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[학위논문] 일본뇌염바이러스 감염에 대응하는 GI/GIII 약독화 키메라 백신 (Attenuated chimeric GI/GIII vaccine candidate against Japanese Encephalitis Virus)

Lee eun ji (건국대학교 대학원)
2023 , 건국대학교 대학원 , 국내석사

일본뇌염은 동남아시아, 서태평양 국가, 오스트레일리아 북부에서 주로 발생하며 높은 치사율을 나타내고 생존자들에게 영구적인 행동적, 정신적, 신경학적 후유증을 유발하는 플라비바이러스 질환이다. 일본뇌염 바이러스는 일본뇌염의 원인이며, 한국을 포함한 일부 아시아 지역에서는 전 세계적으로 우세종이었던 GIII 유전자형에서 GI 유전자형으로 대체되고 있다. 그러나 JEV 유전자형 감염 치료에 대한 임상적으로 승인된 치료약은 없으며, 현재 상용화된 GIII JEV 균주 기반의 백신은 GI JEV에 대한 부분적인 보호만 제공할 뿐 방어하기에 충분하지 않다. 따라서 우리는 GI JEV에 대한 새로운 의료 대책을 필요로 한다. 본 연구에서는 역유전학 시스템을 이용하여 GI JEV에 대해 높은 효능을 보이는 새로운 키메릭 JEV 균주의 제작을 시도하였다. 우리는 GIII SA14-14-2 균주의 E 영역이 GI 균주 K05GS의 E 영역으로 대체된 GI-GIII 유형간 재조합 균주 rJEV-G1을 생성하였고 그 결과, 키메릭 바이러스의 신경독성이 유의미하게 감소하였으며, rJEV-G1의 성장률은 K05GS 균주보다 낮았다. 또한, 면역화 및 챌린지를 통해 키메릭 바이러스의 면역원성을 분석한 결과, GI JEV에 대한 중화항체를 유도하였으나 면역원성은 K05GS보다 낮았고 기존 약독화 생백신 바이러스주인 SA14-14-2에 의해 유도된 것보다는 높았다. rJEV-G1의 낮은 면역원성은 약독화 돌연변이에 의해 야기되는 성장능력의 감소에 기인할 수 있다. 이러한 결과는 rJEV-G1이 GI JEV에 대한 안전하고 효과적인 생백신 후보로 작용할 수 있음을 시사한다.

[학위논문] 포유동물세포주에서의 일본뇌염바이러스 감염에 의한 세포병리기전 : Capsid Protein of Japanese Encephalitis Virus Abrogates Cell Cycle (Cytopathogenesis by Japanese Encephalitis Virus Infection in Cultures Mammalian Cells)

元星湧 (慶熙大學敎 大學院)
2001 , 35 p. , 慶熙大學敎 大學院 , 국내석사

Japanese encephalitis virus (JEV) is a member of the genus flavivirus in family Flaviviridae and causes acute encephalitis in humans with a high mortality rate. The JEV genome is a single-stranded, positive-sense RNA of approximately 11 kb length and contains an open reading frame for a polyprotein that is proteolytically cleaved by cellular and viral proteases into more than 10 viral proteins. These contain three structural proteins including capsid (C), precursor membrane (prM), and envelope (E) protein and seven nonstructural proteins designated NS1 through NS5, but some of their functions in JEV cytopathogenesis have not been fully elucidated yet. In the previous reports, the over-expressed NS2B and NS4B, small hydrophobic nonstructural proteins, of JEV cause cells to increase membrane permeability in Escherichia coli and baby hamster kidney cells (BHK-21) inducible expression system, and capsid and NS4B proteins of flavivirus Kunjin translocate independently into the nucleus of infected cells. In this study, to investigate the effects of JEV proteins on BHK-21 cells, capsid and NS4B proteins of JEV were cloned into eukaryotic expression vector, pcDNA3.1, containing immediately early gene promoter of cytomegalovirus, and then over-expressed in BHK-21 cells followed by selection of stably transformed cells with antibiotic G418. BHK-21/cap cells, expressing capsid protein, showed retardation of cell growth and reduction of G0/G1 population(G2 arrest-like DNA profile) in comparison with control cells which were transformed with pcDNA3.1 only while BHK-21/ns4b cells, expressing NS4B protein, exhibited no cell growth retardation but with slight reduction of G2/M population. In addition, BHK-21/cap cells demonstrated up-regulated expression of p21WAF1/CIP1 protein, a cyclin dependent kinase inhibitor, and also suppressed expression of Bcl-XL, an anti-apoptotic gene product. Taken together, the results of this study imply that upon JEV infection, capsid protein may abrogates the cell cycle, evidenced by abnormal DNA profile and alteration of specific gene expression of host cells, thereby contributing in part to virus-induced cytopathic effects in JEV-infected cells.

[학위논문] 일본뇌염바이러스에 대한 암포테리신 B의 항바이러스 작용 연구 (Antiviral effect of amphotericin B on Japanese encephalitis virus replication)

김훈 (Graduate School, Yonsei University)
2003 , xi, 46장 , Graduate School, Yonsei University , 국내석사

일본뇌염바이러스는 Flaviviridae 에 속하는 바이러스로 급성 뇌염의 원인체이며, genome 크기는 약 11 kb 정도의 RNA 바이러스이다. 항진균제로 사용되고있는 폴리엔 구조의 암포테리신 B는 세포막에 있는 에르고스테롤과 특이적으로 결합하여 항진균작용을 나타낸다. 최근, 암포테리신 B 의 항바이러스 작용은 rubella virus, HIV 그리고 HBV 등을 대상으로 보고되었으며, 항바이러스 작용은 각기 다른 기작에 의해서 작용하였다. 본 연구에서는 일본뇌염바이러스를 대상으로 암포테리신 B의 항바이러스 작용을 연구하였다. 암포테리신 B가 가지고 있는 숙주세포에 대한 세포독성을MTS assay를 이용하여 측정하였으며, 그 결과 최대 사용 용량을 10 ㎍/㎖ 로 정하였고, 같은 농도에서 일본뇌염바이러스에 대한 저해 작용을 형태학적인 측면에서 확인한 결과 약 70% plaque 숫자 감소와 약 5배 정도의 크기 감소를 보였으며, 5 ㎍/㎖ 농도에서 200배의 바이러스 titer 감소를 보였다. 또한, 암포테리신 B의 저해 작용은 바이러스가 숙주세포에 감염된 후에 작용함을 알 수가 있었다. 일본뇌염바이러스의 핵심 병원성 단백질인 envelope protein 을 대상으로 Western blot analysis 를 한 결과 10 ㎍/㎖ 의 암포테리신 B 처리 시 약 70% 의 감소를 보였다. 실험 결과를 종합하여 보면 암포테리신 B 는 일본뇌염바이러스가 숙주세포에 감염된 후 progeny virus 의 복제에 영향을 주어 항바이러스 작용을 하며, 이는 암포테리신 B 가 ER lumen 에서 maturation 되는 glycoprotein 의 합성에 영향을 준 것이 원인 중에 하나로 생각되어진다. /

[해외논문] Japanese Encephalitis Virus in Meningitis Patients, Japan

Kuwayama, Masaru (Hiroshima Prefectural Institute of Health and Environment, Hiroshima, Japan) , Ito, Mikako , Takao, Shinichi (National Institute of infectious Diseases, Tokyo, Japan) , Shimazu, Yukie (Hiroshima Prefectural Institute of Health and Environment, Hiroshima, Japan) , Fukuda, Shinji , Miyazaki, Kazuo (Hiroshima Prefectural Institute of Health and Environment, Hiroshima, Japan) , Kurane, Ichiro , Takasaki, Tomohiko (Hiroshima Prefectural Institute of Health and Environment, Hiroshima, Japan)
Emerging infectious diseases v.11 no.3 ,pp. 471 - 473 , 2005 , 1080-6040 , Centers for Disease Control and Prevention

Cerebrospinal fluid specimens from 57 patients diagnosed with meningitis were tested for Japanese encephalitis virus. Total RNA was extracted from the specimens and amplified. Two products had highest homology with Nakayama strain and 2 with Ishikawa strain. Results suggest that Japanese encephalitis virus causes some aseptic meningitis in Japan.

[해외논문] Change in Japanese Encephalitis Virus Distribution,Thailand

Nitatpattana, Narong , Dubot-Pérès, Audrey , Gouilh, Meriadeg Ar , Souris, Marc , Barbazan, Philippe , Yoksan, Sutee , de Lamballerie, Xavier , Gonzalez, Jean-Paul
Emerging infectious diseases v.14 no.11 ,pp. 1762 - 1765 , 2008 , 1080-6040 , Centers for Disease Control and Prevention

Japanese encephalitis virus (JEV) genotypes in Thailand were studied in pigs and mosquitoes collected near houses of confirmed human JEV cases in 2003–2005. Twelve JEV strains isolated belonged to genotype I, which shows a switch from genotype III incidence that started during the 1980s.

[국내논문] Molecular Aspects of Japanese Encephalitis Virus Persistent Infection in Mammalian Cells

Park, Sun-Hee (Molecular Virology Laboratory, Department of Biology, College of Liberal Arts and Sciences, Kyung Hee University) , Won, Sung Yong (Molecular Virology Laboratory, Department of Biology, College of Liberal Arts and Sciences, Kyung Hee University) , Park, Soo-Young (Molecular Virology Laboratory, Department of Biology, College of Liberal Arts and Sciences, Kyung Hee University) , Yoon, Sung Wook (Molecular Virology Laboratory, Department of Biology, College of Liberal Arts and Sciences, Kyung Hee University) , Han, Jin Hyun (Molecular Virology Laboratory, Department of Biology, College of Liberal Arts and Sciences, Kyung Hee University) , Jeong, Yong Seok (Molecular Virology Laboratory, Department of Biology, College of Liberal Arts and Sciences, Kyung Hee University UU0001575 한국미생물학회 2000년도 International Meeting 2000 2000 May 01 ,pp. 23 - 36 , 2000 , The Microbiological Society of Korea

Japanese encephalitis virus (JEV) is the causative agent of a mosquito-borne encephalitis and is transmitted to human via persistently infected mosquito vectors. Although the virus is known to cause only acute infection, there were reports that showed neurological sequelae, latent infection in peripheral mononuclear cells, and recurrence of the disease after acute encephalitis. Innate resistance of certain cell lines, abnormal SN1 expression of the virus, and anti-apoptotic effect of cullular bcl-2 have been suggested as probable causes of JEV persistence even in the absence of defective interfering (DI) particles. Although possible involvement of DI particles in JEV persistence was suggested, neither has a direct evidence for DI presence nor its molecular characterization been made. Two questions asked in this study are whether the DI virus plays any role in JEV persistent infection if it is associated with and what type of change(s) can be made in persistently infected cells to avoid apoptosis even with the continuous virus replication, DI-free standard stock of JEV was infected in BHK-21, Vero, and SW13 cells and serial high multiplicity passages were performed in order to generate DI particles. There different-sized DI RNA species which were defective in both structural and nonstructural protein coding genes. Rescued ORFs of the DI genome maintained in-frame and the presence of replicative intermediate or replicative form RNA of the DI particles confirmed their replication competence. On the other hand, several clones with JEV persistent infection were established from the cells survived acute infections during the passages. Timing of the DI virus generation during the passages seemed coincide to the appearance of persistently infected cells. The DI RNAs were identified in most of persistently infected cells and were observed throughout the cell maintenance. One of the cloned cell line maintained the viral persistence without DI RNA coreplication. The cells with viral persistence released the reduced but continuous infectious JEV particle for up to 9 months and were refractory to homologous virus superinfection but not to heterologous challenges. Unlike the cells with acute infection these cells were devoid of characteristic DNA fragmentation and JEV-induced apoptosis with or without homologous superinfection. Therefore, the DI RNA generated during JEV undiluted serial passage on mammalian cells was shown to be biologically active and it seemed to be responsible, at least in part, for the establishment and maintenance of the JEV persistence in mammalian cells. Viral persistence without DI RNA coreplication, as in one of the cell clones, supports that JEV persistent infection could be maintained with or without the presence of DI particles. In addition, the fact that the cells with JEV persistence were resistant against homologous virus superinfection, but not against heterologous one, suggests that different viruses have their own and independent pathway for cytopathogenesis even if viral cytopathic effect could be converged to an apoptosis after all.

[해외논문] Neuropathogenesis of Japanese encephalitis virus

Yasui, K.
Neuroscience of HIV infection 2002 ,pp. 112 - 114 , 2002 , Taylor and Francis

[학위논문] 역유전학 시스템을 이용한 재조합 일본뇌염바이러스 유전자형 III 제작 (Construction of the recombinant Japanese encephalitis virus genotype III using reverse genetics system)

최희재 (건국대학교 대학원)
2022 , 42 , 건국대학교 대학원 , 국내석사

일본뇌염바이러스는 Flaviviridae과에 속하는 모기 매개 바이러스로 사망률이 30%에 달하는 심각한 중추 신경계 바이러스이다. 현재 세계 주요 공중보건 문제로써 새로운 항체 치료제 및 백신 개발의 필요성이 제기되고 있다. 최근 역 유전학 시스템을 이용한 infectious cDNA clone제작으로 바이러스 균주의 특성을 규명하려는 연구가 수행되고 있다. 이러한 역 유전학 시스템은 바이러스의 복제와 병원성을 특정 짓는 지놈의 분석 및 변형을 용이하게 하여 새로운 항바이러스 화합물과 백신 개발에 기여한다. 본 연구에서는 역유전학 시스템을 이용하여 JEV 균주인 SA14-14-2의 infectious cDNA clone을 구축하고 재조합 바이러스를 생성하였다. 바이러스 RNA 지놈을 역 전사하여 말단에 중복된 서열을 가진 네 개의 단편을 증폭하였고 5‘말단에는 T7 프로모터를 연결시켰고, 3’말단에는 poly (A) signal을 연결시켜 p15A 복제기점 (origin of replication)을 갖는 낮은 카피수의 pACYC184 플라즈미드에 형질전환 하였다. 표적 세포에 cDNA clone를 형질 주입하여 제작한 재조합 바이러스는 wild type SA14-14-2 와 유사한 감염성과 plaque의 형태를 나타냈으며 10회의 연속적인 배양 후에도 안정적으로 유지되는 것을 확인할 수 있었다. 이러한 역 유전학 시스템을 구축하면 새롭게 부상하는 JE 바이러스에 대한 특성화 연구와 치료제 및 백신 개발의 가능성이 열릴 것이다.

[국내논문] BHK-21 세포에서의 일본뇌염바이러스 구조단백질에 의한 세포독성 (Cytopathic Effects of Japanese Encephalitis Virus Structural Proteins in BHK-21 Cells)

성기민 (경희대학교 생물학과 및 기초과학연구소) , 정용석 (경희대학교 생물학과 및 기초과학연구소)
Korean journal of microbiology = 미생물학회지 v.38 no.3 ,pp. 213 - 220 , 2002 , 0440-2413 , 한국미생물학회

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일본뇌염바이러스(Japanese encephalitis virus, JEV)의 구조단백질 capsid (C), precursor membrane (prM/M), 및 envelop (E) 단백질의 독립적인 발현을 위한 inducible expression system을 구축하였다. 발현세포주로는 BHK-21을 사용하였으며 발현의 induction에는 tetracycline analog인 doxycycline이 사용되었다. Transfectant BHK-21/IV(vector대조구), BHK21/IC(C), BHK-21/IP (prM/M),및 BHK-21/IE는 G418과 hygromycin 존재하에 클로닝되었으며 doxycycline induction에 따른 각 유전자의 mRNA 전사를 확인하였다. 세포의 성장곡선, chromatin condensation, internucleosomal DNA fragmentation, 및 flow cytometry에 의한 DNA content profile 분석을 통해 induction에 의한 각 구조단백질의 발현이 숙주세포에 미치는 영향을 조사하였다. 세 transfectants 모두 세포성장이 감소하고 chromatin이 응축되었다. 그러나 DNA fragmentation 및 DNA content profile 분석에서는BHK-21/IC만이 induction에 따라 상응하여 반응하였다. 이상의 결과는 JEV 감염에 의한 apoptotic 세포사멸 유도기전에서 capsid 단백질이 직접적이고 독립적인 영향요인이 될 수 있음을 제시한다.

[학위논문] Cloning, Sequencing and Expression of the Glycoprotein E Gene of Japanese Encephalitis Virus : 일본뇌염(Japanese encephalitis) 바이러스의 당단백질 E 유전자의 클로닝, 염기서열 분석과 발현

홍승국 (Graduate school of Kon Kuk University)
1997 , 82p. , Graduate school of Kon Kuk University , 국내박사

Japanese encephalitis virus (JaGar strain) 의 E 유전자를 클로닝하여 염기 서열을 분석하였고, E 유전자가 재조합된 Baculovirus를 이용하여 Spodoptera frugiperdo cell 애서 발현을 보았으며, 면역된 guinea pig로부터 항체가를 유도하는 것이 본 연구의 목적이었바. JEV 로부터 genomic RNA를 분리하여 cDNA를 얻은 후 Polymerase chain reaction (PCR) 법을 이용하여 E 유전자를 합성하였다. 1500bp의 PCR 산물을 pOEM-T 벡터에 클로닝하여 pG1.5 재조합체라 명명하였다. E 유전자 단편은 NheⅠ, SacⅠ, Nco Ⅰ, Sph Ⅰ, HincⅡ로 절단하여 제한 효소 지도를 작성하였다. pG 1.5 재조합체에 클로닝된 1.5Kb DNA의 염기서열 분석을 위하여 Sau3AⅠ로 잘려진 DNA 단편들을 pTZ18R과 pSL1190 백터에 서브클로닝 하였으며, 이 졔조합체의 염기서열을 분석하였다. JaGar strain의 E 유전자와 다른 neurovirulent JE strain E 유전자 사이의 염기 서열은 97.4% - 99.3% 의 유사성을 가졌으며, N말린 서열도 유사함이 확인되었다. 개시 암호가 없는 PCR 산물을 signal sequence를 가진 pHcgXⅢB에 클로닝하여 pHcE 라 명명하였고, E유전자가 재조합된 Baculovirus를 Spodoptera frugiperda cell 애서 발현 하였다. 제조합 viral DNA를 BamHI으로 절단하였고, E 유전자 탐침자와의 혼성화를 통하여 JEV유전정보가 AcNPV genome 으로 삽입되어 쟤조합체가 이루어 졌음이 확인되었다. Monoclonal antibodies 를 이용한 제조합 단백질의 Western blot애 의해 53kDa의 분자량을 가진 E protein의 발현이 확인되었다. 또한, immunodotting assay에 의해 이러한 E protein이 native linear form 뿐만 아니라 conformational form도 Mab에 의해 인식점이 화인 되었다. 재조합 단백질을 이용한 Hemagglutination을 수행하여, 혈구 응집력을 확인하였고, 이 단백질로 면역편 guinea pig로 부터 얻은 항체는 Hemagglutinate inhibition activity, Serum neutralization activity를 나타내었다.

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