[논문]단백질의 분리정제를 위한 한외여과막의 응용에 대한 연구

손동호; 전회진; 조남준; 구자경

단백질의 분리정제를 위한 한외여과막의 응용에 대한 연구
A Study on the Application of Ultrafiltration Membranes for Separations and Purifications of Proteins 원문보기

손동호 (한국기술교육대학교 응용화학공학과) , 전회진 (한국기술교육대학교 응용화학공학과) , 조남준 (한국기술교육대학교 응용화학공학과) , 구자경 (한국기술교육대학교 응용화학공학과)

최근에 이루어지고 있는 생명공학의 성장에 따라 단백질을 대량으로 정제할 수 있는 공정 개발에 대한 필요성이 부각되고 있다. 이러한 목적으로 기존에 이루어지고 있는 침전법, 결정화법 그리고 원심분리법과 같은 방법은 선택도가 매우 떨어지는 단점이 있으며, 반면 크로마토그래피 및 전기영동과 같은 방법은 탁월한 선택도에 비해 그 규모가 매우 작은 경우 에 알맞은 방법으로서 대량생산 체계에서는 적합하지 못하다는 것이 그 단점이다.(중략)

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문제 정의

최근 단백질의 분리 정제롤 위하여 한외여과공정을 옹용하는 분야로는 주로 난단백(egg white)으로부터 라이소자임을 분리 정제 하는 분야에서 가장 널리 연구되어 왔다. 본 연구에서도 Millipore 사의 한외여과막을 이용하여 난단백으로부터 라이소자임을 분리 정제하기 위한 최적의 분리막 및 막분리공정의 조건에 대하여 연구하였다.
한외여과법은 실험실 규모의 실험 결과 로부터 스케일-업하기가 매우 용이하므로 대량생산 체제에 가장 적합한 방안이며, 한외여과공정에 사용하는 분리막의 공극의 크기, 분리 정제되는 용액의 pH 및 막분리공정의 TMP 둥의 변수를 최적화함에 따라 매우 높은 선택도까지도 얻을 수 있는 방법으로 알려져 있다. 본 연구의 목적은 한외여과공정을 통하여 단백질을 분리 정제하기 위한 기본 자료를 마련하는 것이다. 최근 단백질의 분리 정제롤 위하여 한외여과공정을 옹용하는 분야로는 주로 난단백(egg white)으로부터 라이소자임을 분리 정제 하는 분야에서 가장 널리 연구되어 왔다.

제안 방법

분리막은 Millipore 사에서 제조한 cellulose 재질의 막을 사용하였으며 사용된 막의 MWCO 는 각각 100z000(PLHK04310), 30, 000(PLTK04310), 10, 000(PLGC04310) 및 5, 000(PLCC04310)<선택하여 실험하였다. 난 단백 용액은 시판되는 계란을 구입하여 그 흰자위를 1%로 희석하여 만들었으며, 용액의 pH 는 phosphate 완충용액을 이용하여 그 pH 가 각각 6, 7, 8이 되도록 조절하여 사용하였다. 한외여과가 이루어지기 이전의 용액과 한외 여과막을 통해 투과된 용액 내의 성분별 함량은 HPLC(HP seriesllOO) 에 의해 측정되었으며, 사용된 column으로는 Waters 제품인 Shodex KW-802.
본 연구에서는 Millipore 사 제품인 교반형 막분리장치(Stirred Cell 5122)를 이용하여 막 분리를 수행하였다. 막 분리장치는 외부로부터 장치 내에 연결된 질소에 의해 가압되어 TMP 가 형성되도록 하였으며, TMP 의 범위는 0.5 - 3.0 bar의 범위로 채택하였다. 막 분리장치 내의 용액은 magnetic stirrer 에 의해 교반하여 막상류부 용액의 농도분극 현상을 방지하였다.
동시에 분리, 정제된 라이소자임의 순도를 최대로 하기 위하여서는 알부민과 같은 난단백 내의 여타의 성분에 대한 transmission은 되도록 낮게 유지하여야 한다. 한외여과 공정에서의 투과 유속과 용질의 transmission에 대하여 가장 직접적인 영향을 끼치는 것은 분리막의 공극직경에 의하여 결정되는 MWCO(Molecular Weight Cut Off)이며 본 연구에서는 각각 MWCO 100, 000, 30, 000 및 10, 000으로 변화시켜 가면서 분리막의 효율을 측정하였다. Fig 1.
난 단백 용액은 시판되는 계란을 구입하여 그 흰자위를 1%로 희석하여 만들었으며, 용액의 pH 는 phosphate 완충용액을 이용하여 그 pH 가 각각 6, 7, 8이 되도록 조절하여 사용하였다. 한외여과가 이루어지기 이전의 용액과 한외 여과막을 통해 투과된 용액 내의 성분별 함량은 HPLC(HP seriesllOO) 에 의해 측정되었으며, 사용된 column으로는 Waters 제품인 Shodex KW-802.5를 사용하였 다.

대상 데이터

본 연구에서는 Millipore 사 제품인 교반형 막분리장치(Stirred Cell 5122)를 이용하여 막 분리를 수행하였다. 막 분리장치는 외부로부터 장치 내에 연결된 질소에 의해 가압되어 TMP 가 형성되도록 하였으며, TMP 의 범위는 0.
투과실험이 이루어지는 동안 분리막을 통하여 투과된 용액의 질량은 전자저울을 통하여 측정, 기록되었으며 투과 유속은 시간에 따른 투과용액의 질량 증가율에 의하여 산출되었다. 분리막은 Millipore 사에서 제조한 cellulose 재질의 막을 사용하였으며 사용된 막의 MWCO 는 각각 100z000(PLHK04310), 30, 000(PLTK04310), 10, 000(PLGC04310) 및 5, 000(PLCC04310)<선택하여 실험하였다. 난 단백 용액은 시판되는 계란을 구입하여 그 흰자위를 1%로 희석하여 만들었으며, 용액의 pH 는 phosphate 완충용액을 이용하여 그 pH 가 각각 6, 7, 8이 되도록 조절하여 사용하였다.

성능/효과

은 이들 각각의 분리막을 통한 용액에서의 라이소자임과 알부민의 농도를 나타낸다. MWCO 100, 000 분리막의 경우 난단백 내에 알부민이 워낙 많이 함유되어 있으므로 막을 통하여 한외 여과된 용액 내에서도 라이소자임에 비해 매우 높은 함량을 차지하고 있는 것으로 나타났다. 그러나 알부민은 그 분자량이 (45, 000) 라이 소자임(14, 300)에 비애매 우 높으므로 MWCO 가 줄어들면서 투과된 용액 내의 함량이라이소자임에 배해 매우 급격하게 감소하는 것을 볼 수 있으며 MWCO 가 10, 000에 도 달해서는 알부민의 함량이라이소자임의 함량보다 낮아지는 것을 볼 수 있다.
본 연구의 결과로 한외여과를 통하여 단백질을 분리 정제 하는 데에 있어서 선택도를 높이는 가장 직접적인 방법은 분리막의 MWCO를 조정하는 것이지만, 원료용액의 pH와 투과공정에서의 TMP를 최적화하여 분리막의 MWCO를 변화하지 않고도 선택도를 높일 수 있다는 결론을 얻을 수 있었다 .
막 분리장치 내의 용액은 magnetic stirrer 에 의해 교반하여 막상류부 용액의 농도분극 현상을 방지하였다. 투과실험이 이루어지는 동안 분리막을 통하여 투과된 용액의 질량은 전자저울을 통하여 측정, 기록되었으며 투과 유속은 시간에 따른 투과용액의 질량 증가율에 의하여 산출되었다. 분리막은 Millipore 사에서 제조한 cellulose 재질의 막을 사용하였으며 사용된 막의 MWCO 는 각각 100z000(PLHK04310), 30, 000(PLTK04310), 10, 000(PLGC04310) 및 5, 000(PLCC04310)<선택하여 실험하였다.

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