양파(Allium cepa) 추출물의 간보호 및 항산화 효과 The Hepatotprotective and Antioxidative Effects of Onion (Allium cepa) Extracts in Rat Hepatocyte Primary Culture원문보기
본 연구의 목적은 양파추출물의 간보호 및 항산화 효과를 조사하기 위함이다. 간 손상을 유발시키는 t-BHP (1.5mM) 존재하에 간세포를 0, 0.01, 0.05, 0.1 및 0.3 mg/ml의 다양한 농도의 양파추출물로 1시간 동안 일차배양하였다. 간세포 독성과 생존율은 배양액의 GOT와 LDH 활성 및 MTT 값으로 결정하였고, 지질과산화는 TBARS 농도로 측정하였다. 항산화에 미치는 효과는 catalase, GSH-Px, GSH-Rd 활성 및 DNA strand breaking assay로 결정하였다. t-BHP는 GOT와 LDH 활성 및 TBARS 농도를 증가시켰으며 MTT값은 감소시켰다. 0.05 mg/ml 이상 농도의 양파추출물 첨가는 1.5 mM 농도의 t-BHP에 의해 증가된 GOT 및 LDH 활성을 감소시켰으며 0.01 mg/ml 이상 농도의 양파추출물은 t-BHP에 의해 감소된 MTT 값을 증가시켰다. 또한 0.01 mg/ml 이상 농도의 양파추출물 첨가는 t-BHP에 의해 증가된 TBARS 농도를 감소시켜 양파추출물이 t-BHP에 의해 유발된 간손상과 지질과산화를 억제시켰다. 1시간 동안 1.5 mM 농도의 t-BHP 처리는 간세포의 catalase, GSH-Px 및 GSH-Rd 활성을 현저히 감소시켰다. 그러나 0.01 mg/ml 이상 농도의 양파추출물 첨가는 t-BHP에 의해 감소된 catalase, GSH-Px 및 GSH-Rd 활성을 증가시켰으며 특히 catalase 활성은 t-BHP 무첨가군 수준까지 증가시켰다. 또한 hydroxyl radical을 생성하는 Fenton 시약의 존재하에 plasmid DNA를 양파추출물과 함께 배양하였을 때양파추출물은 농도 의존적으로 hydroxyl radical에 의해 유도된 single-strand 절단을 억제하였다. 이상과 같이 간세포 일차배양에서 양파추출물은 t-BHP에 의해 유발된 간독성, 간세포 생존율 감소, 지질과산화를 농도 의존적으로 억제시켰고 또한 t-BHP에 의해 억제된 GSH-Px, GSH-Rd 및 catalase의 활성을 증가시켰다. 이와 같이 양파추출물의 간보호 및 항산화 효과는 항산화 효소, 특히 catalase의 활성 증가와 hydroxyl radical에 의해 유도된 산화억제 및 이에 따른 지질과산화 억제에 기인하는 것으로 사료된다.
본 연구의 목적은 양파추출물의 간보호 및 항산화 효과를 조사하기 위함이다. 간 손상을 유발시키는 t-BHP (1.5mM) 존재하에 간세포를 0, 0.01, 0.05, 0.1 및 0.3 mg/ml의 다양한 농도의 양파추출물로 1시간 동안 일차배양하였다. 간세포 독성과 생존율은 배양액의 GOT와 LDH 활성 및 MTT 값으로 결정하였고, 지질과산화는 TBARS 농도로 측정하였다. 항산화에 미치는 효과는 catalase, GSH-Px, GSH-Rd 활성 및 DNA strand breaking assay로 결정하였다. t-BHP는 GOT와 LDH 활성 및 TBARS 농도를 증가시켰으며 MTT값은 감소시켰다. 0.05 mg/ml 이상 농도의 양파추출물 첨가는 1.5 mM 농도의 t-BHP에 의해 증가된 GOT 및 LDH 활성을 감소시켰으며 0.01 mg/ml 이상 농도의 양파추출물은 t-BHP에 의해 감소된 MTT 값을 증가시켰다. 또한 0.01 mg/ml 이상 농도의 양파추출물 첨가는 t-BHP에 의해 증가된 TBARS 농도를 감소시켜 양파추출물이 t-BHP에 의해 유발된 간손상과 지질과산화를 억제시켰다. 1시간 동안 1.5 mM 농도의 t-BHP 처리는 간세포의 catalase, GSH-Px 및 GSH-Rd 활성을 현저히 감소시켰다. 그러나 0.01 mg/ml 이상 농도의 양파추출물 첨가는 t-BHP에 의해 감소된 catalase, GSH-Px 및 GSH-Rd 활성을 증가시켰으며 특히 catalase 활성은 t-BHP 무첨가군 수준까지 증가시켰다. 또한 hydroxyl radical을 생성하는 Fenton 시약의 존재하에 plasmid DNA를 양파추출물과 함께 배양하였을 때양파추출물은 농도 의존적으로 hydroxyl radical에 의해 유도된 single-strand 절단을 억제하였다. 이상과 같이 간세포 일차배양에서 양파추출물은 t-BHP에 의해 유발된 간독성, 간세포 생존율 감소, 지질과산화를 농도 의존적으로 억제시켰고 또한 t-BHP에 의해 억제된 GSH-Px, GSH-Rd 및 catalase의 활성을 증가시켰다. 이와 같이 양파추출물의 간보호 및 항산화 효과는 항산화 효소, 특히 catalase의 활성 증가와 hydroxyl radical에 의해 유도된 산화억제 및 이에 따른 지질과산화 억제에 기인하는 것으로 사료된다.
The objectives of present study were to investigate the hepatoprotective and antioxidative effects of onion extracts. Primary cultures of rat hepatocytes were incubated with 1.5 mM tert-butyl hydroperoxide(t-BHP), potent oxidizing agent for liver injury for 1 hr in the presence or absence of various...
The objectives of present study were to investigate the hepatoprotective and antioxidative effects of onion extracts. Primary cultures of rat hepatocytes were incubated with 1.5 mM tert-butyl hydroperoxide(t-BHP), potent oxidizing agent for liver injury for 1 hr in the presence or absence of various concentrations (0, 0.01, 0.05, 0.1 or 0.3 mg/ml) of onion extract. Cytotoxicity and cell viability were determined by measuring glutamic oxaloacetic transaminase(GOT) activity, lactate dehydrogenase(LDH) activity and 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide(MTT) value. Lipid peroxidation was evaluated using thiobarbituric acid reactive substances(TBARS) assay. Effects on antioxidant system were determined by measuring catalase, glutathione peroxidase(GSH-Px), glutathione reductase(GSH-Rd) activities as well as DNA strand breaking assay. Incubation with t-BHP alone increased GOT and LDH activities and TBARS concentration but decreased MTT reduction. Onion extracts at the concentration of 0.05 mg/ml began to decrease GOT and LDH activities induced by 1.5 mM t-BHP. Decreased MTT reduction began to be increased by onion extract at the concentration of 0.01 mg/ml. Onion extracts at the concentration of 0.01 mg/ml began to decrease TBARS concentration induced by t-BHP. Taken together, onion extracts prevented t-BHP-induced hepatocyte injury and lipid peroxidation. Catalase, GSH-Px and GSH-Rd activities of hepatocytes were significantly decreased by 1.5 mM t-BHP for 1 hr incubation. Onion extracts, on the other hand, at the concentration of 0.1 mg/ml began to prevent t-BHP-induced decrease in catalase, GSH-Px and GSH-Rd activities. Onion extracts prevented hydroxyl radical-induced single-strand breakage in dose-dependent manner when plasmid DNA was incubated with various concentrations of onion extracts in the presence of Fenton regents producing hydroxyl radical. These results demonstrate that onion extracts suppressed t-BHP-induced cytoctoxicity, decreased viability and lipid peroxidation and increased GSH-Px, GSH-Rd and catalase activities. Thus hepatoprotective and antioxidant effects of onion extract seem to be due to, at least in part, the increase in antioxidant enzyme activities as well as prevention from hydroxyl radical-induced oxidation, followed by inhibition in lipid peroxidation.
The objectives of present study were to investigate the hepatoprotective and antioxidative effects of onion extracts. Primary cultures of rat hepatocytes were incubated with 1.5 mM tert-butyl hydroperoxide(t-BHP), potent oxidizing agent for liver injury for 1 hr in the presence or absence of various concentrations (0, 0.01, 0.05, 0.1 or 0.3 mg/ml) of onion extract. Cytotoxicity and cell viability were determined by measuring glutamic oxaloacetic transaminase(GOT) activity, lactate dehydrogenase(LDH) activity and 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide(MTT) value. Lipid peroxidation was evaluated using thiobarbituric acid reactive substances(TBARS) assay. Effects on antioxidant system were determined by measuring catalase, glutathione peroxidase(GSH-Px), glutathione reductase(GSH-Rd) activities as well as DNA strand breaking assay. Incubation with t-BHP alone increased GOT and LDH activities and TBARS concentration but decreased MTT reduction. Onion extracts at the concentration of 0.05 mg/ml began to decrease GOT and LDH activities induced by 1.5 mM t-BHP. Decreased MTT reduction began to be increased by onion extract at the concentration of 0.01 mg/ml. Onion extracts at the concentration of 0.01 mg/ml began to decrease TBARS concentration induced by t-BHP. Taken together, onion extracts prevented t-BHP-induced hepatocyte injury and lipid peroxidation. Catalase, GSH-Px and GSH-Rd activities of hepatocytes were significantly decreased by 1.5 mM t-BHP for 1 hr incubation. Onion extracts, on the other hand, at the concentration of 0.1 mg/ml began to prevent t-BHP-induced decrease in catalase, GSH-Px and GSH-Rd activities. Onion extracts prevented hydroxyl radical-induced single-strand breakage in dose-dependent manner when plasmid DNA was incubated with various concentrations of onion extracts in the presence of Fenton regents producing hydroxyl radical. These results demonstrate that onion extracts suppressed t-BHP-induced cytoctoxicity, decreased viability and lipid peroxidation and increased GSH-Px, GSH-Rd and catalase activities. Thus hepatoprotective and antioxidant effects of onion extract seem to be due to, at least in part, the increase in antioxidant enzyme activities as well as prevention from hydroxyl radical-induced oxidation, followed by inhibition in lipid peroxidation.
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문제 정의
ABHP는 간세포 내 cytochrome P450에 의해 alkoxyl 및 peroxyl radical로 대사되며 (Masaki 등 1989b, Minotti, 1989； 1989； Davies, 1989)이러한 free radical intermediates가 지질과산화를 개시 함으로써 (Hogberg 등, 1975； Masaki 등, 1989a) 세포 손상을 초래한다고 (Rush 등, 1985) 알려져 있다. 따라서, 본 실험에서는 간세포의 산화손상을 유도할 목적으로 t-BHF를 사용하여 양파의 간 보호 효과를 연구하였다. 다양한 농도의 양파 추출물이 t-BHP 로 유발된 간세포 손상 및 지질과 산화에 미치는 효과는 Table 1과 같았다.
최근에 단쇄 지질과산화물(shortrhain lipid hydroperoxide)t-Butyl hydroperoxide(t-BHP)를 이용한 간세포 일차 배양 시스템은 천연 추출물의 간 손상, 지질과산화 억제, 항산화효 및 다양한 생물학적 효과들을 연구하는데 유용한 모델로 많이 사용되고 있다. 따라서, 양파 추출물의 항산화 및 간 보호 효과를 이해하기 위해서 본 연구에서는 간세포 일차 배양을 통해 양파 추출물이 t-BHP에 의해 유발된 간세포 독성, 지질과 산화 및 항산화 효소 활성에 미치는 영향을 조사하였으며 DNA strand breaking 방법을 이용하여 양파 추출물의 hydroxyl radical에 대한 항산화 활성을 조사하였다.
본 연구의 목적은 양파 추출물의 간 보호 및 항산화 효과를 조사하기 위함이다. 간 손상을 유발시키는 t-BHP (1.
제안 방법
Hydroxyl radical에 의한 DNA strand breakinge Hiramoto 등(1996)의 방법에 따라 측정하였다. Supercoiled 아BR 322 DNA에 다양한 농도의 양파 추출물을 넣고 H2O2(최종농도 0.099 mM) 와 FeSO4(최종농도 0.099 mM)와 함께 37℃에서 1시간 배양한 후 1% agarose 로 전기영동을 실시하였다. 각 DNA band의 density는 Scion Image program(Scion Image Beta 4.
099 mM)와 함께 37℃에서 1시간 배양한 후 1% agarose 로 전기영동을 실시하였다. 각 DNA band의 density는 Scion Image program(Scion Image Beta 4.02 for windows) 을 사용하여 측정하였다.
3 mg/ml의 다양한 농도의 양파 추출물로 1시간 동안 일차 배양하였다. 간세포 독성과 생존율은 배양액의 GOT 와 LDH 활성 및 MTT 값으로 결정하였고, 지질과 산화는 TBARS 농도로 측정하였다. 항산화에 미치는 효과는 catalase, GSH-Px, GSH~Rd 활성 및 DNA strand breaking assay로 결정하였다.
지질과 산화는 배양액의 TEARS 농도를 측정함으로써 결정하였다. 배양 후 배양액을 채취하여 4℃에서 3,000 rpm으로 5분간 원심분리하였고, 상 등액을 취하여 측정시까지 -20℃에서 보관하였다, TBARS 농도는 Uchiyama와 Mihara(1978)의 방법을 수정한 Sunderman 등(1985)의 방법에 따라 처리 군별 4반복하여 측정하였다. TBARS 농도는 532 nm에서 흡광도를 측정하여 표준용액으로 사용한 malondialdehyde 농도로 표기하였다.
실험동물 : (주)오리엔트로부터 구입한 6주령 Sprague-Dawley 수컷랫드를 실험동물로 사용하였다. 본 실험실에서 사료와 물은 무제한 공급하였고 1주일의 적응 기간을 거친 다음 간세포배양을 실시하였다.
가장 바깥쪽의 주황색을 띤 표피를 제거, 음지에서 통풍건조 후 세절하였다. 분쇄한 양파표피15ng을 100끼 methariol(HPLC-giade)로 1시간 정도 교반한 뒤 20분간 iMrasonicatum시켰 다. 상등액을 제거한 다음 methanol 추출을 2번 더 실시하였다.
지질과 산화는 배양액의 TEARS 농도를 측정함으로써 결정하였다. 배양 후 배양액을 채취하여 4℃에서 3,000 rpm으로 5분간 원심분리하였고, 상 등액을 취하여 측정시까지 -20℃에서 보관하였다, TBARS 농도는 Uchiyama와 Mihara(1978)의 방법을 수정한 Sunderman 등(1985)의 방법에 따라 처리 군별 4반복하여 측정하였다.
간세포 독성과 생존율은 배양액의 GOT 와 LDH 활성 및 MTT 값으로 결정하였고, 지질과 산화는 TBARS 농도로 측정하였다. 항산화에 미치는 효과는 catalase, GSH-Px, GSH~Rd 활성 및 DNA strand breaking assay로 결정하였다. t-BHPt GOT와 LDH 활성 및 TBARS 농도를 증가시켰으며 MTT값은 감소시켰다.
대상 데이터
시약: Supercoilded plasmid pBR 322 DNA는 Roche사에서, Fetal bovine serume Cambrex사에서, HBSS. WME 및 L-gkitammee GIBCO사에서 구입하였으며 기타 세포배양에 필요한 시약들과 생화학적 분석에 필요한 시약들은 Sigma Chemical사에서 구입하여 사용하였다.
실험동물 : (주)오리엔트로부터 구입한 6주령 Sprague-Dawley 수컷랫드를 실험동물로 사용하였다. 본 실험실에서 사료와 물은 무제한 공급하였고 1주일의 적응 기간을 거친 다음 간세포배양을 실시하였다.
양파 추출물 : 전라남도 무안군에서 생산되는 양파를 구입하여 시료로 사용하였다.가장 바깥쪽의 주황색을 띤 표피를 제거, 음지에서 통풍건조 후 세절하였다.
데이터처리
자료 분석 및 통계처리 : 처리 군별 %MTT 감소, TBARS 농도, 효소 활성 및 DNA band density들은 일원 분산 분석을 사용하여 조사하였으며, 처리효과가 인정되는 경우 처리 군별 평균값의 차이는 Student-Newman-Keuls' test를 사용하여 p〈 0.05에서 유의성을 조사하였다.
이론/모형
효소분석 : 배양 후 배양액을 채취하여 4℃에서 3,000 rpm으로 5분간 원심분리하였고, 상 등액을 취하여 측정시까지 -20℃에서 보관하였다. Glutamic oxaloacetic transaminase(GOT) 활성은 Reitman과 Frankel(1957)의 방법에 따라 측정하였다. Lactate dehydrogenase(LDH)활성은 Vassault(1983)의 방법에 따라 측정하였다.
Hydroxyl radical에 의한 DNA strand breakinge Hiramoto 등(1996)의 방법에 따라 측정하였다. Supercoiled 아BR 322 DNA에 다양한 농도의 양파 추출물을 넣고 H2O2(최종농도 0.
Glutamic oxaloacetic transaminase(GOT) 활성은 Reitman과 Frankel(1957)의 방법에 따라 측정하였다. Lactate dehydrogenase(LDH)활성은 Vassault(1983)의 방법에 따라 측정하였다.
간세포배양 : 간세포 일차 배양은 Seglen (1976)의 collagenase perfusion 방법을 기초로 하여 배양하였다.
단백질 정량 : 단백질 함량은 BSA를 표준시약으로 사용하여 Bradford(1976)의 방법에 따라 측정하였다.
성능/효과
t-BHPt GOT와 LDH 활성 및 TBARS 농도를 증가시켰으며 MTT값은 감소시켰다. 0.05 mg/ml 이상 농도의 양파 추출물 첨가는 1.5 mM 농도의 t-BHP에 의해 증가된 GOT 및 LDH 활성을 감소시켰으며 0.01 mg/ml 이상 농도의양파추출물은 ABHP에 의해 감소된 MTT 값을 증가시켰다. 또한 0.
01 mg/ml 이상 농도의 양파추출물 첨가는 ABHP에 의해 증가된 TBARS 농도를 감소시켜 양파 추출물이 t-BHP에 의해 유발된 간 손상과 지질과산화를 억제시켰다. 1시간 동안 L5 mM 농도의 t-BHP 처리는 간세포의 catalase, GSH-Px 및 GSH-Rd 활성을 현저히 감소시켰다. 그러나 OQl mg/ml 이상 농도의 양파 추출 물 첨가는 t-BHP에 의해 감소된 catalase, GSH-Px 및 GSH-Rd 활성을 증가시켰으며 특히 catalase 활성은 t-BHP 무첨가 군 수준까지 증가시켰다.
1시간 동안 L5 mM 농도의 t-BHP 처리는 간세포의 catalase, GSH-Px 및 GSH-Rd 활성을 현저히 감소시켰다. 그러나 OQl mg/ml 이상 농도의 양파 추출 물 첨가는 t-BHP에 의해 감소된 catalase, GSH-Px 및 GSH-Rd 활성을 증가시켰으며 특히 catalase 활성은 t-BHP 무첨가 군 수준까지 증가시켰다. 또한 hydroxyl radical을 생성하는 Fenton 시약의 존재 하에 plasmid DNA를 양파주 줄물과 함께 배양하였을 때양파 추출물은 농도의존적으로 hydroxyl radical에 의해 유도된 single-strand 절단을 억제하였다.
01 mg/ml 이상 농도의양파추출물은 ABHP에 의해 감소된 MTT 값을 증가시켰다. 또한 0.01 mg/ml 이상 농도의 양파추출물 첨가는 ABHP에 의해 증가된 TBARS 농도를 감소시켜 양파 추출물이 t-BHP에 의해 유발된 간 손상과 지질과산화를 억제시켰다. 1시간 동안 L5 mM 농도의 t-BHP 처리는 간세포의 catalase, GSH-Px 및 GSH-Rd 활성을 현저히 감소시켰다.
이상과 같이 간세포 일차 배양에서 양파 추출물은 t-BHP에 의해 유발된 간독성, 간세포 생존율 감소, 지질과 산화를 농도 의존적으로 억제시켰고 또한 t-BHP에 의해 억제된 GSH-Px, GSH~Rd 및 catalase의 활성을 증가시켰다. 이와 같이 양파 추출물의 간 보호 및 항산화 효과는 항산화 효소, 특히 cataiase의 활성 증가와 hydroxyl radical0!] 의해 유도된 산화억제 및 이에 따른 지질과산화 억제에 기인하는 것으로 사료된다.
이상과 같이 간세포 일차 배양에서 양파 추출물은 t~BHP에 의해 유도된 간독성, 간세포 생존율 감소, 지질과 산화를 억제시켰다. 양파 추출물의 항산화 및 간 보호 효과는 항산화 효소, 특히 catalase의 활성 증가맟 hydroxyl radical에 의해 유도된 산화 억제에 기인하는 것으로 사료된다.
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