식물배양세포의 항산화기구 이해를 위하여 다양한 식물종에서 유도된 100종의 배양세포주를 대상으로 항산화효소 활성 및 저분자항산화물질을 분석하였다. 배양세포의 SOD와 POD 활성은 식물체에 비해 매우 높았으며, 특히 고구마와 카사바 배양세포는 각각 POD와 SOD 활성이 가장 높아, 항산화효소의 생산 및 항산화기구 해석에 좋은 소재임이 시사되었다. 배양세포의 평균 ascorbate 함량은 식물체에 비해 1/100 수준으로 낮았으며, glutathione 함량은 배양세포가 식물체보다 약 2-3배 높았다. 흥미롭게도 ascorbate와 glutathione의 환원형과 산화형의 비율은 식물종에 따라 큰 차이가 있음이 밝혀졌다. 결론적으로 식물배양세포는 높은 산화적인 스트레스에서 배양되는 것이 생화학적으로 확인되어 항산화물질 생산 및 항산화기구 연구에 좋은 소재임이 시사되었다.
식물배양세포의 항산화기구 이해를 위하여 다양한 식물종에서 유도된 100종의 배양세포주를 대상으로 항산화효소 활성 및 저분자항산화물질을 분석하였다. 배양세포의 SOD와 POD 활성은 식물체에 비해 매우 높았으며, 특히 고구마와 카사바 배양세포는 각각 POD와 SOD 활성이 가장 높아, 항산화효소의 생산 및 항산화기구 해석에 좋은 소재임이 시사되었다. 배양세포의 평균 ascorbate 함량은 식물체에 비해 1/100 수준으로 낮았으며, glutathione 함량은 배양세포가 식물체보다 약 2-3배 높았다. 흥미롭게도 ascorbate와 glutathione의 환원형과 산화형의 비율은 식물종에 따라 큰 차이가 있음이 밝혀졌다. 결론적으로 식물배양세포는 높은 산화적인 스트레스에서 배양되는 것이 생화학적으로 확인되어 항산화물질 생산 및 항산화기구 연구에 좋은 소재임이 시사되었다.
To understand the antioxidative mechanism in plant cell cultures, we investigated the levels of antioxidant enzymes and low molecular antioxidants in 100 cell lines derived from different plant species. SOD and POD activities in plant cell lines were significantly higher than intact plants. The cell...
To understand the antioxidative mechanism in plant cell cultures, we investigated the levels of antioxidant enzymes and low molecular antioxidants in 100 cell lines derived from different plant species. SOD and POD activities in plant cell lines were significantly higher than intact plants. The cell lines from sweet potato (Ipomoea batatas) and cassava (Manihot esculeanta) showed the highest POD and SOD activities, respectively, suggesting that the cell cultures of sweet potato and cassava are good biomaterials for the mass production and molecular study of antioxidant enzymes. The average ascorbate content in plant cell lines was several hundred times lower than intact plants, whereas the glutathione content was 2-3 times higher than plants. Interestingly, the ratio of reduced and oxidized ascorbate and glutathione was different from plant species. In conclusion, the results strongly suggest that plant cell cultures are good biomaterials for the study of antioxidative mechanism and the production of useful components including antioxidants.
To understand the antioxidative mechanism in plant cell cultures, we investigated the levels of antioxidant enzymes and low molecular antioxidants in 100 cell lines derived from different plant species. SOD and POD activities in plant cell lines were significantly higher than intact plants. The cell lines from sweet potato (Ipomoea batatas) and cassava (Manihot esculeanta) showed the highest POD and SOD activities, respectively, suggesting that the cell cultures of sweet potato and cassava are good biomaterials for the mass production and molecular study of antioxidant enzymes. The average ascorbate content in plant cell lines was several hundred times lower than intact plants, whereas the glutathione content was 2-3 times higher than plants. Interestingly, the ratio of reduced and oxidized ascorbate and glutathione was different from plant species. In conclusion, the results strongly suggest that plant cell cultures are good biomaterials for the study of antioxidative mechanism and the production of useful components including antioxidants.
캘러스를 4주 간격으로 계대 배양하여 25℃에서 암 배양하였다. 계대배양 시의 세포를 수확하여 활성을 조사하였다. SOD 활성은 xanthine oxidase와 cytochrome c을 이용한 McCord와 Fridovich의 방법3)에 따라 측정하였다.
CAT 활성은 기질인 과산화수소의 감소량을 측정하는 방법5)을 사용하였다. 저분자 항산화 활성은 DPPH 자유라디칼 포착활성6)으로 조사하였다. Ascorbate 함량은 Graham과 Annette의 방법7)에 따라 HPLC를 사용하여 분석하였다.
대상 데이터
식물 배양 세포주는 생명공학연구소 식물세포 공학연구실과 유전자원센터에서 관리, 배양하고 있는 캘러스 세포주 약 100종을 대상으로 항산화 활성을 분석하였다. 캘러스를 4주 간격으로 계대 배양하여 25℃에서 암 배양하였다.
이론/모형
저분자 항산화 활성은 DPPH 자유라디칼 포착활성6)으로 조사하였다. Ascorbate 함량은 Graham과 Annette의 방법7)에 따라 HPLC를 사용하여 분석하였다. Glutathione 함량은 glutathione reductase와 4-vinylpyridine을 이용한 Griffith의 방법8)에 따라 분석하였다.
POD 활성은 pyrogallol을 기질로 사용한 Sigma 사의 방법4)에 따라 측정하였다. CAT 활성은 기질인 과산화수소의 감소량을 측정하는 방법5)을 사용하였다. 저분자 항산화 활성은 DPPH 자유라디칼 포착활성6)으로 조사하였다.
Ascorbate 함량은 Graham과 Annette의 방법7)에 따라 HPLC를 사용하여 분석하였다. Glutathione 함량은 glutathione reductase와 4-vinylpyridine을 이용한 Griffith의 방법8)에 따라 분석하였다. 고구마와 카사바 배양세포에서 각각 POD cDNA와 SOD cDNA의 분리 및 유전자의 발현실험은 저자들의 보문9-11)에 자세히 기술되어 있다.
SOD 활성은 xanthine oxidase와 cytochrome c을 이용한 McCord와 Fridovich의 방법3)에 따라 측정하였다. POD 활성은 pyrogallol을 기질로 사용한 Sigma 사의 방법4)에 따라 측정하였다. CAT 활성은 기질인 과산화수소의 감소량을 측정하는 방법5)을 사용하였다.
계대배양 시의 세포를 수확하여 활성을 조사하였다. SOD 활성은 xanthine oxidase와 cytochrome c을 이용한 McCord와 Fridovich의 방법3)에 따라 측정하였다. POD 활성은 pyrogallol을 기질로 사용한 Sigma 사의 방법4)에 따라 측정하였다.
성능/효과
1) 배양세포의 POD 활성과 고구마 배양세포의 POD 특성 규명: 100종의 식물배양 세포주 에서 POD 활성(units/mg protein)이 10 이하인 세포주가 90종 이였으며, 고구마(Ipomoea batatas) 신초의 정단분열조직으로부터 유도한 세포주가 229로 가장 높았다4). 고구마 세포주를 small cell-aggregate method로 모세 포주(3,500 units/g cell dry wt) 보다 POD 활성이 높고 세포 생장이 양호한 세포주 SP-47을 선발하여 현탁 배양하였을 때 SP-47은 모세포 주보다 flask 당 POD 활성이 약 1.
2) 토마토와 카사바 배양세포의 SOD 활성: 다양한 유도조건에서 확립된 97종의 세포주를 대상으로 SOD 활성을 조사한 결과, 단위세포 무게당 활성(units/g fresh wt)과 비활성도(units/mg protein) 는 토마토(Lycopersicom esculentum)와 카사바(Manihot esculeanta) 세포주에서 각각 1,580 와 2,659로 가장 높았다14). 토마토 현탁배양에서는 세포 밖으로 분비되는 extracellura SOD 활성이 전체 활성의 약 75%을 차지하였다15).
3) 배양세포의 CAT 활성: 97종의 배양 세포주를 대상으로 CAT 활성을 조사한 결과, 비활성 도(units/mg protein)가 10인 세포주가 5종이였으며 꿩의다리(Thalictrum aquilegifolium) 세포주에서 65로 가장 높았다. 단위세포 무게당 활성(units/g cell fresh wt)이 20 이상인 세포주가 10종이였으며 무(Raphanus satiuus) 세포주에서 172로 가장 높았다16).
4) 배양세포의 DPPH 자유라디칼 포착 활성 및 ascorbate 함량 : 64종의 배양세포를 대상으로 DPPH 자유라디칼 포착 활성을 조사한 결과 다양한 활성을 나타내었으며, 덩굴장미(Rosa multiflora), 황금(Scutellaria baicalensis), 쇠무릅(Ac/vmthes japonica)의 ascorbate 함량(μg/g cell fresh wt)은 각각 48.5, 30.3, 16.8이였다17). 식물배양세포의 ascorbate 함량은 식물체에 비해 약 1/100로 매우 낮았다.
. 고구마 세포주를 small cell-aggregate method로 모세 포주(3,500 units/g cell dry wt) 보다 POD 활성이 높고 세포 생장이 양호한 세포주 SP-47을 선발하여 현탁 배양하였을 때 SP-47은 모세포 주보다 flask 당 POD 활성이 약 1.5배 높았다. SP-47 배양세포로부터 산성의 POD isoenzyme 3개 (Al, A2, A3)를 분리하여 효소학적 특성을 규명한 결과, A2 isoenzyme이 배양세포 전체 단백질의 약 7.
식물배양세포의 ghitathione 함량은 식물체에 비하여 약 2-3배 높았다.고구마와 황금은 환원형인 GSH 함량이, 카사바와 덩굴 장미는 산화형인 GSSG 함량이 식물체와 배양세포에 관계없이 모든 생장 시기에 높았다. 배양세포 종류에 따라 현탁배양에 따른 glutathione함량은 약간의 차이를 나타내었지만, 세포생장 단계와 관계없이 거의 비슷한 함량을 나타내었다.
단위세포 무게당 활성(units/g cell fresh wt)이 20 이상인 세포주가 10종이였으며 무(Raphanus satiuus) 세포주에서 172로 가장 높았다16). 식물 배양세포의 CAT 활성은 식물체에 비해 현저히 낮은 값을 나타내었다.
특히 A2 isoenzyme을 코드 하는 swpa2 유전자는 식물체 조직에서는 전혀 발현되지 않았고 스트레스에 의해 가장 강하게 유도되었다. 최근 A2 isoenzyme을 코드 하는 유전자(SWPA2)를 분리한 결과, 이 유전자의 promoter는 스트레스에 의해 유도되는 특징(stress-inducible promoter)을 갖고 있음이 확인되었다. 현재 스트레스 관점에서 SWPA2 promoter 특성을 규명 중이며, SWPA2 promoter는 환경 스트레스 내성 식물 및 형질전환 식물 배양세포에서 약리 활성 단백질 생산 등에 이용될 수 있을 것으로 기대된다.
황금현탁배양에서 여러 전구물질을 처리하여 ascorbate의 함량 변화를 조사한 결과, L-galactose, L-galactonoT, 4Tactone 등이 ascorbate 생합성에 효과적인 전구물질임이 확인되어, 식물배양세포 는 ascorbate 생합성 및 대사 연구에 적합한 소재임이 확인되었다18). 홍미롭게도 카사바와 덩굴 장미는 환원형인 ascorbate함량이, 고구마와 황금은 산화형인 dehydroascorbate (DHA) 함량이 식물체와 배양세포에 관계없이 모든 생장 시기에서 높았다.
후속연구
그러나 배양세포가 지닌 배양 특성에 대한 구체적인 연구는 대단히 미흡한 실정이다. 식물 배양세포는 식물체가 자라는 환경보다 높은 산화적인 스트레스를 포함한 배양 스트레스에서 생장하기 때문에 배양세포는 항산화 물질의 생산 및 항산화 기구 해석에 대단히 중요한 소재가 될 수 있을 것으로 기대된다. 이러한 맥락에서 발표자의 연구팀은 다양한 식물 종에서 유도된 100종의 배양 세포주를 대상으로 항산화 효소 활성 및 저분자항산화물질을 분석하고, 항산화 물질의 생산과 유용 유전자의 분리 및 이용에 관한 연구를 수행하고 있다.
최근 A2 isoenzyme을 코드 하는 유전자(SWPA2)를 분리한 결과, 이 유전자의 promoter는 스트레스에 의해 유도되는 특징(stress-inducible promoter)을 갖고 있음이 확인되었다. 현재 스트레스 관점에서 SWPA2 promoter 특성을 규명 중이며, SWPA2 promoter는 환경 스트레스 내성 식물 및 형질전환 식물 배양세포에서 약리 활성 단백질 생산 등에 이용될 수 있을 것으로 기대된다.
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