초록 ▼

본 발명은 염기서열을 파악하려는 DNA를 합성하면서 특정DNTP를 소모시키고, 이 특정 DNTP의 소모를 탐지하는 별도의 DNA합성반응을 진행시켜, 이 소모 탐지 반응의 결과에 따라 특정 DNTP의 공급을 조절하면서 DNA의 염기서열을 알아내는 방법이다. 본 발명은 DNA염기서열을 분석하는 방법에 관한 것으로 전기영동 없이 DNA 염기서열을 알아내는 방법임.DNTP소모용 DNA합성반응에서 서열을 알아내고자 하는 DNA를 합성할 때 특정 DNTP를 일정량 공급하고, 이 반응 후에 남은 DNTP를 다른 지점에

본 발명은 염기서열을 파악하려는 DNA를 합성하면서 특정DNTP를 소모시키고, 이 특정 DNTP의 소모를 탐지하는 별도의 DNA합성반응을 진행시켜, 이 소모 탐지 반응의 결과에 따라 특정 DNTP의 공급을 조절하면서 DNA의 염기서열을 알아내는 방법이다. 본 발명은 DNA염기서열을 분석하는 방법에 관한 것으로 전기영동 없이 DNA 염기서열을 알아내는 방법임.DNTP소모용 DNA합성반응에서 서열을 알아내고자 하는 DNA를 합성할 때 특정 DNTP를 일정량 공급하고, 이 반응 후에 남은 DNTP를 다른 지점에 있는 DNTP 소모 탐지용 DNA합성반응에 공급함. 특정 DNTP 소모 탐지용 DNA합성반응은 그 특정 DNTP가 있으면 제한효소가 인지할 수 있는 서열을 만들 수 있으므로 DNA합성반응 후에 제한효소를 반응시키고 씻어내면 DNA끝에 붙은 형광염료도 함께 씻겨나가며, 특정 DNTP가 없으면 제한효소가 인지할 수 있는 서열을 만들 수 없으므로 제한효소 반응 후에 씻겨 나가지 않으므로, 특정 DNTP를 소모용 DNA합성반응 후에 탐지용 DNA합성반응에 보내어 어느정도 소모되었는지 형광염료 탐지기로 알아냄으로써 DNTP소모용 DNA합성반응에서 합성하는 DNA의 염기서열을 알아낼 수 있음. 이를 위하여 알아내고자하는 서열 1개당 DGTP, DATP, DTTP, DCTP를 각각 차례로 소모용 DNA합성반응에 공급하고 소모 탐지용 DNA합성반응에서 소모 정도를 확인함. 실시간으로 형광을 측정하면서 공급할 특정 DNTP를 결정하고 각 DNTP는 필요한 양에 비해 10％씩 초과 공급하여 형광 여부와 정도를 계산함으로써 같은 염기가 연이어 있는 서열도 파악할 수 있음. 현재까지 나온 방법 중 가장 우수한 생거방법은 전기영동을 사용하므로 근본적으로 800번째 이상 염기서열을 확인하기 어렵지만 본 발명은 효소 등을 개선하기에 따라 1만번째 이상까지도 확인할 수 있음. 동일한 반응을 동시에 수행하거나 서로 상보적인 DNA가닥을 각각 확인하여 속도와 정확도를 높일 수 있음.

대표청구항 ▼

염기서열을 파악하려는 DNA 를 합성할 때 특정 dNTP 를 주어 dNTP 소모용 DNA 합성반응을 시킨 다음, 이 반응액을 이 특정 dNTP 가 있어야만 합성반응을 시작해서 제한효소가 인지할 수 있는 염기서열을 합성하는 dNTP 소모 탐지용 DNA 합성반응에 보내어 DNA 합성반응을 시킨 다음, 제한효소를 가해서 이 특정 dNTP 가 있음으로 해서 제한효소가 인지할 수 있는 서열을 합성하는데 참여했으면 그 결과 제한효소를 가했을 때 DNA 가 절단되고,이 특정 dNTP 가 없으면 제한효소가 인지할 수 있는 서열을 합성하지 못하여

염기서열을 파악하려는 DNA 를 합성할 때 특정 dNTP 를 주어 dNTP 소모용 DNA 합성반응을 시킨 다음, 이 반응액을 이 특정 dNTP 가 있어야만 합성반응을 시작해서 제한효소가 인지할 수 있는 염기서열을 합성하는 dNTP 소모 탐지용 DNA 합성반응에 보내어 DNA 합성반응을 시킨 다음, 제한효소를 가해서 이 특정 dNTP 가 있음으로 해서 제한효소가 인지할 수 있는 서열을 합성하는데 참여했으면 그 결과 제한효소를 가했을 때 DNA 가 절단되고,이 특정 dNTP 가 없으면 제한효소가 인지할 수 있는 서열을 합성하지 못하여 DNA 가 제한효소를 가해도 절단되지 않음. 형광물질과 연결된 DNA 를 씻어낼 수 없으면 이 특정 dNTP 가 염기서열을 파악하려는 DNA를 합성할 때 쓰였음을 알 수 있음. 이렇게 서로 다른 장소에서 dNTP 소모용 DNA 합성반응과 dNTP 소모 탐지용 DNA 합성반응을 진행하는 DNA 합성을 이용한 DNA 염기서열분석 방법.청구항 1 에서와 같이 근본적으로 dNTP 소모용 DNA 합성반응과 dNTP 소모 탐지용 DNA 합성반응을 다른 장소에서 진행하는 방법으로써, dNTP 소모 탐지용 DNA 합성반응만 청구항 1 의 방법과 다른 여러가지 방법도 본 발명에 포함됨.특정 dNTP 가 소모용 DNA 합성반응에서 소모되었으면 소모 탐지용 DNA 합성반응에서 DNA 합성에 쓰일 수 없어 그 다음에 dNTP-Cy5(fluorophore-modified nucleotides)도 합성에 쓰이지 못함. 특정 dNTP 가 없으면 형광염료(Cy5)가 붙어있는 dNTP 유사체 역시 합성에 쓰이지 못해 세척 후 이들의 형광이 감지되지 않으므로 염기서열을 파악하는 DNA 합성을 이용한 DNA 염기서열분석 방법.특정 dNTP 가 소모용 DNA 합성반응에서 소모되었으면 소모 탐지용 DNA 합성반응에서 DNA 합성에 쓰일 수 없어 그 다음에 aa-dNTP(aminoallyl-modified nucleotide)도 합성에 쓰이지 못함. dNTP 유사체의 아민(amine)과 반응하는 형광염료(amino-coupling of fluorescent dyes)를 첨가하고 세척한 후 이 형광염료가 감지되지 않으므로 염기서열을 파악하는 DNA 합성을 이용한 DNA 염기서열분석 방법.특정 dNTP가 소모용 DNA 합성반응에서 소모되었으면 소모 탐지용 DNA 합성반응에서 DNA 합성이 일어나지 않고, 주형 DNA 가닥의 염기서열과 상보적이면서 형광염료를 포함하고 있는 DNA 단편이 hybridization 을 할 수 있으므로 세척 후에 형광이 감지되므로 염기서열을 파악하는 DNA 합성을 이용한 DNA 염기서열분석 방법.특정 dNTP 가 소모용 DNA 합성반응에서 소모되었으면 소모 탐지용 DNA 합성반응에서 DNA 합성이 일어나지 않고, 주형 DNA 가닥의 염기서열과 상보적이면서 ferrocene 을 포함하는 DNA(ferrocene-modified DNA)단편이 hybridization 을 할 수 있으므로 전기적 특성이 다른 것을 교류볼타미터(alternating current voltammetry)로 측정함으로써 염기서열을 파악하는 DNA 합성을 이용한 DNA 염기서열분석 방법.특정 dNTP 가 소모용 DNA 합성반응에서 소모되지 않았으면 소모 탐지용 DNA 합성반응에서 이 dNTP가 DNA 합성반응에 쓰일 때 생기는 ppi 를 APS(adenosine 5`` phosphosulfate)와 ATP sulfurylase 로 ATP 로 바꾸고, 이 ATP 와 luciferase 로 luciferin 을 oxyluciferin 으로 만들 때 생기는 빛을 탐지해서 염기서열을 파악하는 DNA 합성을 이용한 DNA 염기서열분석 방법.특정 dNTP 가 소모용 DNA 합성반응에서 소모되었으면 소모 탐지용 DNA 합성반응에서 DNA 합성에 쓰일 수 없으므로 합성반응 후 소모 탐지용 DNA 주형과 상보적인 DNA 가 붙은 비오틴이 고정된 장소로 반응액을 보내어 hybridization 을 시켰을 때 세척 후 형광을 감지할 수 있으므로 염기서열을 파악하는 DNA 합성을 이용한 DNA 염기서열분석 방법.특정 dNTP 가 소모용 DNA 합성반응에서 소모되었으면 소모 탐지용 DNA 합성반응에서 DNA 합성에 쓰일 수 없으므로 dNTP 소모 탐지용 DNA 합성반응에서 합성될 서열과 동일한 서열을 가진 DNA 에 효소(예. horeseradish peroxidase)를 붙인 DNA 가닥이 hybridization 을 할 수 있으므로 세척 후 기질(예. 5AP 5-aminosalicylic acid)을 주어서 색깔이 변하는 것을 탐지하여 합성여부를 확인하여 염기서열을 파악하는 DNA 합성을 이용한 DNA 염기서열분석 방법.DNA 합성효소의 활동을 방해하지 않을 정도로 유연성을 줄만큼 긴 DNA 끝에 효소(예. horseradish peroxidase)를 붙인 것을 주형 DNA 가닥으로 고정시켜 사용할 때 특정 dNTP 가 소모용 DNA 합성반응에서 소모되었으면 소모 탐지용 DNA 합성반응에서 DNA 합성에 쓰일 수 없으므로 이 DNA 가닥을 제한효소로 자를 수 없으므로 세척한 후 이 효소가 상실되지 않고 효소의 기질(5AP|5-aminosalicylic acid 등)을 공급하면 색깔이 변함. 이를 탐지하여 DNA 염기서열을 파악하는 DNA 합성을 이용한 DNA 염기서열분석 방법.dNTP 가 소모용 DNA 합성반응에서 소모되지 않았으면 소모 탐지용 DNA 합성반응에서 dNTP 가 고정된 DNA 에 들어가고 그래서 다음에 들어갈 수 있는 dNTP 들이 비로소 들어가게되면, 이들이 들어가고 나면 나중에 이렇게 들어간 염기서열과 동일하면서 끝에 항체를 갖고 있는 DNA 단편이 hybridization 을 할 수 없으므로 세척할 때 씻겨나가 세척 후 형광물질이 붙은 항체를 가했을 때 항체가 붙을 게 없으므로 염기서열을 파악하거나 소모 탐지용 DNA 합성반응에서 주형 DNA 의 3``쪽에 항원을 붙이고 Sau3AⅠ으로 자를 수 있게 되면 항원이 세척 때 소실되어 형광물질이 붙은 항체가 붙을 수 없게 됨으로 염기서열을 파악하는 DNA 합성을 이용한 DNA 염기서열분석방법.dNTP 소모 탐지용 DNA 합성반응을 각자 다른 장소에서 하지 않고, 소모용 DNA 합성반응에 가까운 곳 한 곳에 강한 자석침을 설치하고 스트렙타비딘을 붙인 자석구슬(streptavidin-coated magnetic beads)에 붙인 DNA 와 필요한 재료를 매번 자석침 장소에 가져와서 반응시키고 씻어냄으로써 염기서열을 파악하는 DNA 합성을 이용한 DNA 염기서열분석 방법.