[논문]PCR-RFLP 분석기법을 이용한 가금육의 종(닭, 칠면조, 오리) 판별 기술 개발

신성철; 최은주; 이준제; 김희선; 조하나; 전상희; 정구용; 정의룡

문제 정의

그동안 국내에서 RAPD 기법을 이용한 축종 감별 기술이 보고된 바 있으나 정확성 및 재현성이 낮아 실질적으로 활용하는 데는 한계가 있다. 본 연구는 PCR-RFLP의 유전자 분석기술을 이용하여 가금육의 식육자원으로 가장 널리 사용되고 있는 닭, 오리 및 칠면조 3종의 조류 고기의 육종감별 기술을 개발 이를 산업적으로 실용화하고자 수행하였다.
본 연구는 cytochrome B 유전자의 PCR-RFLP 분석기법을 이용하여 다양한 가금류 식육 자원 및 각종 가공 육제품의 원료육에 대한 정확하고 재현성 높은 축종 및 육종 감별기술을 개발하기 위하여 수행되었다. 국내에서 유통되고 있는 종간 근연관계가 높은 3종의 가금육(닭, 칠면조 및 오리)의 육류에서 분리한 DNA 시료를 대상으로 cytochrome B 유전자의 특정 염기서열을 포함하는 primer를 설계 제작하여 PCR-RFLP 분석을 실시하였다.

제안 방법

제한효소는 Table 1과 같다. PCR 반응액 조성은 genomic DNA 50ng, forward primer 및 reverse primer 각 O.lpM, dNTP 각 250pM, 10 X PCR buffer 2㎕ 그리고 Taq DNA polymerase 1 uit을 첨가하여 최종 부피를 20㎕로 조정하였다. PCR 증폭은 처음 94 ℃ 에서 1분간 예비가열 한 후, 94℃에서 20초, 55C에서 10초 그리고 720에서 40초간의 회전을 총 30회 반복한 다음 마지막으로 72℃에서 2분간 가열하고 PCR 반응을 종료하였다.
PCR 증폭은 처음 94 ℃ 에서 1분간 예비가열 한 후, 94℃에서 20초, 55C에서 10초 그리고 720에서 40초간의 회전을 총 30회 반복한 다음 마지막으로 72℃에서 2분간 가열하고 PCR 반응을 종료하였다. PCR 종료 후 각 가금 종별 증폭산물을 Haeffi 및 Hinf I 제한효소로 각각 절단하고, 4% agarose g신 에 전기영동 하여 분리한 후 ethidium bromide 염색을 통해 DNA band를 검출하고, 가금 육종별 DNA의 RFLP 양상을 비교 분석하였다.
위하여 수행되었다. 국내에서 유통되고 있는 종간 근연관계가 높은 3종의 가금육(닭, 칠면조 및 오리)의 육류에서 분리한 DNA 시료를 대상으로 cytochrome B 유전자의 특정 염기서열을 포함하는 primer를 설계 제작하여 PCR-RFLP 분석을 실시하였다. 각 축종의 근육조직으로부터 genomic DNA를 추출하고 PCR 증폭 반응을 수행한 후 얻어진 PCR 증폭산물(359 bp)을 두 종류의 제한효소(HaeHI 및 Hinf I)로 각각 절단한 결과 특히, HaeⅢ제한효소에서 가금류의 축종 간 그리고 제한효소 간에 명확한 차이를 보이는 종 특이적인 PCR-RFLP marker를 검출하였다.
본 연구는 국내에서 유통되고 있는 3종의 가금육(닭, 오리 및 칠면조)의 조류 육을 대상으로 축종 특이적인 PCR-RFLP marker 분석을 위해 cytochrome B 유전자의 특정 염기서열을 포함하는 primer를 이용하여 증폭한 후 PCR 증폭산물의 전기영동 결과를 Figure 1에 제시하였다. 가금류 3종의 육류시료 모두에서 예상한 대로 359 bp 크기의 DNA 단편이 검출되어 cytochrome B 유전자의 PCR 증폭이 성공적으로 이루어 졌음을 알 수 있었다.

대상 데이터

각각 10개체씩 구입하여 사용하였다. 각 공시재료의 근육조직(약 10g)으로부터 genomic DNA을 분리 정제하고 TE buffer(10mM Tris-HCl pH 0, 4, ImM EDTA)에 용해하여 DNA 시료로 사용하였다.
본 연구에 사용한 공시재료는 시중에 유통 판매되고 있는 가금육으로 닭고기, 칠면조육 및 오리고기를 각각 10개체씩 구입하여 사용하였다. 각 공시재료의 근육조직(약 10g)으로부터 genomic DNA을 분리 정제하고 TE buffer(10mM Tris-HCl pH 0, 4, ImM EDTA)에 용해하여 DNA 시료로 사용하였다.

성능/효과

3종류의 가금육 죽종(닭, 칠면조 및 오리)을 대상으로 cytochrome B 유전자의 특정 염기서열 영역을 PCR로 증폭하고 특정 제한효소(HaelU 및 Hinf I)로 각각 절단한 결과, HinfⅠ 제한효소의 경우 닭고기는 칠면조 및 오리육과 확실한 차이를 보였으나 칠면조육과 오리육 간에는 거의 유사한 크기를 갖는 banding pattern을 보여 두 종간의 구별에 어려움이 있었다. 그러나, HaeEI 제한효소에서는 3종의 가금육 축종간의 DNA banding pattern에 명확한 차이를 보이는 종 특이적인 PCR-RFLP marker^} 확인되어 가금육간의 축종판별이 가능하였다.
가금류 3종의 육류시료 모두에서 예상한 대로 359 bp 크기의 DNA 단편이 검출되어 cytochrome B 유전자의 PCR 증폭이 성공적으로 이루어 졌음을 알 수 있었다. 그리고 각 PCR 증폭산물을 두 종류의 제한효소(HaeII 및 Hinf I )로 각각 절단하고 4% agarose gei을 이용하여 전기영동한 후 각 제한효소 인지부위의 수 및 절단 위치에 따라 검출된 PCR-RFLP 전기영동상은 Figure 2와 같다.
국내에서 유통되고 있는 종간 근연관계가 높은 3종의 가금육(닭, 칠면조 및 오리)의 육류에서 분리한 DNA 시료를 대상으로 cytochrome B 유전자의 특정 염기서열을 포함하는 primer를 설계 제작하여 PCR-RFLP 분석을 실시하였다. 각 축종의 근육조직으로부터 genomic DNA를 추출하고 PCR 증폭 반응을 수행한 후 얻어진 PCR 증폭산물(359 bp)을 두 종류의 제한효소(HaeHI 및 Hinf I)로 각각 절단한 결과 특히, HaeⅢ제한효소에서 가금류의 축종 간 그리고 제한효소 간에 명확한 차이를 보이는 종 특이적인 PCR-RFLP marker를 검출하였다. 따라서, 본 연구에서 개발한 cytochrome B 유전자의 가금류 종 특이적 PCR-RFLP marker는 가금류의 식육 및 가공 육제품의 육종 및 축종 판별에 매우 유용한 DNA marker로 이용될 수 있을 것이다.
그러나, HaeEI 제한효소에서는 3종의 가금육 축종간의 DNA banding pattern에 명확한 차이를 보이는 종 특이적인 PCR-RFLP marker^} 확인되어 가금육간의 축종판별이 가능하였다. 따라서, cytochrome B 유전자의 종간 염기서열 보존성이 높은 DNA 영역을 PCR로 증폭한 다음 HaeHI 또는 Hinf I 제한효소를 이용하여 검출되는 RFLP 양상은 가금육 및 가금육을 이용한 가공 육제품 원료육의 축종 및 육종 감별에 유용한 DNA 표지인자로 활용할 수 있다.
그러나, HaeEI 제한효소에서는 3종의 가금육 축종간의 DNA banding pattern에 명확한 차이를 보이는 종 특이적인 PCR-RFLP marker^} 확인되어 가금육간의 축종판별이 가능하였다. 따라서, cytochrome B 유전자의 종간 염기서열 보존성이 높은 DNA 영역을 PCR로 증폭한 다음 HaeHI 또는 Hinf I 제한효소를 이용하여 검출되는 RFLP 양상은 가금육 및 가금육을 이용한 가공 육제품 원료육의 축종 및 육종 감별에 유용한 DNA 표지인자로 활용할 수 있다.

후속연구

각 축종의 근육조직으로부터 genomic DNA를 추출하고 PCR 증폭 반응을 수행한 후 얻어진 PCR 증폭산물(359 bp)을 두 종류의 제한효소(HaeHI 및 Hinf I)로 각각 절단한 결과 특히, HaeⅢ제한효소에서 가금류의 축종 간 그리고 제한효소 간에 명확한 차이를 보이는 종 특이적인 PCR-RFLP marker를 검출하였다. 따라서, 본 연구에서 개발한 cytochrome B 유전자의 가금류 종 특이적 PCR-RFLP marker는 가금류의 식육 및 가공 육제품의 육종 및 축종 판별에 매우 유용한 DNA marker로 이용될 수 있을 것이다.
이상의 연구결과를 종합해 볼 때 cytochrome B 유전자의 축종 간 염기서열 변이를 이용하는 PCR-RFLP marker 분석 기법은 생리적 및 생물학적 기능이 잘 알려진 특정 주 유전자를 대상으로 제한효소 인지부위 차이에 따른 축종감별 기술로서 random primer를 이용하는 RAPD 또는 SCAR 방법에 비하여 보다 정확하고 안정적이며 재현성이 보장된 분석 결과를 얻을 수 있어 DNA marker를 이용한 새로운 가금류 식육자원의 육종 및 축종감별기술로 실용화가 가능할 것으로 기대된다.

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