[논문]극동산 뱀장어(Anguilla japonica)의 친자확인을 위한 유전자 마커 개발

노은수; 신은하; 박경현; 김은미; 김영옥; 유용운; 김신권; 남보혜

doi:10.5657/kfas.2022.0557

극동산 뱀장어(Anguilla japonica)의 친자확인을 위한 유전자 마커 개발
Development of Microsatellite Markers for Parentage Analysis in the Japanese Eel Anguilla japonica 원문보기

한국수산과학회지 = Korean journal of fisheries and aquatic sciences, v.55 no.5, 2022년, pp.557 - 566

Abstract ▼ AI-Helper

The Japanese eel Anguilla japonica is a highly valued research object that is important for aquaculture in Asia, including the Republic of Korea. However, few studies have been conducted analyzing parentage using microsatellite markers derived from the Japanese eel. We acquired Japanese eel genome data using next generation sequencing technology, and constructed a draft genome comprising 1,087 Mbp. Using the Simple Sequence Repeat Identification Tool program, 444,724 microsatellites were identified. Of these, 1,842 microsatellites located in the 3' untranslated region, which are stably inherited, were finally selected. Ninety-six primers were selected to validate polymorphism at these microsatellites, and 9 primers were finally identified for multiplex analysis. Using multiplex polymerase chain reaction with three different fluorescence chemistries, we performed parentage analysis of an artificial Japanese eel population. CERVUS software was used to calculate the logarithm of the odds (LOD) scores and the confidence of the parentage assignments. The results presented here show that 83 out of 85 paternity cases were assigned at 95% confidence to a candidate father and mother with LOD scores ranging from 4.79 to 28.2. This study provided a microsatellite marker-based assay for parentage analysis of Japanese eels, which will be useful for selective breeding and genetic diversity studies.

주제어

표/그림 (10)

표 Table 1. The sample information of Anguilla japonica for parentage analysis
표 Table 2. Genome assembly statistics
표 Table 4. List of microsatellite markers for parentage analysis
표 Table 3. Distribution of repeat motif types
그림 Fig. 1. Size range of multiplex PCR products. PCR, Polymerase chain reaction.
그림 Fig. 2. Allele frequency of each markers.
표 Table 5. PCR cycling for multiplex method
표 Table 6. The results of parentage analysis
표 Table 6. Continued
표 Table 6. Continued

AI 본문요약
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문제 정의

본 연구는 극동산 뱀장어의 친자확인을 위한 microsatellite 마커를 보고한 최초의 연구이다. 극동산 뱀장어의 유전체정보를 해독하고, 이로부터 검정된 9개의 microsatellite 마커를 선별하였다.
본 연구에서는 극동산 뱀장어 인공종자의 효율적인 가계관리를 위한 친자확인용 microsatellite 마커를 개발하고 다중증폭 조건 확립을 통한 분석과정을 최적화하고자 하였다.

제안 방법

Long reads를 이용한 1차 유전체 조립을 위해 clean pared-end reads 를 이용해 long reads contamination을 제거하였다. Decontaminated long reads는 FALCON_UNZIP을 이용한 1차 유전체 조립 후 clean paired-end reads를 이용해 error correction 및 2차 유전체 조립을 수행하였다.
탐색된 microsatellite 마커 후보를 기준으로 Primer 3 소프트웨어를 이용하여 PCR 증폭을 위한 프라이머를 디자인하였다. Microsatellite 마커 서열을 중심으로 양쪽 인접 서열의 보존 영역을 대상으로 안정적인 증폭이 이루어질 수 있도록 하였으며, 각각의 microsatellite 마커를 대상으로 증폭산물의 크기를 100, 200, 300 bp로 설정하여 3개의 서로 다른 프라이머 서열을 예측하여 추후 단회의 분석으로 일괄적으로 결과를 확인할 수 있는 multiplex PCR을 대비하였다.
뱀장어 친자확인을 위한 microsatellite 마커를 개발하고자 국립수산과학원 양식산업연구부 양식연구과에서 양식연구 수행중인 뱀장어 성체 1개체(2019년 3월 15일)를 확보하였다. 또한, 친자확인 유전자 마커의 검정을 위해 수컷 9개체, 암컷 4개체의 교배 조합을 통해 생산된 자손세대 4개 집단 95개체와 대조구로써 자연에서 채집된 실뱀장어 22개체를 확보하였다(Table 1).
앞서 추출된 게놈 DNA으로부터 뱀장어 유전체 조립 및 microsatellite 마커 선별을 위해 차세대염기서열분석을 수행하였다. 먼저 short read 염기서열분석을 위해 Illumina TruSeq Nano DNA Prep Kit (Insert 550 bp)를 이용하여 NGS (next generation sequencing) 분석을 위한 라이브러리를 제작하였으며, 제작된 라이브러리는 Agilent High Sensitivity DNA Chip을 이용하여 DNA 단편 크기 및 농도를 측정하였다. 이후 digital PCR (polymerase chain reaction)과 Taqman probe를 이용하여 adapter dimer를 제외한 뱀장어 라이브러리의 농도만을 정확히 정량한 후 NovaSeq 6000 platform (Illumina, San Diego, CA, USA)으로 염기서열분석을 수행하였다.
이후, 조직이 완전히 녹은 것을 확인한 후 페놀-클로로포름(phenol:chloroform) 추출법과 에탄올 침전법을 이용하여 게놈 DNA를 정제하였다. 분리한 게놈 DNA를 1% 아가로스겔에서 전기영동법을 통하여 게놈 DNA의 유무를 확인하였으며, Nano Vue (Ge Healthcare, Fair-field, NJ, USA) 분광광도계를 이용하여 농도를 측정하였다.
분석방법의 효율화를 위해 multiplex PCR 조건을 확립하고자 PCR 증폭 여부 확인 및 산물의 사이즈 등을 고려하여 최종적으로 9개의 microsatellite 마커를 선별하였다. 이들 마커는 총 3개의 fluorescence dye (FAM, HEX, TAMRA)를 사용하여 genotyping 분석 시 중복되는 부분이 없도록 하였다.
앞서 추출된 게놈 DNA으로부터 뱀장어 유전체 조립 및 microsatellite 마커 선별을 위해 차세대염기서열분석을 수행하였다. 먼저 short read 염기서열분석을 위해 Illumina TruSeq Nano DNA Prep Kit (Insert 550 bp)를 이용하여 NGS (next generation sequencing) 분석을 위한 라이브러리를 제작하였으며, 제작된 라이브러리는 Agilent High Sensitivity DNA Chip을 이용하여 DNA 단편 크기 및 농도를 측정하였다.
먼저 short read 염기서열분석을 위해 Illumina TruSeq Nano DNA Prep Kit (Insert 550 bp)를 이용하여 NGS (next generation sequencing) 분석을 위한 라이브러리를 제작하였으며, 제작된 라이브러리는 Agilent High Sensitivity DNA Chip을 이용하여 DNA 단편 크기 및 농도를 측정하였다. 이후 digital PCR (polymerase chain reaction)과 Taqman probe를 이용하여 adapter dimer를 제외한 뱀장어 라이브러리의 농도만을 정확히 정량한 후 NovaSeq 6000 platform (Illumina, San Diego, CA, USA)으로 염기서열분석을 수행하였다. 또한, long read 염기서열분석을 위해 PacBio SMRT sequencing 방식으로 라이브러리를 구축하고 500 ng–5 μg을 BluPippin system (0.
뱀장어의 고분자 게놈 DNA를 분리하기 위하여 근육조직을 채취하여 8M TNES-UREA 600 μL에 Proteinase K를 5 μL 가 한 후 37℃에서 12시간 반응시켰다. 이후, 조직이 완전히 녹은 것을 확인한 후 페놀-클로로포름(phenol:chloroform) 추출법과 에탄올 침전법을 이용하여 게놈 DNA를 정제하였다. 분리한 게놈 DNA를 1% 아가로스겔에서 전기영동법을 통하여 게놈 DNA의 유무를 확인하였으며, Nano Vue (Ge Healthcare, Fair-field, NJ, USA) 분광광도계를 이용하여 농도를 측정하였다.
임의 선별된 후보 microsatellite 마커는 해당 영역의 증폭을 위한 primer 제작 후 국립수산과학원 수산생명자원 수장고에 보관 중인 극동산 뱀장어(NFRDI-FI-IS-0029044, NFRDI-FI-IS-0029045)를 활용하여 primer의 검정을 수행하였다. PCR 증폭에는 TaKaRa Ex Taq DNA Polymerase (TAKARA Bio.
친자검정을 위해서는 유전자형 정보 생산에 대한 일관성과 정확성이 요구됨을 고려하여, tri-motif 조건의 반복 횟수 기준으로 상위 96개의 마커 정보를 최종 확보하여 프라이머 제작 및 검정을 수행하였다. PCR 분석 결과 96개의 마커 중 18개를 제외한 모든 마커가 증폭이 되었음을 확인하였으며, 증폭산물의 사이즈와 repeat 수를 고려하여 최종적으로 9개의 마커를 선별하였다.
PCR 분석 결과 96개의 마커 중 18개를 제외한 모든 마커가 증폭이 되었음을 확인하였으며, 증폭산물의 사이즈와 repeat 수를 고려하여 최종적으로 9개의 마커를 선별하였다. 해당 마커는 multiplex PCR 분석이 가능하도록 PCR 산물의 사이즈가 100 bp, 200 bp, 300 bp 각 3개씩으로 구성하였으며, 3개의 fluorescence를 사용하여 유사한 사이즈 내 PCR 산물의 결과 해석이 가능하도록 하였다(Table 4, Fig. 1).

대상 데이터

본 연구는 극동산 뱀장어의 친자확인을 위한 microsatellite 마커를 보고한 최초의 연구이다. 극동산 뱀장어의 유전체정보를 해독하고, 이로부터 검정된 9개의 microsatellite 마커를 선별하였다. 선별된 마커 정보에서는 대립유전자의 유전에 관한 문제점은 발견되지 않았으며, 국립수산과학원에서 인공 생산한 극동산 뱀장어 4개 집단 95개체 중 93개체가 모두 95% 이상의 신뢰도로 부모개체의 확인이 가능하였다.
뱀장어 친자확인을 위한 microsatellite 마커를 개발하고자 국립수산과학원 양식산업연구부 양식연구과에서 양식연구 수행중인 뱀장어 성체 1개체(2019년 3월 15일)를 확보하였다. 또한, 친자확인 유전자 마커의 검정을 위해 수컷 9개체, 암컷 4개체의 교배 조합을 통해 생산된 자손세대 4개 집단 95개체와 대조구로써 자연에서 채집된 실뱀장어 22개체를 확보하였다(Table 1).
이후 선별 조건에 부합하는 3’-UTR 영역에 존재하는 di- 1,188개, tri- 216개, tetra- 176개, penta- 102개, 그리고 hexa- 160개를 최종 후보로 선별하였다.

이론/모형

75% gel)을 이용하여 15 kb 이상만을 회수한 후 bioanalyzer (Agilent Technologies, Waldbronn, Germany)로 라이브러리 의 QC (quality control) 과정을 수행하였다. 제작된 라이브러리는 PacBio SMRT sequencing 방식으로 분석하였다. Long reads를 이용한 1차 유전체 조립을 위해 clean pared-end reads 를 이용해 long reads contamination을 제거하였다.

성능/효과

친자검정을 위해서는 유전자형 정보 생산에 대한 일관성과 정확성이 요구됨을 고려하여, tri-motif 조건의 반복 횟수 기준으로 상위 96개의 마커 정보를 최종 확보하여 프라이머 제작 및 검정을 수행하였다. PCR 분석 결과 96개의 마커 중 18개를 제외한 모든 마커가 증폭이 되었음을 확인하였으며, 증폭산물의 사이즈와 repeat 수를 고려하여 최종적으로 9개의 마커를 선별하였다. 해당 마커는 multiplex PCR 분석이 가능하도록 PCR 산물의 사이즈가 100 bp, 200 bp, 300 bp 각 3개씩으로 구성하였으며, 3개의 fluorescence를 사용하여 유사한 사이즈 내 PCR 산물의 결과 해석이 가능하도록 하였다(Table 4, Fig.
또한, 교배조합과는 다르게 교배가 이루어진 자손개체(Group 3-14, F4462 × M3171)와 인공종자 생산에서 배제된 부모개체(M3893, M3896)가 있는 것으로 확인되었으나, LOD score를 기준으로 볼 때 분석과 정에서의 오류로는 판단되지 않는다. 따라서 본 연구에서 개발된 microsatellite 마커는 극동산 뱀장어의 친자확인을 위한 신뢰도 높은 결과를 얻을 수 있으며, 단회의 분석으로 다량의 결과값을 확보할 수 있는 multiplex PCR 방법을 적용하여 분석의 효율성을 극대화하였다. 본 분석방법은 극동산 뱀장어의 친자 확인을 통한 방류자원조사 및 양식연구를 위한 혈통관리와 유전적 다양성 유지 등을 위해 활용될 수 있을 것이다.
1 μL를 사용하였다. 또한, PCR 반응은 다양한 primer가 복합적으로 사용되는 만큼 touchdown 방법을 사용하여 기존 분석방법을 기준으로 59℃에서 1 cycle, 58℃에서 1 cycle, 그리고 57℃에서 32 cycle을 수행하였을 경우 가장 좋은 결과값을 확보할 수 있었다(Table 5).
극동산 뱀장어의 유전체정보를 해독하고, 이로부터 검정된 9개의 microsatellite 마커를 선별하였다. 선별된 마커 정보에서는 대립유전자의 유전에 관한 문제점은 발견되지 않았으며, 국립수산과학원에서 인공 생산한 극동산 뱀장어 4개 집단 95개체 중 93개체가 모두 95% 이상의 신뢰도로 부모개체의 확인이 가능하였다. 또한, 교배조합과는 다르게 교배가 이루어진 자손개체(Group 3-14, F4462 × M3171)와 인공종자 생산에서 배제된 부모개체(M3893, M3896)가 있는 것으로 확인되었으나, LOD score를 기준으로 볼 때 분석과 정에서의 오류로는 판단되지 않는다.
선별된 마커들의 유전체 영역 내 위치정보를 확인한 결과 intergenic 영역에서 427,361개로 가장 많은 마커들이 선별된 것으로 확인되었으며, 3’-UTR 영역에서 7,705개, 5’-UTR 영역에서 7,424개, 그리고 CDS 영역에서 2,664개로 확인되었다
유전체 정보 분석에 사용된 시료는 Cytochrome b 유전자 분석을 통해 Anguilla japonica (MH050933)와 100% 일치하는 것을 확인하였다. 이로부터 유전체 정보를 대량생산한 결과 short read는 약 26 Gb, long read는 약 84 Gb의 염기서열을 확보하였다.
이로부터 유전체 정보를 대량생산한 결과 short read는 약 26 Gb, long read는 약 84 Gb의 염기서열을 확보하였다. 최종 유전체 조립 결과 1,306개의 contig로 이루어진 1,051.82 Mb의 극동산 뱀장어 초벌 유전체를 완성하였으며, 유전체 조립의 품질을 나타내는 N50 contig length는 1.6 M로 확인되었다(Table 2). 이를 기준으로 SSRIT를 이용하여 SSR 영역을 탐색한 결과 di-는 294,001개, tri-는 54,314개, tetra-는 36,680개, penta-는 16,764개, 그리고 hexa-는 42,965개가 선별되었다(Table 3).

후속연구

따라서 본 연구에서 개발된 microsatellite 마커는 극동산 뱀장어의 친자확인을 위한 신뢰도 높은 결과를 얻을 수 있으며, 단회의 분석으로 다량의 결과값을 확보할 수 있는 multiplex PCR 방법을 적용하여 분석의 효율성을 극대화하였다. 본 분석방법은 극동산 뱀장어의 친자 확인을 통한 방류자원조사 및 양식연구를 위한 혈통관리와 유전적 다양성 유지 등을 위해 활용될 수 있을 것이다.

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저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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