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문제 정의
- 본 연구는 유기 재배된 대두와 일반 재배된 대두를 열수와 유기용매로 추출하여 그 추출물의 염증과 알레르기 관련 효과를 비교하고자 수행하였다.
제안 방법
- DPPH 법과 SOD 효소의 활성 측정으로 항산화 능력을 평가하였으며, 항염증 효과는 LPS로 유도시킨 Raw 264.7 세포주에서 염증 매개 단백질인 Cox-2와 iNOS의 발현량을 western blotting으로 조사하여 분석하였다.
- 그 후에 각각 6시간, 24 시간 동안 37℃ CO2 incubator에서 배양한 후, 세포를 취하여 lysis buffer(1x lysis buffer, 1% SDS)로 세포액을 얻었다. 각 세포액 20 g을 취하여 SDS-PAGE를 수행한 후 Cox-2와 iNOS 등 염증관련 단백질의 항체를 이용하여 western blotting을 수행하였다.
- 1 mg/ml의 농도로 처리하고 약 3시간 반응 후에 세포사멸 유발물질인 H2O2를 1mM 의 농도로 처리하여 세포사멸을 유도하였다. 각각 9시간, 24시간동안 37℃ CO2 incubator에서 배양한 후, 세포를 취하여 trypan blue로 염색하여 살아있는 세포와 죽은 세포를 모두 세어 생존률로 계산하였다.
- 2 ng/ml으로 처리하고 16 시간 후에 Phosphate buffered saline(PBS)로 2회 washing한 후, 세포배양액을 1% BSA가 포함된 EBSS로 교체한다. 그 후 DNP-BSA 150 ng/ml를 30분 동안 처리하여 탈과립화를 유도하고 세포배양액만을 따로 취해 히스타민 유리량을 o-phthalaldehyde(OPT) assay로 측정하였다. 유리된 히스타민과 OPT와 결합으로 형성된 형광은 413 nm에서 측정하였다 (Passante 등 2009).
- 다양한 생리활성 물질을 추출하기 위하여 열수와 유기용매로 분획 추출하였다. 먼저 각 대두 (100 g)를 파쇄하여 둥근 플라스크에 넣고 10배량의 증류수를 가하여 4시간 동안 가열 추출하고 그 여액을 회전 증발농축기로 감압 농축하여 동결 건조 하였다.
- 대식세포 보호 효과는 친환경 유기농과 일반 관행 재배의 대두의 열수, 에탄올, 메탄올 추출물의 3시간 전처리를 한 대식세포에 1 mM H2O2를 처리하여 세포에 세포사멸을 유도하여 세포사멸이 억제되는 정도를 세포수를 측정하여 평가하였다. 그 결과는 유기농 대두의 에탄올과 메탄올 추출물에서 관행 재배보다 향상된 세포사멸 억제 효과가 관찰되었다.
- 대식세포주인 Raw264.7 세포의 생존력을 생존조절 단백질인 Bcl-xl의 발현량을 western blotting으로 조사하여 평가하였다. 그 결과 유기재배 대두의 열수, 에탄올 및 메탄올 추출물 모두에서 Bcl-xl의 발현이 증가하였다.
- 2 ml를 넣고 암실에서 30분간 반응 후, 520 nm에서 흡광도를 측정하였으며, 전자공여 효과는 시료 첨가구와 무 첨가구의 흡광도 차이를 백분율로 나타내었다. 또한 SOD 효소활성은 알칼리 상태에서 xanthine oxidase효소와 연계하여 nitroblue tetrazolium formazan(NBT-formazan)의 형성을 450 nm에서 흡광도를 측정하였다(Fluka사 측정kit).
- 7 세포주에서 염증 매개 단백질인 Cox-2와 iNOS의 발현량을 western blotting으로 조사하여 분석하였다. 또한 대식세포 보호 효과를 세포사멸 조절 단백질인 Bcl-xl의 발현량 조사로 평가하였고, 1 mM H2O2 처리로 유도되는 세포사멸의 보호효과를 세포 수 측정법으로 조사하였다. 항알레르기 효과는 흰쥐의 비만세포인 RBL-2H3 세포주를 사용하여 IgE로 매개되는 비만세포의 탈과립화를 OPT assay로 측정하여 분석하였다.
- 마우스 대식 세포주인 Raw 264.7 세포주에 다양한 용매의 추출물을 0.1 mg/ml의 농도로 Raw 264.7 세포에 3시간 전 처리한 후, 염증 유도물질인 LPS(1 μg/ml)를 처리하여 염증 반응을 유도하였을 때 그 염증 반응이 예방되거나 억제되는 효과를 염증 관련 단백질인 Cox-2와 iNOS의 western blotting법으로 조사하여 측정하였다.
- 분획물의 항산화 능력은 전자 공여능 측정과 Superoxide dismutase(SOD) 효소활성화 정도를 측정하였다. 먼저 1,1-diphenyl-2-picryl hydrazyl(DPPH)에 대한 전자 공여능을 측정하여 환원력으로 계산하였다(Yasusi 등 1999). 각 시료 0.
- 분획물의 항산화 능력은 전자 공여능 측정과 Superoxide dismutase(SOD) 효소활성화 정도를 측정하였다. 먼저 1,1-diphenyl-2-picryl hydrazyl(DPPH)에 대한 전자 공여능을 측정하여 환원력으로 계산하였다(Yasusi 등 1999).
- 유기 재배된 대두 추출물의 항알레르기 기능은 흰쥐의 비만 세포주인 RBL-2H3 세포주의 히스타민 탈과립화를 측정하여 분석하였다. 쥐의 비만 세포주인 RBL-2H3 세포주를 6 well plate에 배양한 후, 다양한 용매의 추출물을 0.
- 유기농 및 일반재배 대두를 다양한 용매에서 추출하여 그 추출물에 대한 항산화 효과, 항염증 효과, 대식세포의 세포사멸 보호 효과, 그리고 알레르기 저해효과를 비교하였다. DPPH 법과 SOD 효소의 활성 측정으로 항산화 능력을 평가하였으며, 항염증 효과는 LPS로 유도시킨 Raw 264.
- 쥐 비만세포인 RBL-2H3 세포주를 사용하여 Anti-DNP-IgE에 의해 유도되는 비만세포의 탈과립화를 통한 세포질 내의 히스타민 유리량을 측정하였다. 1x106 개의 흰쥐 RBL-2H3 세포를 6-well plate에 배양하고 각 대두 추출물을 0.
- 유기 재배된 대두 추출물의 항알레르기 기능은 흰쥐의 비만 세포주인 RBL-2H3 세포주의 히스타민 탈과립화를 측정하여 분석하였다. 쥐의 비만 세포주인 RBL-2H3 세포주를 6 well plate에 배양한 후, 다양한 용매의 추출물을 0.1 mg/ml의 농도로 3시간 전 처리하고 DNP-IgE을 통한 비만세포의 탈과립화를 히스타민의 OPT assay를 통하여 측정하였다. 그 결과 친환경 유기농 대두의 열수, 에탄올, 메탄올 및 일반 관행재배 대두의 열수, 에탄올, 메탄올 추출물 모두에서 IgE로 매개되는 히스타민 분비를 통한 알레르기 반응을 억제하는 효과를 관찰할 수 있었으며, 항산화, 항염증 및 대식세포의 세포 사멸 보호 효과와는 다르게 유기농 대두 추출물의 증강된 효능을 입증하지 못하였다.
- 또한 대식세포 보호 효과를 세포사멸 조절 단백질인 Bcl-xl의 발현량 조사로 평가하였고, 1 mM H2O2 처리로 유도되는 세포사멸의 보호효과를 세포 수 측정법으로 조사하였다. 항알레르기 효과는 흰쥐의 비만세포인 RBL-2H3 세포주를 사용하여 IgE로 매개되는 비만세포의 탈과립화를 OPT assay로 측정하여 분석하였다.
대상 데이터
- 또한 메탄올과 에탄올은 덕산화학제품을 사용하였다. Cox-2, iNOS, Bcl-xl, LC3-II 등의 항체는 Cell Signaling사(USA)의 제품을 구입하여 사용하였다.
- 그리고 본 실험에 사용한 시약으로서 Dinitrophenylated-IgE(DNP-IgE), DNP-BSA, 소혈청알부민(BSA), Sodium citrate buffer(pH 4.5) 등은 Sigma (USA)의 제품을 사용하였으며, Dulbecco Eagle's minimal essential medium(DMEM), Fetal bovine serum(FBS), Earl’s balanced salt solution(EBSS) 등은 Gibco사 (USA)를 사용하였다.
- 대식세포 세포 사멸 보호 효과는 생쥐 면역세포인 Raw264.7 세포를 사용하였다. 위의 항염증 효능 측정 실험 과정에서 획득한 단백질을 세포사멸 조절 단백질인 Bcl-xl의 항체를 이용하여 western blotting을 수행하였다.
- 5) 등은 Sigma (USA)의 제품을 사용하였으며, Dulbecco Eagle's minimal essential medium(DMEM), Fetal bovine serum(FBS), Earl’s balanced salt solution(EBSS) 등은 Gibco사 (USA)를 사용하였다. 또한 메탄올과 에탄올은 덕산화학제품을 사용하였다. Cox-2, iNOS, Bcl-xl, LC3-II 등의 항체는 Cell Signaling사(USA)의 제품을 구입하여 사용하였다.
- 유기농 대두는 “(주)지아이”로부터 구입하였으며, 친환경 유기농 인증을 받은 제품을 사용하였다.
- 항염증 효능 실험을 위하여 생쥐 면역세포인 Raw264.7 세포를 사용하였다. Raw264.
이론/모형
- 위의 항염증 효능 측정 실험 과정에서 획득한 단백질을 세포사멸 조절 단백질인 Bcl-xl의 항체를 이용하여 western blotting을 수행하였다. 또한 1mM H2O2로 유도되는 대식세포의 세포사멸에 각 대두 추출물의 억제 효능을 세포 수 측정법으로 평가하였다. Raw264.
- 7 세포를 사용하였다. 위의 항염증 효능 측정 실험 과정에서 획득한 단백질을 세포사멸 조절 단백질인 Bcl-xl의 항체를 이용하여 western blotting을 수행하였다. 또한 1mM H2O2로 유도되는 대식세포의 세포사멸에 각 대두 추출물의 억제 효능을 세포 수 측정법으로 평가하였다.
- 유기재배과 일반 관행재배 대두 추출물의 항염증 효과는 세포생물학적 방법을 사용하였다. 마우스 대식 세포주인 Raw 264.
성능/효과
- 각 대두 추출물 1 mg/ml의 농도를 처리하였을 때, 열수추출의 경우 약 2배, 메탄올추출의 경우는 3배 정도의 항산화능력이 확인되었다(그림 1). SOD 항산화효소의 활성을 측정한 결과, 유기농 대두의 열수 추출물에서 일반 관행 재배된 대두 열수추출물보다 1.5배 증가된 SOD 활성이 관찰되었다. 또한 메탄올 추출물 분획에서는 1.
- 유기농 대두와 일반재배 대두의 각 용매별 추출물의 전자공여능 실험 결과, 유기농 대두가 더 좋은 항산화능력을 가지고 있었다. 각 대두 추출물 1 mg/ml의 농도를 처리하였을 때, 열수추출의 경우 약 2배, 메탄올추출의 경우는 3배 정도의 항산화능력이 확인되었다(그림 1). SOD 항산화효소의 활성을 측정한 결과, 유기농 대두의 열수 추출물에서 일반 관행 재배된 대두 열수추출물보다 1.
- 대두에는 많은 유용한 생리활성물질 뿐 만 아니라 알레르기 유발 물질도 존재하는 것으로 알려져 있지만 조추출물 상태에서는 특이적인 알레르기 유발보다 오히려 항알레르기 효과가 나타났다. 결론적으로, 만성 염증 및 천식, 그리고 아토피피부염과 같은 염증관련 질환에는 유기 재배된 대두가 일반 대두보다 좋은 억제 효과를 가지고 있다고 판단된다.
- 7 세포의 생존력을 생존조절 단백질인 Bcl-xl의 발현량을 western blotting으로 조사하여 평가하였다. 그 결과 유기재배 대두의 열수, 에탄올 및 메탄올 추출물 모두에서 Bcl-xl의 발현이 증가하였다.
- 1 mg/ml의 농도로 3시간 전 처리하고 DNP-IgE을 통한 비만세포의 탈과립화를 히스타민의 OPT assay를 통하여 측정하였다. 그 결과 친환경 유기농 대두의 열수, 에탄올, 메탄올 및 일반 관행재배 대두의 열수, 에탄올, 메탄올 추출물 모두에서 IgE로 매개되는 히스타민 분비를 통한 알레르기 반응을 억제하는 효과를 관찰할 수 있었으며, 항산화, 항염증 및 대식세포의 세포 사멸 보호 효과와는 다르게 유기농 대두 추출물의 증강된 효능을 입증하지 못하였다. 대두에는 많은 유용한 생리활성물질 뿐 만 아니라 알레르기 유발 물질도 존재하는 것으로 알려져 있지만 조추출물 상태에서는 특이적인 알레르기 유발보다 오히려 항알레르기 효과가 나타났다.
- 7 세포에 3시간 전 처리한 후, 염증 유도물질인 LPS(1 μg/ml)를 처리하여 염증 반응을 유도하였을 때 그 염증 반응이 예방되거나 억제되는 효과를 염증 관련 단백질인 Cox-2와 iNOS의 western blotting법으로 조사하여 측정하였다. 그 결과 친환경 유기농산물의 열수 추출물에서는 일반 관행재배 대두추출물에 비해 염증 반응 매개물질인 NO의 합성효소인 iNOS의 발현량을 2배, 메탄올 추출물에서는 1.5배 감소시켰으며, 또한 Cox-2는 열수, 에탄올, 메탄올 추출물에서 모두 감소되었다(그림 3).
- 그 결과, 일반 재배보다 유기 재배 대두 추출물이 더 좋은 항산화, 세포사멸 보호, 항염증 효과를 나타내었다. 특히 유기농 대두의 열수 추출물은 LPS로 유도시킨 염증반응을 효과적으로 억제하는 것으로 나타났다.
- 를 처리하여 세포에 세포사멸을 유도하여 세포사멸이 억제되는 정도를 세포수를 측정하여 평가하였다. 그 결과는 유기농 대두의 에탄올과 메탄올 추출물에서 관행 재배보다 향상된 세포사멸 억제 효과가 관찰되었다.
- 그 결과 친환경 유기농 대두의 열수, 에탄올, 메탄올 및 일반 관행재배 대두의 열수, 에탄올, 메탄올 추출물 모두에서 IgE로 매개되는 히스타민 분비를 통한 알레르기 반응을 억제하는 효과를 관찰할 수 있었으며, 항산화, 항염증 및 대식세포의 세포 사멸 보호 효과와는 다르게 유기농 대두 추출물의 증강된 효능을 입증하지 못하였다. 대두에는 많은 유용한 생리활성물질 뿐 만 아니라 알레르기 유발 물질도 존재하는 것으로 알려져 있지만 조추출물 상태에서는 특이적인 알레르기 유발보다 오히려 항알레르기 효과가 나타났다. 결론적으로, 만성 염증 및 천식, 그리고 아토피피부염과 같은 염증관련 질환에는 유기 재배된 대두가 일반 대두보다 좋은 억제 효과를 가지고 있다고 판단된다.
- 1 배의 증가가 관찰되었으나, 에탄올 추출물에서는 오히려 감소되는 효과를 보였다(그림 2). 따라서 각 분획물마다 항산화 효과가 다르다는 것을 알 수 있지만, 친환경 유기농 재배된 대두의 열수 추출물에서는 항산화 물질이 많이 포함되어 있을 것이라 기대할 수 있었다.
- 5배 증가된 SOD 활성이 관찰되었다. 또한 메탄올 추출물 분획에서는 1.1 배의 증가가 관찰되었으나, 에탄올 추출물에서는 오히려 감소되는 효과를 보였다(그림 2). 따라서 각 분획물마다 항산화 효과가 다르다는 것을 알 수 있지만, 친환경 유기농 재배된 대두의 열수 추출물에서는 항산화 물질이 많이 포함되어 있을 것이라 기대할 수 있었다.
- 유기농 대두와 일반재배 대두의 각 용매별 추출물의 전자공여능 실험 결과, 유기농 대두가 더 좋은 항산화능력을 가지고 있었다. 각 대두 추출물 1 mg/ml의 농도를 처리하였을 때, 열수추출의 경우 약 2배, 메탄올추출의 경우는 3배 정도의 항산화능력이 확인되었다(그림 1).
- 그 결과, 일반 재배보다 유기 재배 대두 추출물이 더 좋은 항산화, 세포사멸 보호, 항염증 효과를 나타내었다. 특히 유기농 대두의 열수 추출물은 LPS로 유도시킨 염증반응을 효과적으로 억제하는 것으로 나타났다. 그러나 항알레르기 효과는 모든 추출물에서 히스타민 유리량이 약간 감소하는 것으로 나타나 유기농과 일반재배의 차이를 확인할 수 없었다.
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