최근의 장내 미생물 연구에 따르면 우리의 건강에 대한 장내 미생물의 중요한 역할이 밝혀졌다. 이에 매년 다양한 건강 기능 식품이 개발되고 있다. 기능성 식품의 개발에는 기능성 식품의 유익한 효과를 확인하기위한 in-vivo 실험이 포함되는 경우가 많다. 그 이유로 기능성 식품이 장내 미생물에 미치는 영향을 조사하기 위해서 동물 실험을 자주 수행하고 있는 실정이다. 식품의 유익한 효과는 장내 미생물 생태가 식품에 의해 이동되어 유익한 박테리아의 증가, 잠재적인 병원성 박테리아의 감소 또는 둘 다에 따라 평가 될 수 있다. 동물 실험은 일반적으로 시간이 많이 걸리고 까다롭기 때문에 본 연구팀은 분변 미생물에 대한 in-vitro 연구로 식이 건강상의 이점을 얼마나 잘 반영하는지 조사했다. 본 연구에서는 두 사람의 배설물을 사용하여 15가지 음식이 장내미생물에 주는 영향을 조사했다. 결과는 식단에 따라 다양한 장내 미생물 이동을 보여 주었으며, 이는 일반적으로 알려진 유익한 식단(즉, 김치, 청국장)이 유산균과 비피도 박테리움을 증가 시켰음을 확인했다. 따라서, 우리는 식이 요법의 유익한 효과를 평가하기 위해 체외 분변 미생물균총 분석을 사용할 수 있다고 제안한다. 또한, 이 방법은 더 나아가 개인 맞춤형 식단을 설정하는 데 도움이 될 수 있다고 사료된다.
최근의 장내 미생물 연구에 따르면 우리의 건강에 대한 장내 미생물의 중요한 역할이 밝혀졌다. 이에 매년 다양한 건강 기능 식품이 개발되고 있다. 기능성 식품의 개발에는 기능성 식품의 유익한 효과를 확인하기위한 in-vivo 실험이 포함되는 경우가 많다. 그 이유로 기능성 식품이 장내 미생물에 미치는 영향을 조사하기 위해서 동물 실험을 자주 수행하고 있는 실정이다. 식품의 유익한 효과는 장내 미생물 생태가 식품에 의해 이동되어 유익한 박테리아의 증가, 잠재적인 병원성 박테리아의 감소 또는 둘 다에 따라 평가 될 수 있다. 동물 실험은 일반적으로 시간이 많이 걸리고 까다롭기 때문에 본 연구팀은 분변 미생물에 대한 in-vitro 연구로 식이 건강상의 이점을 얼마나 잘 반영하는지 조사했다. 본 연구에서는 두 사람의 배설물을 사용하여 15가지 음식이 장내미생물에 주는 영향을 조사했다. 결과는 식단에 따라 다양한 장내 미생물 이동을 보여 주었으며, 이는 일반적으로 알려진 유익한 식단(즉, 김치, 청국장)이 유산균과 비피도 박테리움을 증가 시켰음을 확인했다. 따라서, 우리는 식이 요법의 유익한 효과를 평가하기 위해 체외 분변 미생물균총 분석을 사용할 수 있다고 제안한다. 또한, 이 방법은 더 나아가 개인 맞춤형 식단을 설정하는 데 도움이 될 수 있다고 사료된다.
Recent gut microbiota studies have revealed the important roles of gut microbiota for our health. Increasing numbers of health functional foods have been developed every year. Development of functional food often includes ex- and in-vivo experiment to verify the beneficial effects of the functional ...
Recent gut microbiota studies have revealed the important roles of gut microbiota for our health. Increasing numbers of health functional foods have been developed every year. Development of functional food often includes ex- and in-vivo experiment to verify the beneficial effects of the functional food. To investigate effects of functional food on gut microbiota, animal models were often conducted. Beneficial effects of food can be evaluated based on how gut microbiota was shifted by food, which results in either increase in beneficial bacteria, decrease in potentially pathogenic bacteria or both. As animal experiments are generally time-consuming and laborious, we investigate how well in-vitro investigation of fecal microbiota may reflect dietary health benefits. Here, we tested 15 kinds of diets using two human subjects' fecal materials. Our results showed varying gut microbiota shifts according to diets, which suggested generally known beneficial diets (i.e. Kimchi, Chunggukjang) increased Lactobacillus and Bifidobacterium. Therefore, we suggest that in vitro fecal microbiota analysis could be used to evaluate beneficial effects of diets. Moreover, this method may be ideal to establish personalized diet.
Recent gut microbiota studies have revealed the important roles of gut microbiota for our health. Increasing numbers of health functional foods have been developed every year. Development of functional food often includes ex- and in-vivo experiment to verify the beneficial effects of the functional food. To investigate effects of functional food on gut microbiota, animal models were often conducted. Beneficial effects of food can be evaluated based on how gut microbiota was shifted by food, which results in either increase in beneficial bacteria, decrease in potentially pathogenic bacteria or both. As animal experiments are generally time-consuming and laborious, we investigate how well in-vitro investigation of fecal microbiota may reflect dietary health benefits. Here, we tested 15 kinds of diets using two human subjects' fecal materials. Our results showed varying gut microbiota shifts according to diets, which suggested generally known beneficial diets (i.e. Kimchi, Chunggukjang) increased Lactobacillus and Bifidobacterium. Therefore, we suggest that in vitro fecal microbiota analysis could be used to evaluate beneficial effects of diets. Moreover, this method may be ideal to establish personalized diet.
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문제 정의
Phylum 수준에서 Taxonomic composition 분석은 비만을 나타내는 지표중 하나로 알려진 Firmicutes/Bacteroidetes (F/B)에대해[23] 조사하기 위해 수행하였다. F/B 비율은 피험자 A에서는 콜라, 소주, 피험자 B에서는 토마토, 소주를 처리한 샘플에서 유의적으로 증가하여 비만 관련 장내미생물이 증가하는 것으로 나타났다(p<0.
본 연구에서 사용한 in vitro systeme 인체 소화 과정을 모방한 Gastrointestinal digestion (GID)을 사용하였으며, 그로부터 얻어지는 GID 산물을 Fecal fermentation (FF) 과정을 거쳤다. 그에 따라 변화하는 장내미생물생태를 분석하여 개인별로 나타나는 식품 건강기능성을 평가하는 방법에 대한 가능성을 조사하고자 한다.
따라서 본 연구는 in vitro에서의 장내미생물생태 분석을 이용한 식품 건강기능성 평가에 대한 가능성을 연구하고자 수행하였다. 본 연구에서 사용한 in vitro systeme 인체 소화 과정을 모방한 Gastrointestinal digestion (GID)을 사용하였으며, 그로부터 얻어지는 GID 산물을 Fecal fermentation (FF) 과정을 거쳤다.
본 연구에서 소주를 처리한 시료에서 알코올 소독에 내성이 있다고 알려진 Blautia의 증가를 확인하였다[35]. 각 피험자에서 대표적인 유익균으로 알려진 Bifidobacterium의 abundance를 관찰하였다.
제안 방법
샘플 상층액은 버리고, 남은 pellet으로부터 QIAamp PowerFecal Pro DNA Kit (QIagen, Hilden, Germany)을 이용하여 DNA를 추출하였으며, Qubit dsDNA HS assay kit (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)를 이용하여 5ng/µL로 농도를 표준화 하였다. 16S rRNA 유전자 내 가변부위(Variable region) 중 V3-V4을 5'-TCGTCG GCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGCCTACGGGNGGC WGCAG; forward primer, 5'-GTCTCGTGGGCTCGGAGATG TGTATAAGAGACAGGACTACHVGGGTATCTAATCC; reverse primer로 polymerase chain reaction (PCR)를 이용하여 증폭시켰다. 이후의 MiSeq library 제작과정은 Illumina (San Diego, CA, USA)에서 제공하는 16S Metagenomic sequencing library preparation protocol을 참고하여 수행되었다.
coli가 증가할 수 있는 가능성을 보여준다. Bray-curtis 거리를 기반으로 식품 첨가 샘플 간의 유전적 거리를 분석했다. Figure S3의 결과는 in vitro 상에서 2시간 배양 후 식품 첨가가 Blank 샘플보다 더 많은 장내미생물생태를 변화시켰음을 보여주며, 이는 in vitro 상에서의 장내미생물 생태에 대한 식품의 처리 효과가 분명했음을 시사한다.
In vitro 상에서 GID-FF를 기반으로 하여 다양한 식이 유형이 장내미생물생태에 미치는 영향을 조사하였고, 더 나아가 이러한 영향에 대한 평가방법의 사용 가능성을 조사하였다. 비록 예비 연구 단계이지만, 본 연구결과는 다양한 장내 미생물생태에 대한 식품의 반응 및 효과가 in vitro GID-FF 과정을 통해 평가 될 수 있음을 시사하며, 실험적 방법에 대한 개선(즉, bile salts 영향 최소화 및 장내 미생물에 대한 in vitro 배양환경 최적화)이 이뤄진다면, 동물실험을 대체할 수 있는 정확한 식품 영향 평가 모델로 발전할 수 있을 것으로 보여진다.
알려진 Blautia의 증가를 확인하였다[35]. 각 피험자에서 대표적인 유익균으로 알려진 Bifidobacterium의 abundance를 관찰하였다. 피험자 A는 지방 식이(참기름, 아보카도유, 소고기) 의처리가 Bifidobacterium과 양의 상관관계가 있는 반면, 피험자 B는 식이섬유(현미, 김치, 토마토)의 처리가 양의 상관관계가 있음을 확인할 수 있었다.
org/wiki/miseq_ sop/)에 따라 Mothur software [18]를 사용하여 분석했다. 간단하게 설명하자면 paired-end 형태로 얻어진 raw reads를 assemble하고, SILVA database version 138에 align하였고, rare sequence들은 ‘pre.cluster’을 사용하여 수정하였다. Operational taxonomic units (OTUs)는 opti.
S4). 본 연구에서 2시간 동안 FF 배양을 시킨 식품처리군과 동일하게 배양한 비처리군인 Blank 샘플과의 abundance 차이도 관찰하였다. Figure 3은 각각의 식품 처리에 의해 유의적으로 증가 또는 감소한 genera를 나타냈다.
본 연구에서 사용한 in vitro systeme 인체 소화 과정을 모방한 Gastrointestinal digestion (GID)을 사용하였으며, 그로부터 얻어지는 GID 산물을 Fecal fermentation (FF) 과정을 거쳤다. 그에 따라 변화하는 장내미생물생태를 분석하여 개인별로 나타나는 식품 건강기능성을 평가하는 방법에 대한 가능성을 조사하고자 한다.
본 연구에서는 MiSeq을 수행하여 총 2, 141, 540개의 clean reads를 얻었고, 각 샘플당 2, 500 reads를 임의적으로 선발하여 normalization을 수행하였다. 이 단계에서 Good’s coverage의 96% 이상인 것을 확인하였으며(Fig.
동결된 샘플은 얼음위에서 녹이고, 그 중 1mL을 10, 000rpm에서 10분간 원심분리하였다. 샘플 상층액은 버리고, 남은 pellet으로부터 QIAamp PowerFecal Pro DNA Kit (QIagen, Hilden, Germany)을 이용하여 DNA를 추출하였으며, Qubit dsDNA HS assay kit (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)를 이용하여 5ng/µL로 농도를 표준화 하였다. 16S rRNA 유전자 내 가변부위(Variable region) 중 V3-V4을 5'-TCGTCG GCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGCCTACGGGNGGC WGCAG; forward primer, 5'-GTCTCGTGGGCTCGGAGATG TGTATAAGAGACAGGACTACHVGGGTATCTAATCC; reverse primer로 polymerase chain reaction (PCR)를 이용하여 증폭시켰다.
이전에 보고된 방법을 이용하여[16], 식품이 인체내에서 소화되는 과정을 모방한 GID 과정을 통해 소화산물을 제조하였고. Simulated saline fluid (SSF), Simulated gastric fluid (SGF), Simulated intestinal fluid (SIF)도 그에 따라 제조하였다.
분변은 채취하여 산소를 치환시킨 Phosphate buffered saline (10% w/v) 에균질화 시킨 후 채로 걸러 anaerobic chamber (Bactron Ⅱ, SHEL LAB, Cornelus, OR, USA)로 옮겨 혐기상태를 유지하였다. 준비된 BCM에 10% w/v로 분변시료를 분주한 뒤 동결 건조된 GID 소화산물(10% w/v) 첨가하였다. Fecal fermentation 은 37oC에서 2시간 동안 진행하였고, triplicate로 실험을 진행하였다.
대상 데이터
제조하였고. Simulated saline fluid (SSF), Simulated gastric fluid (SGF), Simulated intestinal fluid (SIF)도 그에 따라 제조하였다. Oral phase에서는 5g의 식품 시료(액체의 경우 5mL)를 사용하였고, 3.
채취하였다(JJNU-IRB-2018-040-002). 분변시료는 당뇨나 암, 간질환과 같은 기저질환을 갖고 있지 않은 건강한 성인 남성으로부터 기증받았으며, 실험에 참여한 피험자들은 채취 시점으로부터 3개월 이내에 장내미생물에 영향을 줄 수 있는 항생제, 술, 약품 등의 섭취를 하지 않은 사람으로 구성되었다. FF 과정은 이전에 연구되어 보고된 방법으로 수행되었고[17], 이에 따라 Basal Culturing medium (BCM)을 제조했다.
Louis, MO, USA)에서 구매하였다. 실험에 사용된 15가지 식품들은 모두 시판중인 제품을 사용했다. 그 외의 실험기기 및 시약은 별도로 기술하였다.
실험에 이용된 주요 화학 약품과 소화효소는 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)에서 구매하였다. 실험에 사용된 15가지 식품들은 모두 시판중인 제품을 사용했다.
이후의 MiSeq library 제작과정은 Illumina (San Diego, CA, USA)에서 제공하는 16S Metagenomic sequencing library preparation protocol을 참고하여 수행되었다. 제작한 MiSeq Library는 마크로젠(Seoul, South Korea)에 시퀀싱을 의뢰하였으며, raw data를 받아 분석하였다.
데이터처리
시퀀스데이터는 Miseq SOP (https://mothur.org/wiki/miseq_ sop/)에 따라 Mothur software [18]를 사용하여 분석했다. 간단하게 설명하자면 paired-end 형태로 얻어진 raw reads를 assemble하고, SILVA database version 138에 align하였고, rare sequence들은 ‘pre.
이론/모형
cluster’을 사용하여 수정하였다. Operational taxonomic units (OTUs)는 opti.clust algorithm을 이용하여 97% 유사성으로 계산되었으며[19], Bray-curtis index를 기반으로 dissimilarity를 계산하여 2차원적 그래프인 Non-metric multidimensional scaling (NMDS)로 나타냈고[20], 유의적인 차이를 나타내는 OTUs는 Linear discriminant analysis Effect Size (LEfse)를 이용하여 분석하였다[21]. Heatmape R software 에서 heatmap.
16S rRNA 유전자 내 가변부위(Variable region) 중 V3-V4을 5'-TCGTCG GCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGCCTACGGGNGGC WGCAG; forward primer, 5'-GTCTCGTGGGCTCGGAGATG TGTATAAGAGACAGGACTACHVGGGTATCTAATCC; reverse primer로 polymerase chain reaction (PCR)를 이용하여 증폭시켰다. 이후의 MiSeq library 제작과정은 Illumina (San Diego, CA, USA)에서 제공하는 16S Metagenomic sequencing library preparation protocol을 참고하여 수행되었다. 제작한 MiSeq Library는 마크로젠(Seoul, South Korea)에 시퀀싱을 의뢰하였으며, raw data를 받아 분석하였다.
성능/효과
조사하기 위해 수행하였다. F/B 비율은 피험자 A에서는 콜라, 소주, 피험자 B에서는 토마토, 소주를 처리한 샘플에서 유의적으로 증가하여 비만 관련 장내미생물이 증가하는 것으로 나타났다(p<0.05)(Fig. 2, Fig. S1). 반면에, genus 수준에서는 두 피험자 모두 Bacteroides, Blautia, Bifidobacterium의 높은 abundance가 확인되었다(Fig.
S2). 또한 두 피험자가 갖고있는 장내미생물의 abundance 차이를 조사한 결과에서는 피험자 A는 Bacteroides형의 enterotype, 피험자 B는 Prevotella형의 enterotype임을 확인하였다(Fig. S4). 본 연구에서 2시간 동안 FF 배양을 시킨 식품처리군과 동일하게 배양한 비처리군인 Blank 샘플과의 abundance 차이도 관찰하였다.
Figure S3의 결과는 in vitro 상에서 2시간 배양 후 식품 첨가가 Blank 샘플보다 더 많은 장내미생물생태를 변화시켰음을 보여주며, 이는 in vitro 상에서의 장내미생물 생태에 대한 식품의 처리 효과가 분명했음을 시사한다. 또한 본 연구결과를 볼 때 지방류와 소고기 처리가 두 피험자에게 모두 유사한 장내미생물생태 로 변화 시키는 것을 확인하였으며, 또한 소주, 콜라, 토마토 처리 이후에서도 두 피험자 모두에서 유사한 장내 미생물생태 변화를 보였다. 피험자 A에서 현미, 김치, 청국장이 유사한 장내 미생물생태 변화를 보였고, 피험자 B에서는 현미, 면, 생선이 비슷한 결과를 나타내었다.
S1). 반면에, genus 수준에서는 두 피험자 모두 Bacteroides, Blautia, Bifidobacterium의 높은 abundance가 확인되었다(Fig. S2). 또한 두 피험자가 갖고있는 장내미생물의 abundance 차이를 조사한 결과에서는 피험자 A는 Bacteroides형의 enterotype, 피험자 B는 Prevotella형의 enterotype임을 확인하였다(Fig.
수행하였다. 이 단계에서 Good’s coverage의 96% 이상인 것을 확인하였으며(Fig. 1A), 이는 normalization 이후에도 대부분의 OTUs가 손실되지 않았다는 것을 나타낸다. 종 균일도(evenness)를 나타내는 Shannon index는 피험자 A에서는 10가지 식이, 피험자 B에서는 3가지 식이에 의해 유의적으로 감소하는 것을 확인하였다(p<0.
또한 Figure S5의 결과는 in vitro 배양만으로도 여러 genera에 영향을 미친다는 것을 보여준다. 이 중 피험자 A에서 E. coli는 별도의 식품 첨가 없이도 증가하였으나, 식품 처리 이후 보다 많이 증가하는 것을 확인하였다. 이는 식품첨가와 in vitro 배양의 시너지 효과로 피험자 A의 E.
각 피험자에서 대표적인 유익균으로 알려진 Bifidobacterium의 abundance를 관찰하였다. 피험자 A는 지방 식이(참기름, 아보카도유, 소고기) 의처리가 Bifidobacterium과 양의 상관관계가 있는 반면, 피험자 B는 식이섬유(현미, 김치, 토마토)의 처리가 양의 상관관계가 있음을 확인할 수 있었다. 김치를 첨가한 이후 Lactobacillus의 증가는 피험자 B에서만 관찰되었는데, 이는 피험자 A의 장내 미생물생태에는 김치로부터 파생된 Lactobacillus가장 내에 군집
후속연구
비록 예비 연구 단계이지만, 본 연구결과는 다양한 장내 미생물생태에 대한 식품의 반응 및 효과가 in vitro GID-FF 과정을 통해 평가 될 수 있음을 시사하며, 실험적 방법에 대한 개선(즉, bile salts 영향 최소화 및 장내 미생물에 대한 in vitro 배양환경 최적화)이 이뤄진다면, 동물실험을 대체할 수 있는 정확한 식품 영향 평가 모델로 발전할 수 있을 것으로 보여진다.
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