sepbox 시스템이 생리활성 평가와 결합할 경우 식물 내 유용물질 탐색에 효과적임을 보여주었다.
Phytochemicals include plant-derived natural products that promote and improve the human metabolism and physiological activity, and there is a lot of research to find the value of the molecules is in progress. Likewise, we obtained 288 fractions of Capsicum annuum L. extract in less than 20 h using ...
Phytochemicals include plant-derived natural products that promote and improve the human metabolism and physiological activity, and there is a lot of research to find the value of the molecules is in progress. Likewise, we obtained 288 fractions of Capsicum annuum L. extract in less than 20 h using HPLC/SPE/HPLC coupling experiment through Sepbox system, an effective separation system to search for active substances in natural resources and ensure efficacy and reliability. Therefore, this experiment allowed rapid identification of biologically active molecules from the extract compared to traditional separation processes. Of the above fractions, eight fractions showed the α-glucosidase inhibitory (AGI) activity and subsequent LC-MS analysis revealed one of the active molecules as luteolin 7-O-glucoside. In addition, we proved the increase in AGI activity according to deglycosylation of flavonoid glycoside. Therefore, this study suggests that the Sepbox system can quickly separate and identify active components from plant extract, and is an effective technique for finding new active substances.
Phytochemicals include plant-derived natural products that promote and improve the human metabolism and physiological activity, and there is a lot of research to find the value of the molecules is in progress. Likewise, we obtained 288 fractions of Capsicum annuum L. extract in less than 20 h using HPLC/SPE/HPLC coupling experiment through Sepbox system, an effective separation system to search for active substances in natural resources and ensure efficacy and reliability. Therefore, this experiment allowed rapid identification of biologically active molecules from the extract compared to traditional separation processes. Of the above fractions, eight fractions showed the α-glucosidase inhibitory (AGI) activity and subsequent LC-MS analysis revealed one of the active molecules as luteolin 7-O-glucoside. In addition, we proved the increase in AGI activity according to deglycosylation of flavonoid glycoside. Therefore, this study suggests that the Sepbox system can quickly separate and identify active components from plant extract, and is an effective technique for finding new active substances.
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문제 정의
따라서, 본 연구에서는 Sepbox system을 이용하여 효과적으로 추출물을 분리하고, bioassay-guide 법을 이용하여 빠르고 신속하게 α-glucosidase inhibitor 활성을 가지는 물질을 탐색하고자 연구를 수행하였다.
제안 방법
CP1 250mg을 Sepbox chromatography를 이용하여 20시간 이내에 288개의 소분획으로 분리하였으며, 일부 소분획물의 HPLC 크로마토그램은 Fig. 1에 나타내었다. Fig.
Sepbox을 통해 얻은 소분획물들의 AGI activity 측정을 통해 활성을 확인하였다. 이들 소분획 중, 하나는 448의 분자량을 가지는 L7G을 주로 함유한 것으로 확인되었다.
7 mL/min의 유속, 10μL의 시료를 주입하여 gradient 조건(ACN 10-100%)으로 30분 동안 분석하였다. UHPLC-HRMS 분석을 위해 Vanquish Flex UHPLC/Q-exactive Orbitrap MS (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA)를 사용하였고 0.3mL/min 유속으로 10분간 HPLC와 동일한 용매조건으로 분석하였다.
나머지 활성 분획의 함유성분 규명을 위한 추가적인 연구를 수행 중이다. 또한, 우리는 Sepbox 소분획별 AGI 활성을 비교하던 중, luteolin과 apigenin 배당체의 탈당화 가수분해반응에 따른 AGI 활성 증가를 발견하였으며, 이들의 상관관계를 증명하기 위해 luteolin 및 apigenin과 이들의 배당체들의 AGI활성을 비교하였다. 그 결과, 탈당화에 의해 AGI 활성이 증가함을 발견하였다.
본 연구에서 수행된 가수분해는 CP1 5mg/mL (MeOH):water: MeOH:3M HCl=2mL:3mL:5mL:0mL (control)/2mL:2.7mL :5mL:0.3mL (Final HCl conc. 0.1M)/2mL:1.5mL:5mL:1.5mL (Final HCl conc. 0.5M)/2mL:0mL:5mL:3mL (Final HCl conc. 1M)로 각각 혼합 후, 60oC에서 1, 3시간 동안 반응시켰다. 이후, 반응액은 1M NaOH로 중화하고 부탄올 분획 후 농축하여 시료화하였다.
설정과 결합되어 2차원 분리가 가능한 기술이다. 본 연구에서는 Sepbox 2D-250 시스템(Sepiatec GmbH, Berlin, Germany) 을 이용하여 고추 잎 추출물(CP1)을 분리하였으며, sepbox 분획 과정은 다음과 같다. C4 reverse-phase resin (Sepiatec) 0.
6mm을 사용하였다. 분석조건은 0.05% FA (formic acid)를 함유한 water와 acetonitrile을 사용하여, 0.7 mL/min의 유속, 10μL의 시료를 주입하여 gradient 조건(ACN 10-100%)으로 30분 동안 분석하였다. UHPLC-HRMS 분석을 위해 Vanquish Flex UHPLC/Q-exactive Orbitrap MS (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA)를 사용하였고 0.
2). 상기 소분획의 활성물질을 조사하기 위해 LC-MS 분석을 수행하였다.
위 결과를 바탕으로 본 연구자들은 CP1에 포함된 luteolin과 apigenin의 배당체를 deglycosylation 시킬 경우, 추출물의 AGI 활성이 증가할 것임을 가정하였고, 이를 증명하기위해 CP1에 보유 중인 해양미생물을 이용하여 생물전환을 실시하였으나 당의 가수분해 산물을 확인하지는 못하였고(data not shown) 추가적으로 염산(HCl)을 처리하여 산가수분해를 진행하였다. 탈당화 (deglycosylation)에 따른 활성 변화를 조사한 결과, CP1 0.
UV 검출기가 결합되어 있다. 이러한 HPLC/SPE/HPLC coupling system을 통해 20시간 이내에 288개의 CP1 소 분획물을 획득할 수 있었으며, UHPLC-HRMS를 통해 luteolin과 apigenin의 배당체인 L7G, L7AG, L7AMG와 A7G, A7AG, A7AMG등을 확인하였다. CP1은 지표물질이 뚜렷하여 상대적으로 함유량이 낮은 물질을 분석하기가 어려우나, Sepbox system을 이용하여 미량물질들을 빠르고 효과적으로 분리 및 분석할 수 있었다.
대상 데이터
본 연구에 사용된 고추 잎은 (주)고추와 육종에서 고추잎분말로수령하였으며, 70% ethanol과 혼합 후, 1시간 동안 sonication하고 24시간 냉침하였다. 이후, paper filter로 여과하고 감압농축 하여 조추출물 CP1을 조제하여 실험에 사용하였다.
성능/효과
1에서 보이는 대로, Sepbox system을 통해 CP1을 1-3개의 화합물을 포함한 소 분획으로 분리할 수 있었으며, 분리에 소모된 시간은 20시간 이내였다. 소분획 중 단일물질 수준으로 분리가 된 것으로 예상되는 시료를 LC-MS을 통해 분석한 결과, UV흡수스펙트럼과 분자량 정보를 바탕으로 4T-10은 luteolin 7-O-(2''-O-apiosyl) glucoside (L7AG), 4T-11은 luteolin 7-O-glucoside (L7G), 4T- 13은 apigenin 7-O-(2''-O-apiosyl)glucoside (A7AG), 4T-07은 luteolin 7-O-(2''-O-apiosyl-O-6''-malonyl)glucoside (L7AMG), 5T-09는 apigenin 7-O-glucoside (A7G), 3T-11은 apigenin 7- O-(2''-O-apiosyl-O-6''-malonyl)glucoside (A7AMG)으로 추정되었다(Table 3).
AGI 활성 결과, 3T-13 (23.13±7.61%), 4T-11 (44.20±5.55%), 4T-18 (25.26±5.76%), 4T-19 (24.17±7.01%), 5T-13 (37.94±9.16%), 5T-14 (61.25±2.16%), 8T-2 (67.03±5.90%), 9T-2 (31.99±10.26%) 로 총 8개의 소분획물이 AGI activity를 가지는 것으로 나타났다(Fig. 2). 상기 소분획의 활성물질을 조사하기 위해 LC-MS 분석을 수행하였다.
이러한 HPLC/SPE/HPLC coupling system을 통해 20시간 이내에 288개의 CP1 소 분획물을 획득할 수 있었으며, UHPLC-HRMS를 통해 luteolin과 apigenin의 배당체인 L7G, L7AG, L7AMG와 A7G, A7AG, A7AMG등을 확인하였다. CP1은 지표물질이 뚜렷하여 상대적으로 함유량이 낮은 물질을 분석하기가 어려우나, Sepbox system을 이용하여 미량물질들을 빠르고 효과적으로 분리 및 분석할 수 있었다. 이와 같은 Sepbox systeme 천연물 분리 연구에 적용되어 높은 활용성을 나타낼 것이라 사료된다.
Luteolin과 apigenin 배당체들의 α-glucosidase inhibition activity Luteolin, apigenin, L7G, L7AG, L7AMG, A7G, A7AG, A7AMG 를 각각 20µg/mL의 농도로 하여 AGI activity를 측정한 결과, luteolin (78.21±2.55%)>L7G (18.32±0.58%)>L7AG (0.18± 2.47%)>L7AMG (−3.10±18.44) 순으로 활성이 감소하였으며, apigenin (92.87±19.37)>A7G (16.55±5.06)>A7AG (-8.82± 11.71)으로 apigenin 또한 동일한 결과를 보였다(Fig. 3).
또한, 우리는 Sepbox 소분획별 AGI 활성을 비교하던 중, luteolin과 apigenin 배당체의 탈당화 가수분해반응에 따른 AGI 활성 증가를 발견하였으며, 이들의 상관관계를 증명하기 위해 luteolin 및 apigenin과 이들의 배당체들의 AGI활성을 비교하였다. 그 결과, 탈당화에 의해 AGI 활성이 증가함을 발견하였다. 또한, 산가수분해에 의한 배당체의 함량을 낮춘 CP1 산물의 AGI 활성도 동일한 패턴으로 증가하였으며, 이를 통해 탈당화에 의해 AGI 활성이 증가함을 확인하였다.
또한, 가수분해 반응시료를 HPLC를 통해 분석한 결과, CP1 내에 존재하던 L7AG 및 A7AG가 L7G와 A7G로 탈당화된 것을 확인하였다(Fig. 5). 위의 결과를 통해 탈당화에 의해 α- glucosidase inhibition 활성이 증가한다는 것을 확인하였다.
[10]. 또한, 미량으로 존재하여 일반적으로 검출하기 힘든 화합물들을 빠르고 효과적으로 검출 분리가 가능하여 전통적인 분리방법의 bioassayguided fractionation의 단점을 보완할 수 있다.
그 결과, 탈당화에 의해 AGI 활성이 증가함을 발견하였다. 또한, 산가수분해에 의한 배당체의 함량을 낮춘 CP1 산물의 AGI 활성도 동일한 패턴으로 증가하였으며, 이를 통해 탈당화에 의해 AGI 활성이 증가함을 확인하였다. 비록 luteolin과 apigenin의 AGI 활성이 이미 알려져 있으나 고추잎에는 대부분배당체로 분포하고 있기 때문에 가수분해를 통하여 활성을 증진시킬 수 있을 것으로 생각하며 그 외 식물에 다양하게 존재하는 폴리페놀 배당체를 가수분해시에 기능성 향상을 기대할 수 있을 것으로 예상한다.
본 연구결과는 Sepbox 시스템이 식물추출물에서 활성 성분을 신속하게 분리하고 식별할 수 있으며, 새로운 활성 물질을 찾는데 효과적인 기술임을 시사한다.
5). 위의 결과를 통해 탈당화에 의해 α- glucosidase inhibition 활성이 증가한다는 것을 확인하였다.
14에서는 283 Da과 313 Da의 분자량, 8T-02, 9T-02에서 660/1085/1101/923 Da의 분자량이 검출되었다. 이를 통해 CP1 에서 AGI 활성을 나타내는 7개 이상의 활성물질이 예상되었고, 이들 중 하나는 L7G임을 알 수 있었다. 그 외 화합물은 미량성분으로 구조 규명을 위하여 현재 추가 연구 중이다.
추가적으로, 고추잎 추출물에 포함되어 있는 luteolin과 apigenin의 배당체인 L7G, L7AG, L7AMG, A7G, A7AG, A7AMG이 포함된 각각의 소분획별 AGI 활성을 비교한 결과, 당의 개수가 증가함에 따라 AGI활성이 감소하는 경향을 확인할 수 있었다. 이와 같은 현상의 상관관계를 명확히 하기 위해 추가적인 연구를 수행하였다.
탈당화 (deglycosylation)에 따른 활성 변화를 조사한 결과, CP1 0.5 mg/mL (61.61±2.53%)에 비해 0.5M HCl을 통해 탈당화 시료 (CP1-0.5M AH)는 93.16±1.21%로 AGI 활성이 약 32% 증가하였으며, 1M HCl을 통해 탈당화 시료(CP1-1M AG)는 100.65± 2.24%로 약 39% 증가하였다(Fig. 4).
활성을 나타낸 소분획을 LC-MS를 통해 분석하였으며 그 결과, 3T-13과 4T-11에서 분자량 448 Da의 luteolin 7-O-glucoside (L7G)가 확인되었고 AGI 활성을 나타낸 추가분획 4T-18, 19, 5T-13, 14에서는 283 Da과 313 Da의 분자량, 8T-02, 9T-02에서 660/1085/1101/923 Da의 분자량이 검출되었다. 이를 통해 CP1 에서 AGI 활성을 나타내는 7개 이상의 활성물질이 예상되었고, 이들 중 하나는 L7G임을 알 수 있었다.
후속연구
이는 CP1에서 L7G의 함유량에 비해 A7G의 함유량이 1/9 정도로 낮기 때문으로 추정된다. 나머지 활성 분획의 함유성분 규명을 위한 추가적인 연구를 수행 중이다. 또한, 우리는 Sepbox 소분획별 AGI 활성을 비교하던 중, luteolin과 apigenin 배당체의 탈당화 가수분해반응에 따른 AGI 활성 증가를 발견하였으며, 이들의 상관관계를 증명하기 위해 luteolin 및 apigenin과 이들의 배당체들의 AGI활성을 비교하였다.
또한, 산가수분해에 의한 배당체의 함량을 낮춘 CP1 산물의 AGI 활성도 동일한 패턴으로 증가하였으며, 이를 통해 탈당화에 의해 AGI 활성이 증가함을 확인하였다. 비록 luteolin과 apigenin의 AGI 활성이 이미 알려져 있으나 고추잎에는 대부분배당체로 분포하고 있기 때문에 가수분해를 통하여 활성을 증진시킬 수 있을 것으로 생각하며 그 외 식물에 다양하게 존재하는 폴리페놀 배당체를 가수분해시에 기능성 향상을 기대할 수 있을 것으로 예상한다.
CP1은 지표물질이 뚜렷하여 상대적으로 함유량이 낮은 물질을 분석하기가 어려우나, Sepbox system을 이용하여 미량물질들을 빠르고 효과적으로 분리 및 분석할 수 있었다. 이와 같은 Sepbox systeme 천연물 분리 연구에 적용되어 높은 활용성을 나타낼 것이라 사료된다.
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