알츠하이머병은 치매를 유발하는 가장 주된 원인 질환으로 환자들은 인지장애를 겪게 된다. 현재 치료약으로 사용되는 약으로는 acetylcholinesterase 저해재가 있지만 이 약들의 효과는 미비하다. 그래서 인지기능에 영향을 미친다고 알려진 신경전달물질인 GABA, Glutamate, acetylcholine의 수치를 조절 할 수 있는 $5-HT_6$ receptor antagonist가 현재 개발되고 있다. 현재 여러 antagonist들이 임상실험 되었고, 인지 능력향상에 효과를 보이고 있다. 그러나, $5-HT_6$ receptor의 구조가 밝혀지지 않아 아직 원자적 수준의 결합 분석이 이루어지지 않았으므로 이 부분에 대한 연구가 필요하다. 따라서 본 연구에서는 Homology modeling을 통해 receptor의 구조를 예측하고, 현재 임상실험 중인 antagonist들 중 7개를 docking을 통해 단백질과 리간드의 결합을 예측하였다. Edison에서 Galaxy TBM과 Galaxy Refine을 사용하여 Homology modeling 한 결과 GPCR의 전형적인 모델에 특징적으로 긴 cterminal을 가졌다는 것을 확인 할 수 있었다. 생성된 구조를 가지고 Edison의 Dock 프로그램으로 7개의 antagonist가 어떠한 결합을 하는지 분석하였다. 그 결과, binding pose에 공통적으로 Trp102, Asp106, Val107, Pro177, Phe188, Val189, Ala192, Phe284, Phe285, Asn288, Thr306, Tyr310이 관여하는 것을 docking을 통해 알 수 있었다. 특히, Phe285는 7개의 antagonist 중에 4개와의 interaction을 하고 있는 것을 관찰하였다. 이 연구를 통하여 $5-HT_6$에 효과적으로 결합하여 치료효과를 낼 수 있는 신약을 개발할 수 있다.
알츠하이머병은 치매를 유발하는 가장 주된 원인 질환으로 환자들은 인지장애를 겪게 된다. 현재 치료약으로 사용되는 약으로는 acetylcholinesterase 저해재가 있지만 이 약들의 효과는 미비하다. 그래서 인지기능에 영향을 미친다고 알려진 신경전달물질인 GABA, Glutamate, acetylcholine의 수치를 조절 할 수 있는 $5-HT_6$ receptor antagonist가 현재 개발되고 있다. 현재 여러 antagonist들이 임상실험 되었고, 인지 능력향상에 효과를 보이고 있다. 그러나, $5-HT_6$ receptor의 구조가 밝혀지지 않아 아직 원자적 수준의 결합 분석이 이루어지지 않았으므로 이 부분에 대한 연구가 필요하다. 따라서 본 연구에서는 Homology modeling을 통해 receptor의 구조를 예측하고, 현재 임상실험 중인 antagonist들 중 7개를 docking을 통해 단백질과 리간드의 결합을 예측하였다. Edison에서 Galaxy TBM과 Galaxy Refine을 사용하여 Homology modeling 한 결과 GPCR의 전형적인 모델에 특징적으로 긴 cterminal을 가졌다는 것을 확인 할 수 있었다. 생성된 구조를 가지고 Edison의 Dock 프로그램으로 7개의 antagonist가 어떠한 결합을 하는지 분석하였다. 그 결과, binding pose에 공통적으로 Trp102, Asp106, Val107, Pro177, Phe188, Val189, Ala192, Phe284, Phe285, Asn288, Thr306, Tyr310이 관여하는 것을 docking을 통해 알 수 있었다. 특히, Phe285는 7개의 antagonist 중에 4개와의 interaction을 하고 있는 것을 관찰하였다. 이 연구를 통하여 $5-HT_6$에 효과적으로 결합하여 치료효과를 낼 수 있는 신약을 개발할 수 있다.
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문제 정의
receptor antagonist들이 어떤 방식으로 생성한 구조에 결합하는지 docking 프로그램을 실행하여 예측할 것이다. antagonists의 공통적인 포즈와 차이점을 연구하여 치료적 능력이 더 향상된 약이 만들어 질 수 있는데 도움이 되고자 한다.
따라서 앞으로의 antagonist 물질도 Phe와의 결합이 용이하면서 위의 12개의 아미노산에 binding되는 물질로 연구가 진행된다면 좋은 성과를 얻을 수 있을 것이다. 또한, 5-HT6 receptor의 새로운 antagonist를 실험할 때는 docking simulation을 통해 미리 그 효능을 시험 한 후, 선택적 실험이 가능하다는 점도 본 연구가 시사하는 바이다.
제안 방법
5-HT6 receptor antagonist가 알츠하이머병에 효과가 있다는 사실이 실험적으로 밝혀졌으나, 그 결합이 원자수준에서 분석된 적이 없기 때문에 본 연구에서는 homology modeling과 docking을 이용하여 binding pose와 interaction을 알아보았다. Homology modeling이 예측한 5-HT6는 실험적으로 관찰된 모양과 마찬가지로 긴 c-terminal을 가지고 있었다.
5-HT6의 단백질 구조를 예측하기 위하여 homology modeling을 이용하여 3차원 구조를 예측하였다. 그 첫 번째 과정으로 Galaxy TBM을 이용하여 초기 5-HT6 구조를 예측하였다.
Edison의 단백질-리간드 다킹 프로그램(Dock)[12] 프로그램을 이용하여 현재 임상실험 중에 있는 7개의 5-HT6 receptor antagonist와 5-HT6 단백질을 docking시켰다. dock프로그램에 이용한 ligand는 Schrödinger 사의 Maestro 2D sketcher[14]를 이용하여 그린 후에 ligand preparation(LigPrep)[15]을 이용하여 화합물의 구조적, 화학적 특성을 결정지었다.
Grid를 생성한 후, docking을 실행하였다. Docking 결과는 Figure 4에 나타나있다.
dock프로그램에 이용한 ligand는 Schrödinger 사의 Maestro 2D sketcher[14]를 이용하여 그린 후에 ligand preparation(LigPrep)[15]을 이용하여 화합물의 구조적, 화학적 특성을 결정지었다.
homology modeling을 통해 예측한 5HT6와 7개의 antagonist들을 docking한 각각의 결과를 쉽게 볼 수 있도록 만든 Schrödinger사의 Maestro 프로그램을 통해 본 interaction LID 결과.
Docking 결과는 Figure 4에 나타나있다. 같은 binding site라도 ligand마다 한쪽으로 치우치는 위치나 정도가 다르기 때문에, dock의 결과를 바탕으로 공통적으로 binding pose에 관여하는 아미노산들을 찾아보았다. Ligand Interaction Diagram(LID)를 확인하여 분석한 결과 Trp102, Asp106, Val107, Pro177, Phe188, Val189, Ala192, Phe284, Phe285, Asn288, Thr306, Tyr310이 7개의 antagonist에서 모두 공통적으로 발견되었고, interaction 중에는 Phe285와의 pi-pi결합이 7개 중 4개가 관찰되었다.
의 단백질 구조를 예측하기 위하여 homology modeling을 이용하여 3차원 구조를 예측하였다. 그 첫 번째 과정으로 Galaxy TBM을 이용하여 초기 5-HT6 구조를 예측하였다. 예측된 구조 PDB파일을 swiss PDB viewer를 통해 확인하였다.
현재 5-HT6의 구조는 X-ray crystallography나 NMR과 같은 실험적인 방법으로 밝혀지지 않았다. 그래서, 그 대안으로 Homology modeling이라는 방법을 사용하여 5-HT6구조를 생성하였다. homology modeling은 아미노산서열이 비슷하면 구조도 비슷하다는 가정을 이용한 것으로, 아미노산서열과 구조가 모두 밝혀진 단백질을 이용하여 아미노산 서열만 알고 있는 새로운 단백질의 구조를 알 수 있도록 해준다[11].
다음 과정으로 단백질 구조의 타당성을 수치화하여 보여주는 Galaxy QA를 이용하여 우리가 만든 5-HT6의 구조를 확인하였다. Dat형식으로 얻어진 결과를 엑셀파일로 전환한 후 그래프를 만들어 다음과 같은 수치를 확인할 수 있었다.
또, 정보기반 방법의 단백질 구조 예측 방법으로는 이러한 빈 부분에 비정상적인 구조를 예측하기도 한다. 앞의 과정에서 Galaxy TBM을 이용하여 얻은 단백질 구조는 정밀화 단계를 거치지 않은 것이므로 Galaxy Refine[12]을 따로 실행하여 Galaxy TBM으로부터 얻은 초기 단백질 구조를 정밀화하였다.
앞의 두 과정을 통해 단백질의 구조 예측을 마친 후에, 단백질이 제대로 만들어졌는가를 평가하기 위해 정밀화된 5-HT6 PDB(Protein Data Bank) 파일을 Galaxy QA[12]에 넣어 값을 확인했다. Galaxy QA 프로그램에서는 수치가 낮을수록 정확한 값을 나타낸다.
예측된 5-HT6의 구조를 기반으로 docking 연구를 진행하였다. 연구에는 총 7개의 임상단계의 5-HT6 antagonist들이 이용되었다.
그 첫 번째 과정으로 Galaxy TBM을 이용하여 초기 5-HT6 구조를 예측하였다. 예측된 구조 PDB파일을 swiss PDB viewer를 통해 확인하였다. 예측된 구조에는 긴 cterminal이 발견되었는데, 이는 Hilda Ferrero의 serotonin receptor 관련 논문[3]에서 실험적결과로 확인 된 부분과 일치한다.
Figure 2에서 두 부분에 높은 수치 (불안정한 부분)가 관찰 되는데, 그 중 빨간 화살표가 표시 된 부분은 세포의 안쪽 두 번째 루프이고, 초록색 부분은 안쪽 세 번째 루프이다. 우리가 알고자 하는 부분은 serotonin receptor antagonist가 수용체에 어떻게 결합하는지 알고자 하는 것이므로 세포 안쪽 루프인 두 부분은 모두 관련 없는 부분이므로 신경 쓰지 않고 실험을 계속 진행하였다.
이번 연구에서 우리는 Edison 프로그램을 사용하여 homology modeling방법으로 5-HT6 구조를 만들고, 생성해낸 5-HT6 구조와 5-HT6 receptor antagonist들이 어떤 방식으로 생성한 구조에 결합하는지 docking 프로그램을 실행하여 예측할 것이다. antagonists의 공통적인 포즈와 차이점을 연구하여 치료적 능력이 더 향상된 약이 만들어 질 수 있는데 도움이 되고자 한다.
예측된 구조에는 긴 cterminal이 발견되었는데, 이는 Hilda Ferrero의 serotonin receptor 관련 논문[3]에서 실험적결과로 확인 된 부분과 일치한다. 초기 구조는 Galaxy Refine이라는 단백질 구조 최적화 프로그램을 이용하여 최적화되었고 다음과 같은 결과를 얻었다. Figure 1에 나타나듯이, 연두색 리본이 Galaxy TBM단계의 결과로 나온 최초의 구조이고, 보라색 리본이 Refine단계를 거친 후의 구조인데, refine 전후 구조가 약 0.
대상 데이터
Galaxy TBM은 Fasta형식의 아미노산의 서열을 입력하면 스스로 비교 할 주형단백질을 찾아내고, 거기에 맞춰 우리가 입력한 아미노산서열의 단백질 구조를 예측해준다. 5-HT6의 아미노산 서열은 NCBI 웹사이트(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)를 통해 얻을 수 있었으며 시퀀스 ID는 NP_000862.1를 사용하였다.
의 구조를 기반으로 docking 연구를 진행하였다. 연구에는 총 7개의 임상단계의 5-HT6 antagonist들이 이용되었다. Docking을 진행하기에 앞서 5-HT6의 리간드 결합 부위를 지정하였고 그 위치를 기반으로 grid를 생성하였다 (Figure 3).
이론/모형
5-HT6의 구조를 예측하기 위하여 Edison 프로그램 중 Galaxy TBM[12]을 이용하였다. Galaxy TBM은 Fasta형식의 아미노산의 서열을 입력하면 스스로 비교 할 주형단백질을 찾아내고, 거기에 맞춰 우리가 입력한 아미노산서열의 단백질 구조를 예측해준다.
성능/효과
Homology modeling이 예측한 5-HT6는 실험적으로 관찰된 모양과 마찬가지로 긴 c-terminal을 가지고 있었다. Docking을 통해서는 Trp102, Asp106, Val107, Pro177, Phe188, Val189, Ala192, Phe284, Phe285, Asn288, Thr306, Tyr310 아미노산들이 binding pose에 공통적으로 관여하는 것을 알 수 있었다. 또한, 임상실험을 거친 7개의 antagonist들 중에서 5개가 Phe와의 결합을 가졌고, 그 중에서도 Phe285와의 결합이 4개나 차지하였다.
같은 binding site라도 ligand마다 한쪽으로 치우치는 위치나 정도가 다르기 때문에, dock의 결과를 바탕으로 공통적으로 binding pose에 관여하는 아미노산들을 찾아보았다. Ligand Interaction Diagram(LID)를 확인하여 분석한 결과 Trp102, Asp106, Val107, Pro177, Phe188, Val189, Ala192, Phe284, Phe285, Asn288, Thr306, Tyr310이 7개의 antagonist에서 모두 공통적으로 발견되었고, interaction 중에는 Phe285와의 pi-pi결합이 7개 중 4개가 관찰되었다.
후속연구
또한, 임상실험을 거친 7개의 antagonist들 중에서 5개가 Phe와의 결합을 가졌고, 그 중에서도 Phe285와의 결합이 4개나 차지하였다. 따라서 앞으로의 antagonist 물질도 Phe와의 결합이 용이하면서 위의 12개의 아미노산에 binding되는 물질로 연구가 진행된다면 좋은 성과를 얻을 수 있을 것이다. 또한, 5-HT6 receptor의 새로운 antagonist를 실험할 때는 docking simulation을 통해 미리 그 효능을 시험 한 후, 선택적 실험이 가능하다는 점도 본 연구가 시사하는 바이다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
치매를 유발하는 가장 주된 원인 질환은?
알츠하이머병은 치매를 유발하는 가장 주된 원인 질환으로 환자들은 인지장애를 겪게 된다. 현재 치료약으로 사용되는 약으로는 acetylcholinesterase 저해재가 있지만 이 약들의 효과는 미비하다.
알츠하이머 환자들의 치료제의 기반이 되는 것은?
알츠하이머 환자들은 acetylcholine의 체내 수준이 부족한 현상을 일반적으로 보이게되며, 이에 기반하여 acetylcholine의 가수분해를 촉진하는 효소인 acetylcholinesterase의 기능을 저해하는 것이 현재 존재하는 대부분의 치료제의 기반이 되고 있다. 관련 치료제로는 Donepezil, Rivastigmine, Galantamine 등이 있다[3].
알츠하이머 치료제로 사용되고 있는 치료제의 한계점은?
관련 치료제로는 Donepezil, Rivastigmine, Galantamine 등이 있다[3]. 하지만 이러한 acetylcholine의 수용체를 이용하는 방법은 치매의 진행을 중단시키거나 늦추지는 못한다. 그리고 이러한 acetylcholinergic의 한계 때문에 요즘 serotonergic system이 새로운 치료제로 연구되고 있다[4, 5].
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