[논문]Differential display RT-PCR 기법을 이용한 돼지 등심조직의 품종 간 발현차이 유전자의 연구

김남국; 조중호; 임종현; 방경정; 송민진; 박범영; 김언현; 이창수

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김남국 (건국대학교 생명과학부 응용생화학) , 조중호 (건국대학교 생명과학부 응용생화학) , 임종현 (건국대학교 생명과학부 응용생화학) , 방경정 (건국대학교 생명과학부 응용생화학) , 송민진 (건국대학교 생명과학부 응용생화학) , 박범영 (축산기술연구소) , 김언현 (건국대학교 축산학과) , 이창수 (건국대학교 생명과학부 응용생화학)

본 연구는 성장 속도 및 서로 다른 육질 특성을 지닌 돼지 품종을 이용하여, 육질 및 성장에 관련된 유전자원을 확보하고, 이를 이용한 유전 육종의 기초 자료를 제공하기 위하여 수행하였다. Differential display (DD) RT-PCR 기법을 통해 돼지 품종 간 발현 차이를 보이는 유전자인 NADH dehydrogenase 1과 ATPase 6를 동정하였다. 동정된 유전자의 발현량 분석을 위한 RT-PCR 결과, 각 유전자의 발현량이 재래돼지에서 외래 품종 (랜드레이 스 및 요크셔)에 비해 2배 이상 높음을 확인 할 수 있었다 (p<0.01). 이러한 발현차이 유전자를 이용하여 육질과의 관련성 연구 및 유전자의 기능에 대한 연구가 지속되어야 할 것이다.

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문제 정의

본 연구는 성장 속도 및 서로 다른 육질 특성을 지닌 돼지 품종을 이용하여, 육질 및 성장에 관련된 유전자원을 확보하고, 이를 이용한 유전 육종의 기초 자료를 제공하기 위하여 수행하였다. Differential display (DD) RT-PCR 기법을 통해 돼지 품종 간 발현 차이를 보이는 유전자인 NADH dehydrogenase 1과 ATPase 6를 동정하였다.
이러한 분석기법을 활용한 다양한 유전자원의 확보는 돼지 육종개량을 위한 중요한 의미를 지니며, 재래돼지의 유전적 특성 및 육질관련 유전자 확보에 다양한 자료를 제공할 수 있다. 본 연구에서는 다양한 육질 특성을 지닌 돼지 품종을 이용하여 발현차이 유전자를 동정하고 이를 이용한 육질관련 유전자 marker를 확보하기 위하여 수행되었다.

가설 설정

f Canada). B) Nucleotide sequence of the differentiallyexpressed gene.

제안 방법

Differential display (DD) RT-PCR 기법을 통해 돼지 품종 간 발현 차이를 보이는 유전자인 NADH dehydrogenase 1과 ATPase 6를 동정하였다. 동정된 유전자의 발현량 분석을 위한 RT-PCR 결과, 각 유전자의 발현량이 재래돼지에서 외래 품종 (랜드레이스 및 요크셔)에 비해 2배 이상 높음을 확인할 수 있었다 (p<0.
추출돤 RNA 1μg을 이용하여 cDNA 합성에 이용하였다. GeneFishing DEG kits (Seegene, USN)의 서로 다른 40개의 ACP (annealing control primer)를 이용하여 발현차이 유전자 탐색에 이용하였다. 반응된 PCR product는 agarose상에서 확인하였고, 유전자 발현의 차이를 보이는 유전자 단편을 agarose상에서 회수하여 재 증폭한 후 cloning 기법을 통해 유전자 염기서열을 결정하였다.
TRIzol reagent를 이용하여 추출된 total RNA lμg을 이용하여 cDNA를 합성하고, 이를 PCR 반응의 주형으로 이용하였다. 각 유전자의 발현량 비교를 위해 GenBank에 보고 된 유전자 염기서열을 기초로 하여 primer를 제작하고 (Table.
TRIzol reagent를 이용하여 추출된 total RNA lμg을 이용하여 cDNA를 합성하고, 이를 PCR 반응의 주형으로 이용하였다. 각 유전자의 발현량 비교를 위해 GenBank에 보고 된 유전자 염기서열을 기초로 하여 primer를 제작하고 (Table. 1), 94P에서 1분, 600에서 40초, 72℃에서 40초 조건으로 21회 반응시켜 PCR 산물을 확인하였다. PCR 산물은 Kodak ID software를 이용 정량하고, Studient -t test를 통해 품종 간 통계적 유의성을 검증하였다.
GeneFishing DEG kits (Seegene, USN)의 서로 다른 40개의 ACP (annealing control primer)를 이용하여 발현차이 유전자 탐색에 이용하였다. 반응된 PCR product는 agarose상에서 확인하였고, 유전자 발현의 차이를 보이는 유전자 단편을 agarose상에서 회수하여 재 증폭한 후 cloning 기법을 통해 유전자 염기서열을 결정하였다.
발현의 차이가 관찰된 유전자의 발현량 분석을 위해 RT-PCR을 수행하였다. TRIzol reagent를 이용하여 추출된 total RNA lμg을 이용하여 cDNA를 합성하고, 이를 PCR 반응의 주형으로 이용하였다.
차이를 관찰할 수 있었다. 발현차이 유전자는 cloning기법을 통해 염기서열을 결정하고, BLAST program을 이용하여 상동성 검사를 실시하였다. 상동성 검색 결과 NADH dehydrogenase 1과 ATPase 6 유전자와 각각 99%의 상동성을 보였다 (Figure.
품종 간 서로 다르게 발현되는 유전자 (DEGs; differential expressed genes)를 탐색하기 위하여 TRIzol reagent (Invitrogene Life Technologies, USA)을 이용하여 totai RNA를 분리하고⁽⁴⁾, 추출돤 RNA 1μg을 이용하여 cDNA 합성에 이용하였다. GeneFishing DEG kits (Seegene, USN)의 서로 다른 40개의 ACP (annealing control primer)를 이용하여 발현차이 유전자 탐색에 이용하였다.
두 유전자 모두 mitochondria 유전자로서 전자전달계와 관련되어 에너지 합성에 관련된 유전자로 잘 알려져 있다^⑸. 확인된 2개의 유전자는 RT-PCR을 통해 품종 간 발현량 차이를 분석하였다. RT-PCR 결과 재래돼지에서 다름 외래 품종에 비해 모두 2배 이상 높은 발현을 보임을 확인하였다 (p<0.

대상 데이터

발현차이 유전자 동정을 위해 평균 200일령 재래돼지, 랜드레이스 및 요크셔 품종 각 10두를 사용하였다. 시료는 도축 후 30분 이내에 등심 (longissimus dorsi)을 취하여 채취 즉시 액체질소로 냉각하였고, 결체조직과 지방조직을 제거 후 분쇄하고, 실험 전까지 -80℃에 보관하여 사용하였다.

데이터처리

1), 94P에서 1분, 600에서 40초, 72℃에서 40초 조건으로 21회 반응시켜 PCR 산물을 확인하였다. PCR 산물은 Kodak ID software를 이용 정량하고, Studient -t test를 통해 품종 간 통계적 유의성을 검증하였다.

성능/효과

확인된 2개의 유전자는 RT-PCR을 통해 품종 간 발현량 차이를 분석하였다. RT-PCR 결과 재래돼지에서 다름 외래 품종에 비해 모두 2배 이상 높은 발현을 보임을 확인하였다 (p<0.01)(Figure. 2). 기존 연구에 있어 재래돼지를 포함한 돼지 품종에 대한 국내의 연구는 대부분 돈육의 이화학적 특성 분석에 초점을 두고 있었으며, 유전자원에 대한 연구는 아직 미흡한 실정에 있다.
Differential display (DD) RT-PCR 기법을 통해 돼지 품종 간 발현 차이를 보이는 유전자인 NADH dehydrogenase 1과 ATPase 6를 동정하였다. 동정된 유전자의 발현량 분석을 위한 RT-PCR 결과, 각 유전자의 발현량이 재래돼지에서 외래 품종 (랜드레이스 및 요크셔)에 비해 2배 이상 높음을 확인할 수 있었다 (p<0.01). 이러한 발현차이 유전자를 이용하여 육질과의 관련성 연구 및 유전자의 기능에 대한 연구가 지속되어야 할 것이다.
발현차이 유전자는 cloning기법을 통해 염기서열을 결정하고, BLAST program을 이용하여 상동성 검사를 실시하였다. 상동성 검색 결과 NADH dehydrogenase 1과 ATPase 6 유전자와 각각 99%의 상동성을 보였다 (Figure. 1). 두 유전자 모두 mitochondria 유전자로서 전자전달계와 관련되어 에너지 합성에 관련된 유전자로 잘 알려져 있다^⑸.

후속연구

기존 연구에 있어 재래돼지를 포함한 돼지 품종에 대한 국내의 연구는 대부분 돈육의 이화학적 특성 분석에 초점을 두고 있었으며, 유전자원에 대한 연구는 아직 미흡한 실정에 있다. 본 연구를 통해 확인된 에너지 대사관련 유전자의 연구를 통해 재래돼지의 유전적 특성 및 기능에 대한 충분한 연구가 진행되어야 할 것이며, 현재 육질과의 관련성 분석을 수행 중에 있다.
01). 이러한 발현차이 유전자를 이용하여 육질과의 관련성 연구 및 유전자의 기능에 대한 연구가 지속되어야 할 것이다.

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