[논문]다양한 ECM 조건하에서의 세포막 미세영역 부위 국소접착인산화효소 활성의 단일세포 이미징 기반 분석

최규호; 장윤관; 서정수; 김헌수; 안상현; 한기석; 김은혜; 김태진

doi:10.5352/jls.2022.32.2.148

다양한 ECM 조건하에서의 세포막 미세영역 부위 국소접착인산화효소 활성의 단일세포 이미징 기반 분석
Single-Cell-Imaging-Based Analysis of Focal Adhesion Kinase Activity in Plasma Membrane Microdomains Under a Diverse Composition of Extracellular Matrix Proteins 원문보기

생명과학회지 = Journal of life science, v.32 no.2, 2022년, pp.148 - 154

최규호 (부산대학교 생명시스템학과) , 장윤관 (부산대학교 생명시스템학과) , 서정수 (부산대학교 생명시스템학과) , 김헌수 (부산대학교 생명시스템학과) , 안상현 (부산대학교 생명시스템학과) , 한기석 (부산대학교 생명과학과) , 김은혜 (부산대학교 생명시스템학과) , 김태진 (부산대학교 생명시스템학과)

초록
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국소접착인산화효소(FAK)는 국소접착부에서 세포부착, 세포이동, 세포역학적 신호전달 등에 관여한다고 알려져 있다. 그러나 세포 외 기질(ECM)과 상호작용하는 인테그린 막단백질과 함께 위치하는 세포막 미세영역(membrane microdomain)의 종류와 ECM 구성에 따른 FAK 활성은 여전히 불분명하다. 형광 공명 에너지 전달(FRET)을 기반으로 유전적으로 인코딩 된 바이오센서는 세포 내 FAK 신호를 높은 시공간 해상도로 제공할 수 있다. 본 연구에서는 유리, 제1형 콜라겐, 피브로넥틴, 라미닌의 ECM 조건에서 FRET 기반 막 표적 FAK 바이오센서를 사용하여 지질유동섬(Lipid raft) 및 비-지질유동섬(non-Lipid raft)에서 FAK의 활성을 분석하고 시각화 하였다. 흥미롭게도, 지질유동섬에서 라미닌 조건 하의 FAK 활성은 다른 ECM 조건보다 낮았고, 비-지질유동섬에서 FAK 활성은 다른 ECM 조건보다 낮았다. 동일한 ECM 조건 상의 비교에서는 피브로넥틴 조건일 때 지질유동섬에서 비-지질유동섬 보다 높은 FAK 활성이 관측되었다. 따라서 이번 연구는 FAK 활성도가 ECM 유형 및 세포막 미세영역에 따라 특이적으로 조절되는 것을 시각적, 정량적으로 보여준다.

Abstract ▼ AI-Helper

Focal adhesion kinase (FAK) is known to regulate cell adhesion, migration, and mechanotransduction in focal adhesions (FAs). However, studies on how FAK activity is regulated in the plasma membrane microdomains according to the composition of extracellular matrix (ECM) proteins are still lacking. A genetically encoded fluorescence resonance energy transfer (FRET)-based biosensor can provide useful information on the activity of intracellular signals with high spatiotemporal resolution. In this study, we analyzed the FAK activities in lipid raft (detergent-resistant membrane) and non-lipid raft (non-detergent-resistant membrane) microdomains using FRET-based membrane targeting FAK biosensors (FAK-Lyn and FAK-KRas biosensors) under four different ECM protein compositions: glass, type 1 collagen, fibronectin, and laminin. Interestingly, FAK activity in response to laminin in a lipid raft microdomain was lower than that in other ECM conditions. Cells subjected to fibronectin showed higher FAK activity in a lipid raft microdomain than that in a non-lipid raft microdomain. Therefore, this study demonstrates that the FAK activity can be distinctively regulated according to the ECM type and the environment of the plasma membrane microdomains.

주제어

표/그림 (3)

그림 Fig. 1. The design, characterization, and localization of the FRET-based FAK biosensor. A) Schematic diagram of the FAK biosensor. The FAK biosensor comprises an ECFP donor, SH2 domain, substrate, YPet acceptor. The substrate peptide is derived from FAK containing Tyr397 (indicated as red Y). B) The FAK biosensor shows the conformational change by phosphorylation at Tyr397 in the substrate domain, leading to a decrease in the FRET emission intensity. C) Localization of FAK-Lyn and FAK-KRas biosensor. Integrin will be expected to interact with four different ECM conditions. These diagrams were illustrated using Biorender (http://biorender.com/).
그림 Fig. 2. The FRET ratio images of the FAK-Lyn and FAK-KRas in HeLa cells respond to different ECM proteins. A) FRET ratio images of the FAK-Lyn and FAK-KRas in HeLa cells. The color scale bars represent the range of the ECFP/FRET emission ratio detected by the biosensor. Hot and cold colors indicate a high and low ECFP/FRET ratio, respectively.
그림 Fig. 3. The dot graphs for ECFP/FRET Ratios of the FAK biosensors in HeLa cells. A-C) ECFP/FRET Ratios of the FAK-Lyn or FAK-KRas biosensor-transfected cells in response to different types of ECM proteins. The dot graphs describe mean values of ECFP/FRET Ratio with error bars indicating the standard error of the mean (S.E.M) (n.s p>0.05, *p<0.05, **p<0.01, ***p <0.001, ****p<0.0001, one-way ANOVA for A,B and student t-test for C). Each dot on the graph represents the average of 3 ROIs in a single cell.

AI 본문요약
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문제 정의

따라서 본 연구에서는 FRET을 기반 바이오센서를 정확하게 원하는 세포막 미세영역에 위치시키고 실시간 생 세포 이미징(live cell imaging)을 통해 세포 전체에서 나오는 신호가 아닌 세포부착부, 특히 ECM 와 상호작용을 많이 하는 층상위족(lamellipodia)과 사상위족 (filopodium) 부분의 FRET 신호만을 정확하게 측정하여 FAK 활성을 시공간적 분석을 진행하였다. 이를 통해 생 세포의 세포 가장자리 부분에서 다양한 종류의 ECM과 상호작용을 할 때 각기 다른 세포막 미세영역에서 나타나는 FAK 활성의 차이를 알 수 있었다.

제안 방법

하지만 전통적인 실험 방법으로는 활성제 불용성 막의 추출 과정 중 단백질의 용해성이 활성제 처리 시 변하여 활성제 불용성 막과 지질유동섬 간의 위치가 일치하지 않게 되고[13, 21] 세포와 살아있는 상태에서 ECM이 상호작용할 때 순간적으로 나타나는 FAK의 활성을 관측하기 어렵다는 문제점이 있었다. 따라서 본 연구에서는 FRET을 기반 바이오센서를 정확하게 원하는 세포막 미세영역에 위치시키고 실시간 생 세포 이미징(live cell imaging)을 통해 세포 전체에서 나오는 신호가 아닌 세포부착부, 특히 ECM 와 상호작용을 많이 하는 층상위족(lamellipodia)과 사상위족 (filopodium) 부분의 FRET 신호만을 정확하게 측정하여 FAK 활성을 시공간적 분석을 진행하였다. 이를 통해 생 세포의 세포 가장자리 부분에서 다양한 종류의 ECM과 상호작용을 할 때 각기 다른 세포막 미세영역에서 나타나는 FAK 활성의 차이를 알 수 있었다.

데이터처리

모든 통계학적 데이터는 평균 ± 평균의 표준편차(SD) 또는 표준 오차(SEM)로 표현되었다. GraphPad Prism 7.0 (Graph Pad Software, San Diego, CA, USA) 소프트웨어를 사용하여 통계 평가가 실시되었고, student t-test와 one-way ANOVA test를 수행하여 실험군 간의 통계적 차이를 확인하였다. 유의한 차이는 P값(*<0.
모든 통계학적 데이터는 평균 ± 평균의 표준편차(SD) 또는 표준 오차(SEM)로 표현되었다

성능/효과

본 연구에서는 형광공명에너지전이(FRET) 기반의 FAK 센서를 통해 세포막 미세영역에 따른 차이와 ECM의 차이로 인해 FAK 활성화의 차이를 시각적으로 확인할 수 있음을 보였다. 선행 연구에 비해 지질유동섬과 비-지질유동섬 간에 FAK 신호의 FRET 비율값의 큰 차이가 나지 않음을 알 수 있었는데 이는 국소접착부의 생성을 촉진하는 EGF 같은 약물을 처리하는 것이 아닌 부착되어있는 정적인 순간을 관측하여 FAK신호의 큰 차이를 보이지는 않았던 것으로 보인다.
선행 연구에 비해 지질유동섬과 비-지질유동섬 간에 FAK 신호의 FRET 비율값의 큰 차이가 나지 않음을 알 수 있었는데 이는 국소접착부의 생성을 촉진하는 EGF 같은 약물을 처리하는 것이 아닌 부착되어있는 정적인 순간을 관측하여 FAK신호의 큰 차이를 보이지는 않았던 것으로 보인다. 하지만 그럼에도 불구하고 피브로넥틴이 ECM으로 존재할 때 지질유동섬부분과 비-지질유동섬 간에 차이가 높은 유의성으로 나타나는 것을 보아 ECM의 종류와 상호작용을 하느냐에 따라 지질 유동 섬과 비-지질유동섬 간에도 FAK의 활성이 달라짐을 알 수 있었다. 이는 피브로넥틴에 의한 비-지질유동섬에서의 FAK 신호의 활성이 타 영역에 비해 상대적으로 덜 활성화되는 것으로 보여진다.

후속연구

우리 몸에 있는 세포는 ECM과 인테그린의 상호작용으로 인해 세포는 물리적으로 영향을 지속적으로 받게 된다. 따라서 물리적 자극이 지속적으로 형성되고 있는 상태에서 다양한 화학적 반응들이 연계되어 세포 내에서 일어나므로 학계에서 연구되고 있는 다양한 신호분자들은 생체내의 물리적 환경의 영향을 고려하여 연구할 필요가 있을 것으로 생각된다. 따라서 이번 연구는 세포가 위치하는 환경을 이해하고 그에 따른 다양한 생리학적/병리학적 연구의 기초를 제공할 수 있을 것이라 사료된다.
따라서 물리적 자극이 지속적으로 형성되고 있는 상태에서 다양한 화학적 반응들이 연계되어 세포 내에서 일어나므로 학계에서 연구되고 있는 다양한 신호분자들은 생체내의 물리적 환경의 영향을 고려하여 연구할 필요가 있을 것으로 생각된다. 따라서 이번 연구는 세포가 위치하는 환경을 이해하고 그에 따른 다양한 생리학적/병리학적 연구의 기초를 제공할 수 있을 것이라 사료된다.

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표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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