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문제 정의
- polykrikoides에 대한 적조를 구제하는 방법의 일환으로 살조미생물인 Brachybacterium sp. SY-97을 분리하여 특성을 파악하고 C. polykrikoides에 대한 살조활성을 조사함으로써 살조미생물을 이용한 적조구제 방법의 기초 연구 자료를 마련하고자 하였다.
제안 방법
- 또한 보다 정확한 동정을 위하여 16S rRNA gene을 이용한 sequencing행하였다. 16S rDNA 분석을 통하여 염기서열을 결정한 후, National Center for Biotechnology Information(NCBI)의 GenBank 데이터베이스에서 가장 상동성이 높은 균주와 염기서열을 비교하였으며, MEGA 2.1 package를 이용하여 계통도를 그렸다.
- polykrikoides 배양액(L2xl04 cells/mg) 1 ng를 넣고, Cell Culture Insert 외부에는 f/2-Si 배지 1 i戒를 넣었다. PPES-n 액체배지에서 배양한 SY-97의 균체(1。4 cells)를 멸균해수로 희석하여 C이1 Culture Insert 외부에 1 ng를 넣은 것을 test w이1로 하였다. 또한 Cell Culture Insert 내부에 SY-97 균주의 균체를 첨가한 well을 positive control 하였으며, Cell Culture Insert 내부에 SY-97 균주의 균체를 첨가하는 대신에 PPES-II 액체배지만을 첨가하여 배양한 well을 negative control로 하였다.
- Brachybacterium sp. SY-97의 배양여 과액 첨가 농도(1, 5, 10, 15%)에 따른 C. polykrikoides의 살조활성을 조사하였다. Brachybacterium sp.
- poiykrikoides에 살조미생물 Brachybacterium sp. SY-97의 배양여과액만을 C. pol~ 에 접종시켰을 때 살조되는 과정을 광학현미경으로 관찰하였다. C.
- PPES-n 액체배지에서 배양한 SY-97의 균체(1。4 cells)를 멸균해수로 희석하여 C이1 Culture Insert 외부에 1 ng를 넣은 것을 test w이1로 하였다. 또한 Cell Culture Insert 내부에 SY-97 균주의 균체를 첨가한 well을 positive control 하였으며, Cell Culture Insert 내부에 SY-97 균주의 균체를 첨가하는 대신에 PPES-II 액체배지만을 첨가하여 배양한 well을 negative control로 하였다. 모든 welle C.
- 유사성을 검토하였다. 또한 보다 정확한 동정을 위하여 16S rRNA gene을 이용한 sequencing행하였다. 16S rDNA 분석을 통하여 염기서열을 결정한 후, National Center for Biotechnology Information(NCBI)의 GenBank 데이터베이스에서 가장 상동성이 높은 균주와 염기서열을 비교하였으며, MEGA 2.
- 또한 Cell Culture Insert 내부에 SY-97 균주의 균체를 첨가한 well을 positive control 하였으며, Cell Culture Insert 내부에 SY-97 균주의 균체를 첨가하는 대신에 PPES-II 액체배지만을 첨가하여 배양한 well을 negative control로 하였다. 모든 welle C. polykrikoidese 최적 배양조건에서 배양하여 48시간 후에 살조 유무를 관찰하여 살조 유형을 결정하였다. 이때 미생물 오염 여부는 Cell Culture Insert 내부의 배양액을 취해 DAPI(4 ' , 6-diamidino-2-phenylindole) 염색 후 형광현미경(Olympus BX40)하에서 직접 관찰하였다.
- 분리된 살조미생물 SY-97 균주의 분류학적 위치를 검토하기 위하여 MacFaddin과 Gerhardt 등의 방법을 참고하여 형태학적, 생화학적인 특성을 조사하여 1차적으로 분류학적 유사성을 검토하였다. 또한 보다 정확한 동정을 위하여 16S rRNA gene을 이용한 sequencing행하였다.
- polykrikoides는 f/2-Si 배지에서 온도 20℃, 광량 120 광주기 12L12D로 배양하였다. 살조미생물 SY-97 균주의 C. polykrikoides 에 대한 살조 유형을 조사하기 위하여 24 well microplate에 pore size 0.2 ㎛의 Cell Culture Insert(FALCON, USA)를 삽입한 2조배양계를 이용하였다. Cell Culture Insert 내부에 ^2-Si 배지에서 전배양한 C.
- 6) 평판 배지에 평판도말법으로 접종하여 25℃ 에서 7일간 배양한 후 분리된 colony를 선택하여 순수분리 하였다. 이들 분리균주를 PPES-U 액체배지에 접종하여 25℃에서 2일간 교반배양(200 rpm)하여 C. polykrikoides 배양액(L2 X 104 cells/me) 900 以에 분리균주 배양액 100 成를 접종하여 살조활성을 관찰하여 살조미생물을 분리하였다.
- polykrikoidese 최적 배양조건에서 배양하여 48시간 후에 살조 유무를 관찰하여 살조 유형을 결정하였다. 이때 미생물 오염 여부는 Cell Culture Insert 내부의 배양액을 취해 DAPI(4 ' , 6-diamidino-2-phenylindole) 염색 후 형광현미경(Olympus BX40)하에서 직접 관찰하였다.
대상 데이터
- sp. SY-97을 선별하였다. Brachybacterium sp.
- 분리된 100여종의 미생물 중에서 C. polykrikoides와의 혼합배양에서 높은 살조력을 보인 한 균주를 선별하였다. 선별된 SY-97 균주는 생화학적 테스트 결과와 16S rDNA 염 기서 열을 분석하여 NCBI GenBank에 등록된 균주들과 유전자간의 상동성을 조사한 결과, Brachybacterium pamconglomomtum과 99% 이상의 가장 높은 상동성을 나타내었다.
- 해수 샘플링은 2005년 8월 울진 연안의 적조발생해역에서 표증 해수를 Niskin 개량형 채수기인 MB채수기를 이용하여 멸균한 광구병으로 채취하였다. 미생물은 해수 시료를 PPES- II (yeast extract 1 g, proteose peptone 1 g, polypeptone 2 g, soytone 1 g, 0.
성능/효과
- Brachybacterium sp. SY-97 배양여과액을 10, 15% 가 되도록 첨가한 경우 C. polykrikoidese 개체수가 급격히 감소하였으며, 10%의 경우 15시간 후에 모두 살조되었고, 15%의 경우는 12시간 후에 100% 살조되었다. 5%의 경우 18시간 후에 90% 이상 살조 되었다.
- polykrikoides와 Brachybacterium sp. SY-97의 균체를 함께 접종한 positive control well에서는 C. polykrikoidese} 사멸되었지만, 살조미생물 대신에 미생물 배지인 PPES-II 액체배지만을 접종한 negative control well에서는 C. polykrikoides7\ 사멸되지 않았다. Brachybacterium sp.
- 즉, Brachybacterium sp. SY-97의 배양여과액의 양에 비례하여 살조활성이 증가하는 경향을 보였다. 또한 배양액을 넣었을 때와 거의 같은 살조활성을 나타내었다.
- Brachybacterium sp. SY-97의 배양여과액의 첨가 농도별 살조활성을 측정한 결과, 15%의 경우 C. polykrikoidese 개체수는 급격히 감소하여 12시간 후에 100% 살조되었고, 10%의 경우 15시간 후에 모두 살조되 었고, 5%의 경우 18시간 후에 control에 비해 90% 이상 살조 되었다.
- polykrikoides와의 혼합배양에서 높은 살조력을 보인 한 균주를 선별하였다. 선별된 SY-97 균주는 생화학적 테스트 결과와 16S rDNA 염 기서 열을 분석하여 NCBI GenBank에 등록된 균주들과 유전자간의 상동성을 조사한 결과, Brachybacterium pamconglomomtum과 99% 이상의 가장 높은 상동성을 나타내었다. 따라서 이 균주를 Brachybacterium sp.
- 또한 배양액을 넣었을 때와 거의 같은 살조활성을 나타내었다. 이상의 결과를 종합하여 볼 때, Brachybacterium sp. SY-97은 살조물질을 생성하여 세포외로 분비하는 것으로 판단된다.
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