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문제 정의
- 최근 들어 결핵균에 대한 유전체 분석이 완성됨에 따라, 결핵균과 관련된 산물에 대한 단백질체를 분석할 수 있게 되었다. 따라서 본 연구에서는 질량분석기와 최신 분석 프로그램을 이용하여 피피디 튜버클린의 단백질체를 규명하였다. 피피디의 단백질체는 402개의 단백질로 구성되었으며, 중간대사와 호흡과 관련된 단백질들이 35%를 차지하였다.
제안 방법
- 다만, 본 연구에서 4개의 주요 HSP들 (GroES, GroEL2, HspX, DnaK)이 동정되었는데, 이들 4개의 주요 HSP들은 cysteine을 가지고 있지 않아 ICAT 기법으로는 정량 분석할 수 없었다. Statens Serum Institute] PPD-RT23와 한국 결핵연구원의 PPD-KIT를 PPD-S2와 비교하였다. 똑같은 두개의 PPD-S2를 정량분석한 결과, 91% 펩타이드가 정상 범위 (H (heavy) to L (light) ratio: 0.
- 동정된 주요 HSP들 중 GroEL2, HspX, DnaK는 세포벽, 세포막 및 세포질 내에 존재하고 GroES는 세포벽과 세포질 내에 존재하는 것으로 알려져 있다. 그러나, 결핵 단백질의 위치를 알아보기 위한 이 실험결과는 PPD생산시와는 다른 균주와 배양조건, 생산조건으로 수행하였다. 따라서, PPD내에 HSP가 많이 동정된 다른 한 원인은 PPD 단백질들이 PPD 제조중 고온처리과정에서 세포질 내와 세포벽에 있던 단백질들이 배양액으로 배출되는 것이 원인일 수 있다.
- 그러나, RAT는 86%, RAC는 61%의 상대적으로 낮은 동정율을 이끌어 낼 수 있었다. 그리하여, 그것들의 판단에서 해석하거나 더 나아가 이용할 수 있는 가장 완전한 자료를 얻기 위해서, 본 연구에서는 p값을 0.2로 하여 단백질 동정결과를 필터하였다. 이로 인하여 상대적으로 실제 100% 정확한 일치를 이끌어내는 대신에 RAT는 7.
- 더욱 완전한 PPD 단백질체를 얻기 위해 1차원 또는 2차원 전기영동대신에 다차원 액체 크로마토그래피 (multi-dimensional liquid chromatography; MDLC)에서 얻은 펩타이드 분획들에 대해 질량분석기로 분석하였다. 환원, 알킬화, 트립신 처리 PPD (RAT)와 환원, 알킬화, 키모트립신 처리 PPD(RAC)를 강양이온 교환 크로마토그래피(strong cation exchange chromatography; SCX) 처리하여 각각 6개와 14개 분획을 얻었다.
- tuberculosis 유래 물질의 복잡한 단백질체를 밝힐 수 있는 기회를 제공한다. 본 연구에서는 면역특이적인 항원을 찾아낼 목적으로 PPD의 단백질체를 정의하기 위해 PPD를 2차원 액체크로마토그래피로 분획하고 직렬 질량분석기에 의해 분석하였으며, ICAT 기법을 이용하여 각기 다른 PPD들 사이의 단백질체를 정량적으로 비교분석하였다.
- 이러한 완전히 자동화되고 신속한 방법은 주관적인 전문가의 판단에 의존하지 않는 객관적인 프로그램으로 자료분석이 일관되고 투명하여진다. 이 프로그램은 대량 자료들의 필터링을 통하여 다른 상황의 결과들을 예상하는 민감성(sensitivity)과 의양성 오동정율(error rate)을 비교하는 방법을 제공한다. PeptideProphet™-^ SEQUEST^결과로부터 얻은 많은 의양성 결과를 제거할 수 있는 데, 이를 이용하면 MS 스펙트럼의 수동적 판단 방법과 달리 객관적으로 단백질체를 분석할 수 있다는 큰 장점을 가지고 있다.
- 환원, 알킬화, 트립신 처리 PPD (RAT)와 환원, 알킬화, 키모트립신 처리 PPD(RAC)를 강양이온 교환 크로마토그래피(strong cation exchange chromatography; SCX) 처리하여 각각 6개와 14개 분획을 얻었다. 이들 각각의 분획을 reverse phase (RP)-HPLC로 더욱 세분하여 분획하였다. 2차원 액체크로마토그래피에 의해 RAC로부터는 149 분획을, RAT로부터는 208 분획을 얻었다.
- 이렇게 단백질분해효소에 따라 동정되는 단백질에 차이를 보이는 것은 트립신과 키모트립신의 특이절단부위 아미노산 차이에 기인하는 것으로 사료된다. 이와 더불어 1차원 SDS-PAGE상에서 RAC PPD를 전기 영동한 후 나타난 5 개의 분명한 밴드를 in-gel 소화분해와 LC-MS/MS에 의해 분석하였다. H8 펩타이드가 이들 단백질 밴드로부터 동정되었는데, RAT와 RAC에서와 마찬가지로 PeptideProphetTM과 proteinProphetT14으로 분석되었다.
- 분획들에 대해 질량분석기로 분석하였다. 환원, 알킬화, 트립신 처리 PPD (RAT)와 환원, 알킬화, 키모트립신 처리 PPD(RAC)를 강양이온 교환 크로마토그래피(strong cation exchange chromatography; SCX) 처리하여 각각 6개와 14개 분획을 얻었다. 이들 각각의 분획을 reverse phase (RP)-HPLC로 더욱 세분하여 분획하였다.
대상 데이터
- ProteinPropheF은 RAT는 260개, RAC는 213개의 단백질들을 동정하였다. RAT와 RAC 결과를 비교했을 때, RAT와 RAC로부터 동정된 총 388개의 단백질들 중 22%가 두 단백질분해효소로부터 공통으로 동정되었다 트립신 처리한 PPD로부터 얻어진 것과 다른 142개의 단백질들이 키모트립신 처리한 PPD로부터 동정되었다.
- 0이상이었다. RAT와 RAC로부터 얻어진 펩타이드는 결핵 유전체로부터 발현이 예상되는 3, 999 단백질 (http://genolist.pasteur.fr/TubercuList) 중 각각 3, 321 (83%)개와 2, 825 (71%)개 단백질들에 해당되었다.
이론/모형
- SDS-PAGE상에서 PPD의 좋지 않은 해상도 때문에 액체크로마토그래피가 단백질 분획기법으로써 전기영동 대신에 사용되었다. 질량분석기에 의한 동정에 공시할 PPD의 환원, 알킬화, 트립신분해 및 키모트립신분해 처리는 상대적으로 높은 분자량의 단백질들을 유의성 있게 많이 감소시켰다.
- 22, 724와 10, 520 펩타이드에 해당하는 것으로 나타났다. 이 분석은 SEQUESTM을 이용하였으며, 이때 Xcorr의 cutoff치는 2.0이상이었다. RAT와 RAC로부터 얻어진 펩타이드는 결핵 유전체로부터 발현이 예상되는 3, 999 단백질 (http://genolist.
성능/효과
- 한편, 동정된 펩타이드들 중 heat shock protein (GroES, GroEL2, HspX, DnaK)에 해당되는 펩타이드들이 56%를 차지하였고, 피피디는 기존에 알려진 결핵균 T 세포항원의 91%를 포함하고 있었다. ICAT을 통하여 각각의 단백질체를 분석한 결과, PPD-S와 PPD-RT23 및 한국결핵연구원 PPD의 단백질체는 서로 유사한 양상을 보였으나, 각 피피디 고유의 특이 펩타이드들도 관찰할 수 있었다. 앞으로 피 피디 단백질체의 질적 및 양적 분석은 결핵 진단의 진단효율 향상과 표준화에 있어 중요한 역할을 할 것으로 기대된다.
- bovis에는 존재하나, 모든 약독화 Af bovis BCG에는 소실되었음이 알려져 있다. M. bovis BCG의 단백질체와 비교했을 때 PPD는 25개의 유일한 단백질을 가지고 있음이 확인되었다. 이는 M bovis BCG의 단백질체와 소실된 RD 부위와의 비교를 통하여 알 수 있었는데, CFP10, ESAT6, MPT64, Rv2346c, Rv3620c, Aid, FabG4, FadA2, FbpB, FixA, GroES, HemL, HspX, NusG, Tuf, Rvl 198, Rv0020c, Rv3046c, Rv3881c, CFP21, Rv3400, LeuA, PyrH, Rv2557, NadC 등이었다.
- 3)에 해당하였다. PPD-S2와 PPD-RT23를 비교했을 때, PPD-RT23와 S2의 평균 H to L ratio는 1.1 이었으나, PPD-RT23에서 분석된 펩타이드중 19%가 정상범위 바깥에 위치했으며, PPD-S2 펩타이드에 비해 11개의 펩타이드가 상대적으로 낮은 수준으로 나타났고, 10개의 펩타이드가 상대적으로 높은 수준으로 나타났다. PPD-S2와 비교하여 PPD-KIT 펩타이드중 17% (17 개)가 정상범위를 벗어났는데, 이들 중 16개 펩타이드가 overexpression되었다.
- 1 이었으나, PPD-RT23에서 분석된 펩타이드중 19%가 정상범위 바깥에 위치했으며, PPD-S2 펩타이드에 비해 11개의 펩타이드가 상대적으로 낮은 수준으로 나타났고, 10개의 펩타이드가 상대적으로 높은 수준으로 나타났다. PPD-S2와 비교하여 PPD-KIT 펩타이드중 17% (17 개)가 정상범위를 벗어났는데, 이들 중 16개 펩타이드가 overexpression되었다.
- 따라서, PPD내에 HSP가 많이 동정된 다른 한 원인은 PPD 단백질들이 PPD 제조중 고온처리과정에서 세포질 내와 세포벽에 있던 단백질들이 배양액으로 배출되는 것이 원인일 수 있다. PPD내에 많은 부분을 차지하는 것으로 동정된 4 가지 주요 HSP는 다른 마이코박테리아와 그 유사성을 살펴보았을 때, M. paratuberculosis^ 94% 이상이며, 다른 마이코박테리아와도 상당한 유사성을 보여 이들 마이코박테리아와면역학적인 교차반응을 일으킬 가능성이 많은 것으로 밝혀졌다. 그러므로, 각각의 HSP는 튜버클린 피내반응을 통하여 그 교차반응성이 평가되어져야 하며, 앞으로 피내반응 진단액을 이용한 결핵의 생체내 진단을 개선시키는 데 이러한 생물학 정보들이 핵심적인 역할을 할 수 있을 것으로 사료된다.
- 이것들은 많은 lots의 PPD를 합쳐서 만들었는데, 그 이유는 제조 lot 별로 분자량 차이에 의한 생물학적 역가의 차이를 극복하기위한 것이다. PPD를 BCA 단백질 검사법 (Pierce)으로 측정한 결과, 약 86%가 단백질로 구성되어있었는데, SDS-PAGE에 의해 나타난 단백질 양상은 명확하고 잘 분리되지 않았다. 이는 PPD 제조과정에서 고온처리에 의한 결핵단백질의 변성과 화학성분에 의한 단백질침전 때문이다.
- 그 파라미터들은 상호관계 (cross correlation; Xcorr)값, ACn, 예비적 SpRank, 트립틱 말단의 수 등이다. PeptideProphetTM를 통하여 SEQUESI^m로 동정된 각각 RAT와 RAC 유래 22, 724와 10, 520 펩타이드들로부터 의양성 펩타이드들을 제거하여 진양성인 4, 541과 1, 643 펩타이드를 얻었다. 이렇게 진양성으로 동정된 펩타이드들에 대해 ProteinPropheFM은 해당되는 단백질을 동정하였다.
- 이 프로그램은 대량 자료들의 필터링을 통하여 다른 상황의 결과들을 예상하는 민감성(sensitivity)과 의양성 오동정율(error rate)을 비교하는 방법을 제공한다. PeptideProphet™-^ SEQUEST^결과로부터 얻은 많은 의양성 결과를 제거할 수 있는 데, 이를 이용하면 MS 스펙트럼의 수동적 판단 방법과 달리 객관적으로 단백질체를 분석할 수 있다는 큰 장점을 가지고 있다. 이 소프트웨어로 각각의 MS 스펙트럼은 고유의 p값을 가지는데, p값은 여러 파라미터로 계산된다.
- RAT는 260개, RAC는 213개의 단백질들을 동정하였다. RAT와 RAC 결과를 비교했을 때, RAT와 RAC로부터 동정된 총 388개의 단백질들 중 22%가 두 단백질분해효소로부터 공통으로 동정되었다 트립신 처리한 PPD로부터 얻어진 것과 다른 142개의 단백질들이 키모트립신 처리한 PPD로부터 동정되었다. 이렇게 단백질분해효소에 따라 동정되는 단백질에 차이를 보이는 것은 트립신과 키모트립신의 특이절단부위 아미노산 차이에 기인하는 것으로 사료된다.
- RAT와 RAC로부터 2차원 액체크로마토그래피 펩타이드 분획은 LC-MS/MS분석으로 각각 22, 724와 10, 520 펩타이드에 해당하는 것으로 나타났다. 이 분석은 SEQUESTM을 이용하였으며, 이때 Xcorr의 cutoff치는 2.
- 다른 HSP들, 예를 들면, ClpB, GrpE, HtpG 등도 본 연구의 PPD 단백질체 분석에서 동정되었다. RAT와 RAC에서 동정된 펩타이드 중 공통적으로 다수의 펩타이드는 4가지의 주요 HSP들 (GroES, GroEL2, HspX, DnaK), Tuf, AcpM, CFP10, ModD, TrxC, SahH, MPT63 등이었으며, 이들 11 개의 펩타이드들은 동정된 펩타이드들 중 RAT에서는 70%, RAC에서는 62%를 차지하였다. CFP(culture filtrate protein)의 단백질체는 PPD만큼 많은 HSP는 관찰되지 않는 등, PPD 단백질체와 차이를 보이는데, 이러한 결과는 PPD가 제조과정에서 고온처리에 의한 생리적 상태의 변화에 기인하는 것으로 사료된다.
- 결핵균의 유전체에 기초하면, 단백질의 81%는 ICAT 기법을 적용하는 데 필수적인 아미노산인 cysteine을 적어도 하나는 가지고 있음을 알 수 있다. 다만, 본 연구에서 4개의 주요 HSP들 (GroES, GroEL2, HspX, DnaK)이 동정되었는데, 이들 4개의 주요 HSP들은 cysteine을 가지고 있지 않아 ICAT 기법으로는 정량 분석할 수 없었다. Statens Serum Institute] PPD-RT23와 한국 결핵연구원의 PPD-KIT를 PPD-S2와 비교하였다.
- 동정되었다. 더욱이, RAT로부터 57%, RAC로부터 45%의 펩타이드들은 GroES, GroEL2, HspX, DnaK에 해당하는 펩타이드인 것으로 나타났다. 질량분석기의 다양한 이온화 효율과 각각의 단백질분해효소 고유의 특이 절단 아미노산 차이 때문에, 통계학적 분석이나 정량분석자료가 없는 단백질체 분석결과로는 동정된 단백질의 그 양적인 풍부함을 항상 논할 수 있는 것은 아니다.
- 질량분석기의 다양한 이온화 효율과 각각의 단백질분해효소 고유의 특이 절단 아미노산 차이 때문에, 통계학적 분석이나 정량분석자료가 없는 단백질체 분석결과로는 동정된 단백질의 그 양적인 풍부함을 항상 논할 수 있는 것은 아니다. 두가지 단백질 분해효소를 사용한 본 연구에서는 RAT와 RAC 결과를 분석했을 때, GroES, GroEL2, HspX, DnaK 등에 해당하는 펩타이드들이 우세함을 보여 PPD 내의 HSP의 양적인 우세함을 확인할 수 있었다. 한편 이들 HSP는 각각의 단클론항체를 이용한 Western blotting으로 확인할 수 있었으나, PPD 생산 시 그 처리과정에서 많은 양이 degradation되었음을 확인하였다.
- 1999). 본 연구는 PPD가 결핵을 진단하는 특이한 항원만으로 정확하게 조화를 이루고 있지 않다는 것을 보여주었으며, 그것의 역가는 결론적으로 생물학적으로 평가되어져야 하지만, PPD의 제조는 단백질체 분석 기법에 의해 분석되고 표준화될 수 있음을 보여주었다. 이를 통하여 결핵 피내진단의 일관된 결과를 위해 PPD 사용 전에 이와 같은 단백질체 분석기법을 적용할 수 있을 것으로 사료되며, 본 연구에서 밝혀진 특이 항원은 새로운 피내진단항원으로 적용될 수 있을 것으로 사료된다.
- 그 항원들 중에서 가치 있는 항원들은 마이코박테리아의 각기 다른 종에 특이적일 수 있다. 본 연구에서 PPD는 결핵균의 이미 알려진 35개의 T 세포 항원 중 32개를 가지고 있음이 확인되었다. 따라서, 상당한 특이성을 가진 PPD 항원을 얻기 위한 연구가 결핵의 피내진단 항원의 개선을 위하여 지속되어야 할 것으로 사료된다.
- 이를 통하여 중요성을 가진 어떤 자료가 희생되지 않으며 오동정율(error rate) 과민감성(sensitivity)이 결정된다. 우리가 단백질 자료를 제한시켜서 오로지 가장 신뢰할 만한 동정 (p = 0.95) 목록을 얻었을 때, 오동정율이 RAT의 경우 0.8%, RAC의 경우 0.7% 이었다. 그러나, RAT는 86%, RAC는 61%의 상대적으로 낮은 동정율을 이끌어 낼 수 있었다.
- 2로 하여 단백질 동정결과를 필터하였다. 이로 인하여 상대적으로 실제 100% 정확한 일치를 이끌어내는 대신에 RAT는 7.2%, RAC 는 27%의 높은 의양성율을 보였다.
- 그러나, PPD중 가장 많은 수의 단백질들은 intermediary metabolism과 호흡에 관여하는 단백질들이었다. 중간대사와 호흡 그리고, 세포벽과 세포 변화와 관련 있는 단백질들이 과도하게 표현되어졌음을 알 수 있었다.
- 전기영동 대신에 사용되었다. 질량분석기에 의한 동정에 공시할 PPD의 환원, 알킬화, 트립신분해 및 키모트립신분해 처리는 상대적으로 높은 분자량의 단백질들을 유의성 있게 많이 감소시켰다. 그러나, 트립신 분해 후 분명하게 분해되지 않은 산물들이 25 kDa이하에서 관찰되었고, 키모트.
- 두가지 단백질 분해효소를 사용한 본 연구에서는 RAT와 RAC 결과를 분석했을 때, GroES, GroEL2, HspX, DnaK 등에 해당하는 펩타이드들이 우세함을 보여 PPD 내의 HSP의 양적인 우세함을 확인할 수 있었다. 한편 이들 HSP는 각각의 단클론항체를 이용한 Western blotting으로 확인할 수 있었으나, PPD 생산 시 그 처리과정에서 많은 양이 degradation되었음을 확인하였다. 덧붙여, GroELl은 RAC 에 의한 분석보다 RAT에 의한 분석에서 낮게 동정되었으며, 이는 GroELl 의 키모트립신 특이 절단부위 아미노산수가 트립신의 특이절단부위 아미노산수보다 더 낮았기 때문인것으로 사료된다.
- 피피디의 단백질체는 402개의 단백질로 구성되었으며, 중간대사와 호흡과 관련된 단백질들이 35%를 차지하였다. 한편, 동정된 펩타이드들 중 heat shock protein (GroES, GroEL2, HspX, DnaK)에 해당되는 펩타이드들이 56%를 차지하였고, 피피디는 기존에 알려진 결핵균 T 세포항원의 91%를 포함하고 있었다. ICAT을 통하여 각각의 단백질체를 분석한 결과, PPD-S와 PPD-RT23 및 한국결핵연구원 PPD의 단백질체는 서로 유사한 양상을 보였으나, 각 피피디 고유의 특이 펩타이드들도 관찰할 수 있었다.
후속연구
- paratuberculosis^ 94% 이상이며, 다른 마이코박테리아와도 상당한 유사성을 보여 이들 마이코박테리아와면역학적인 교차반응을 일으킬 가능성이 많은 것으로 밝혀졌다. 그러므로, 각각의 HSP는 튜버클린 피내반응을 통하여 그 교차반응성이 평가되어져야 하며, 앞으로 피내반응 진단액을 이용한 결핵의 생체내 진단을 개선시키는 데 이러한 생물학 정보들이 핵심적인 역할을 할 수 있을 것으로 사료된다.
- 본 연구에서 PPD는 결핵균의 이미 알려진 35개의 T 세포 항원 중 32개를 가지고 있음이 확인되었다. 따라서, 상당한 특이성을 가진 PPD 항원을 얻기 위한 연구가 결핵의 피내진단 항원의 개선을 위하여 지속되어야 할 것으로 사료된다.
- 왜냐하면, 결핵 피 내 진단액에 대한 면역반응이 마이코박테리아와 교차반응하기 때문이다. 따라서, 특이한 T 세포 항원을 이용한 더욱 개선된 결핵 피내진단액이 개발되어야 할 것으로 사료된다. PPD 는 몇몇의 공통적이고 특이적인 항원의 혼합물이다.
- ICAT을 통하여 각각의 단백질체를 분석한 결과, PPD-S와 PPD-RT23 및 한국결핵연구원 PPD의 단백질체는 서로 유사한 양상을 보였으나, 각 피피디 고유의 특이 펩타이드들도 관찰할 수 있었다. 앞으로 피 피디 단백질체의 질적 및 양적 분석은 결핵 진단의 진단효율 향상과 표준화에 있어 중요한 역할을 할 것으로 기대된다.
- 그러나, PPD에서 conserved proteins 은 표준화된 결핵균 단백질체와 비교했을 때 상대적으로 낮게 나타났다. 이러한 단백질 발현양상은 conserved hypothetical proteins의 기능에 관한 더욱 자세한 정보를 얻을 수 있을 것으로 사료된다.
- 본 연구는 PPD가 결핵을 진단하는 특이한 항원만으로 정확하게 조화를 이루고 있지 않다는 것을 보여주었으며, 그것의 역가는 결론적으로 생물학적으로 평가되어져야 하지만, PPD의 제조는 단백질체 분석 기법에 의해 분석되고 표준화될 수 있음을 보여주었다. 이를 통하여 결핵 피내진단의 일관된 결과를 위해 PPD 사용 전에 이와 같은 단백질체 분석기법을 적용할 수 있을 것으로 사료되며, 본 연구에서 밝혀진 특이 항원은 새로운 피내진단항원으로 적용될 수 있을 것으로 사료된다.
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