초록
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1. 서론
2016년 6월 미국 FDA는 비소세포폐암 EGFR 표적치료제인 얼로티닙(Erlotinib, 제품명: Tarceva)에 대한 동반진단 검사법인 코바스 EGFR 변이 검사 v2(Cobas EGFR Mutation test v2)를 승인했다. 로슈분자시스템(Roche molecular system)이 개발한 이 검사법은, 조직생검이 어려운 비소세포폐암 환자의 혈액 내 ctDNA로부터 EGFR 유전자변이 여부를 확인하는 방법이다. 엑손 18의 G719X 치환 변이, 엑손 19의 결실 변이, 엑손 20의 T79
1. 서론
2016년 6월 미국 FDA는 비소세포폐암 EGFR 표적치료제인 얼로티닙(Erlotinib, 제품명: Tarceva)에 대한 동반진단 검사법인 코바스 EGFR 변이 검사 v2(Cobas EGFR Mutation test v2)를 승인했다. 로슈분자시스템(Roche molecular system)이 개발한 이 검사법은, 조직생검이 어려운 비소세포폐암 환자의 혈액 내 ctDNA로부터 EGFR 유전자변이 여부를 확인하는 방법이다. 엑손 18의 G719X 치환 변이, 엑손 19의 결실 변이, 엑손 20의 T790M, S768I 치환 및 삽입 변이, 엑손 21의 L858R, L861Q 치환 변이 등 총 42개의 변이를 검출할 수 있다. 혈중 ctDNA(circulating tumor DNA, 순환종양 DNA)의 검출, 분석 기술의 FDA 승인은 액체생검 시장 확대의 신호탄이 되었다. 지노믹헬스(GenomicHealth)도 ctDNA를 검출하여 악성종양의 변화와 치료 반응, 내성과 연관된 4가지 형태의 유전자변이를 분석하는 검사법을 개발하고 있다. 바이오셉트(Biocept)는 ctDNA 및 순환종양세포(circulating tumor cell, CTC)를 모두 검사할 수 있는 플랫폼을 개발, 비소세포폐암 환자의 EGFR, KRAS, ALK 변이분석 검사법을 개발하고 있다. 트로바진(Trovagene)은 소변과 혈액 내 ctDNA를 분석하여 비소세포폐암 발암 유전자 EGFR, KRAS, BRAF 변이 검사, 암의 치료 반응을 모니터링하는 플랫폼을 개발하고 있다. 미세유체시스템 기반 순환종양세포 및 엑소좀(exosome) 분리 기술 개발도 활발하다. 더 이상 액체생검은 불과 몇 년 전에 예측했던 미래 유망 기술이 아니다. 액체생검을 활용한 연구 결과와 제품 개발에 대한 보고들이 쏟아지고 있다. 암 줄기세포 연구, 암 유전체, 암 대사작용, 암 미세환경 리모델링, 면역감시 균형을 활용한 면역 항암제 개발, 일주기 리듬을 고려한 항암치료, 마이크로바이옴에 의한 항암제 약물대사 조절 및 대사산물의 중요성, 엑소좀을 통한 암 신호 교환, 전달 등 암 생물학을 시스템적으로 이해하기 시작했고, 이를 기반으로 한 항암제 개발 시장도 확대되고 있다. 하지만 여전히 암은 질병에 의한 사망률에서 수위를 내어주지 않고 있다. 전이성암에 대한 이해 부족은 전이암을 표적으로 한 약물 개발의 한계를 가져오고, 인체 생리활성을 고려한 전임상시험 모델이 없다는 것 또한 항암제 개발을 더디게 하는 주원인이 된다. 이를 해결할 대안으로서, 액체생검의 임상적 응용 잠재성과 중요성을 구체적으로 살펴보고, 특히 순환종양세포 분리 기술의 최신 동향과 임상적 가치를 가늠할 수 있는 연구 결과를 폐암 모델을 중심으로 정리하고 향후 동향을 전망해보고자 한다.
2. 본론
2.1. 액체생검
2.1.1. 조직생검의 임상적 한계를 극복할 수 있는 액체생검
인체의 혈액, 뇌척수액, 침, 땀, 소변, 객담, 흉수(흉막 삼출액, pleural effusion) 등 다양한 체액에는 임상적으로 가치가 높은 검체가 존재한다. 체액 내 존재하는 검체를 액체생검(liquid biopsy)이라 한다[1]. ctDNA, 엑소좀, 순환종양세포가 대표적인 액체생검이다. 체액 시료의 임상적 중요성은 오래전부터 주목받아왔지만, 이를 검출하는 기술의 한계와 생물학적 분자 기작에 대한 이해 부족으로 실제 임상에서 활용되기에는 한계가 있었다. 하지만 체액 내 극히 낮은 농도로 존재하는 핵산, 단백질 및 특정 세포들의 분리, 분석 기술이 발전하고 ctDNA, 엑소좀, 순환종양세포와 같은 검체의 생물학적 특성을 이해하게 됨으로써, 체액 내 잔존하는 이들의 임상적 가치가 새롭게 조명받고 있다. 조직생검(tissue biopsy)은 암 진단 시, 병리생리학적 판단의 표준 기준이 된다. 하지만 종양은 성상, 세포주기, 유전변이, 분화, 약물 반응성 면에서 다양한 세포 집합체이기 때문에, 종양의 국소 부위를 분석하는 조직생검은 원발암의 특질을 모두 대변할 수 없다. 때문에 진단과 치료 결정에 한계가 있다. 대개 침습적인 방식으로 검체가 준비되고, 그마저도 발암 부위에 따라서 제한적이기도 하다. 반면, 액체생검은 원발암의 정보를 간직하고 있고 비균질적 전이성암의 분자 수준의 다양성을 포착해낼 수 있다. 비침습적인 방법으로 암의 조기진단, 항암치료 반응 모니터링, 재발 및 예후 예측이 가능하다. 액체생검으로부터 확보한 환자의 유전체 정보를 기반으로 치료 전략을 수립하고 임상 가이드라인을 보다 신속하고 정확하게 제공할 수 있다는 점에서 정밀의학, 맞춤형 치료가 가능하다. 현재까지는 임상적 가치가 높은 액체생검 중 ctDNA, 엑소좀, 순환종양세포에 대한 연구개발이 가장 활발하다. 순환종양세포는 체외배양을 통해, 실험관 수준에서 원발암 모델링이 가능하다는 점에서 임상적 가치가 매우 높다. 순환종양세포를 통하여 인체 생리활성을 재현할 수 있는 수준으로 배양된 세포 집합체는 미세유체시스템, 3D 바이오프린팅, 유전체 분석 기술과 접목되고 있다. 순환종양세포 기반 종양 오가노이드 플랫폼을 통해 항암제 스크리닝 및 신약 개발이 가능하다.
2.1.2. 액체생검의 임상적 가치
액체생검은 조직생검의 한계를 보완할 뿐 아니라 다양한 활용 잠재성이 있다. 다양한 가능성을 지닌 액체생검이 상용되기까지 해결해야 할 주요 과제들도 남아 있다(표 1).
표 1. 액체생검의 활용 잠재성과 한계점
액체생검의 활용과 한계
활용
잠재성
비침습적인 검체 준비
암 조기진단 가능
전이성암의 분자적 비균질성 포착 가능
암의 발병, 진행 중 유전변이 규명 및 추적 가능
치료 과정 중 암의 병리, 생리적 변화 반응 모니터링 가능
약물내성 및 재발 예측 가능
조기진단, 치료 반응 모니터링을 통해 효과적인 치료 결정 지침 마련 가능
유전체 프로파일링 기반 맞춤치료, 정밀의학 가능
한계점
액체생검 내 시료 분리 기술 및 염기서열 분석 기술의 한계
액체생검(ctDNA, 엑소좀, 순환종양세포 등)의 기초생물학, 분자 기전 이해 부족
비균질적인 순환종양세포의 분리, 검출, 분석, 배양 기술의 한계, 표준화 방식 부재
액체생검은 검증된 신속한 진단을 통해 환자 치료 결정을 개선하는 것 이상으로 가치가 높다. 그중에서도 체외배양을 통해 다양한 암의 모델링이 가능하다는 점에서 순환종양세포의 임상적 가치가 더해진다. 암 모델링을 통해 암 생리활성 이해의 차원을 높이고, 항암제 개발 플랫폼으로 활용 가능하다. 원발암에서 비롯된 순환종양세포는 모세포의 성질을 간직하고 있어서, 암세포 클론 다양성을 이해하고 암 진행 또는 치료에 따른 암세포 클론 진화(clonal evolution)를 포착하는 데 주요한 단서를 제공한다. 암의 진행과 전이, 항암제 내성, 재발 과정을 고려한 치료 접근을 위해서 순환종양세포의 생성, 이동, 면역체계 교란, 확산, 전이 정착 기작을 분자 수준으로 이해하는 것이 필수적이다(그림 1).
그림 1. 순환종양세포의 생성, 전이, 확산, 잠복, 전이 정착[2~5]. 다양한 세포로 구성된(클론 다양성) 고형암 세포 중 일부가 혈관 내 침투(intravasation)를 통해 혈류를 순환하기 시작함. 상피간엽이행(EMT)를 거친 암세포 및 상피성 암세포는 종양 혈소판(TEP, tumor-educated platelet), 대식세포, 활성 기질세포와 융합된 상태로 혈관 내로 들어가기 때문에 다양한 표현형의 순환종양세포로 존재함[3]. 암세포 자체의 손상, 사멸 상태 및 순환종양세포 군집(circulating tumor microemboli) 유무에 따라서 추가적인 비균질적인 성향을 보임[5]. 면역 저항성을 획득한 순환종양세포는 암 친화성 니치 환경을 조성하고 간엽상피이행(MET)을 통해 혈관 외 침투(extravasation)하고 정착하게 됨. 잠복기를 거쳐 거대 전이(macrometastasis)를 일으키기도 하고 전이 촉진 신호와 생존 신호를 조절하면서 항암제 내성을 획득하고 암 클론 진화를 거치기도 함. 순환종양세포는 완전한 전이 정착(overt colonization)에 이르러 임상적 병변으로 나타나기까지 많은 장애물을 극복해야 함. 따라서 전이성암 치료를 위해서는 순환종양세포의 생존, 진화, 종양 생성 능력에 영향을 미치는 분자 기작을 이해하는 것이 매우 중요함.
2.2. 순환종양세포
2.2.1. 순환종양세포의 생성 및 액체생검으로서의 가치
순환종양세포는 원발암과 전이 병변으로부터 떨어져 나와 순환계에 존재하는 종양세포를 일컫는다. 암 진단 시, 악성종양세포는 이미 혈관 내로 침투하여(extravasation) 혈류를 따라 돌아다니고 있을 확률이 높다. 순환종양세포는 발암 부위에서 멀리 떨어져 있는 다른 장기에 전이 정착(colo-nization)하고 새로운 암을 퍼뜨리는 핵심 전령이자 전이성암의 씨앗이다. 순환종양세포는 혈액세포 10억 개당 2~3개 꼴로 검출될 정도로 극소량이다. 그마저도 암 줄기세포, 간엽세포, 기질세포, 혈관세포 등 다양한 암세포군으로 이루어져 있는 고형암의 특성상(종양 비균질성, tumor heterogeneity), 원발암의 특질을 간직한 순환종양세포의 분자 기전을 이해하는 것이 중요하다. 다양한 암세포군에서 순환종양세포의 생성, 상피간엽이행(EMT)과 암 줄기세포능, 혈관 내 침투, 확산 암세포(dissem-inating cancer cell)의 특징, 우리 몸의 면역감시체계 변화 유도, 전이가 용이한 암 미세환경 리모델링 기작, 잠복성 전이, 완전한 전이 정착 등 순환종양세포의 생물학을 분자 수준에서 이해하는 것은, 암을 조기에 진단하고 전이성암에 대한 포괄적인 치료 전략을 짜는데 매우 중요하다(그림 2).
그림 2. 액체생검 내 순환종양세포의 임상적 활용. 진단과 임상적 활용을 위해서는 환자 순환종양세포를 높은 순도와 정밀도로 분리, 농축하는 기술이 필요함. 높은 순도, 정밀도, 생존율로 분리된 순환종양세포는 고처리 분석, 체외배양의 가능성을 높여줌. 체외배양 기술의 발전은 미세유체시스템, 3D 바이오프린팅 기술과 융합되면서 암 오가노이드 기반 항암제 스크리닝 플랫폼 및 환자 유래 암 스페로이드/오가노이드 xenograft 분석이 가능해짐. 순환종양세포 기반 암 모델링은 전이성암 세포주 및 암 오가노이드 바이오뱅크를 통해 환자 유전체 정보 기반 맞춤형 치료 지침을 실제 임상 현장에 제공할 수 있음.
혈중 순환종양세포의 농도와 전이성암 환자 사망률의 관련성은 여러 사례로 보고되었다. 특히 소세포폐암(SCLC) 환자의 경우, 다른 폐암 유형에 비해 순환종양세포가 10배 이상 많다. 이는 암 유형별로 원발암, 전이성암세포, 암 미세환경 모두 치료 전략의 대상으로 삼아야 치료 성공률을 높일 수 있음을 말해준다. 암의 씨앗과 토양 모두 고려해야 하는 셈이다(그림 1). 환자의 순환종양세포는 혈중 농도를 산출해 진단 지표로 실제 임상에서 활용하는 것 이상으로 생체 외 배양이 가능하다는 점에서 가치가 높다. 체외배양을 통해 암세포를 확장시키고, 종양 오가노이드로 배양 가능하다. 종양 오가노이드를 통해 인체 생리활성을 재현한 수준으로 전이성암 모델링이 구현되면, 암 전이의 분자 기작 연구가 가능하다. 미세유체시스템과 융합되어 항암제 스크리닝, 신약 개발 플랫폼으로 활용할 수 있다는 점에서 더 큰 가치가 있다(그림 2).
개발 중인 신약의 유효성 평가에 필수적인, 인체 생리활성을 재현한 전임상시험 모델은 여전히 부족한 실정이다. 이는 곧 항암 신약 개발 중 높은 실패율과 비용 증가의 주요 원인이 된다. 3D 세포배양 기술 및 오가노이드 배양 기술의 발전으로 환자의 암 조직으로부터 체외배양한 암 오가노이드가 미세유체시스템과 접목되면서 항암제 유효성 평가 및 스크리닝을 위한 새로운 플랫폼으로 개발되고 있다. 배양한 암 오가노이드는 환자 암 조직의 유전체 분석과 배양 암 오가노이드의 유전체 정보를 비교 검증하여 바이오뱅킹으로 활용될 수 있다(그림 2). 이는 유전체 기반 항암제 스크리닝에 활용된다. 대장암, 유방암, 전립선암, 전이성 소화장관암 환자 원발암의 비균질적인 특성이 재현된 암 오가노이드 바이오뱅크가 구현되었고, 인체 생리활성을 고려한 유전체 기반 대규모 항암제 스크리닝이 가능해졌다[6~9]. 현재는 대부분 암 조직생검에 기반한 연구이지만, 체외배양을 통한 암 모델링이 가능하다는 점에서 순환종양세포의 잠재적 가치는 매우 높다. 전립선암 환자의 순환종양세포로부터 암 오가노이드를 배양하여 안드로겐 수용체 저해 약물(enzalutamide)과 PI3K 신호 억제제(everolimus, BKM-12)에 대해 약물 유효성을 검증하기도 하였다[10].
암모델개발기관(human cancer model initiative, HCMI)은 영국암연구소(Cancer Research UK), 후버레흐트 오가노이드 기술 재단(foundation Hubrecht Organoid Technology), 웰컴 트러스트 생거 연구소(Wellcome Trust Sanger Institute, WTSI)가 함께 참여한 컨소시엄으로, 차세대 암 연구 모델 개발을 위해 미국 국립암연구소(National Cancer Institute, NCI)의 지원을 받고 있다. HCMI는 현재, 환자 오가노이드 바이오뱅크 기반 약물 효능 및 독성 코호트 임상시험을 수행하고 있다. 이러한 큰 흐름은 조직생검 유래 암 오가노이드와 함께 순환종양세포 암 오가노이드가 약물 개발에 활용될 수 있음을 시사한다. 전이성암의 진단 및 예후 예측, 항암제 개발 플랫폼 개발, 전이성암 환자 개인별 유전정보 기반 맞춤형 치료 및 정밀의료의 가능성을 높여준다. 순환종양세포의 중요한 임상적 가치 때문에 이를 분리, 농축하는 기술이 개발되고 있지만, 이질적 다양성을 띤 순환종양세포를 순도 높게 분리, 농축하는 기술적 한계는 여전히 극복해야 할 핵심과제이다(그림 2). 순환종양세포의 특성 이해 연구와 체외배양하는 기술 개발 또한 병행되어야 한다.
2.2.2. 순환종양세포 분리/농축 기술 동향
액체생검 내 극소량으로 존재하는 순환종양세포의 분리, 농축 기술은 특이성, 감도, 순도, 세포 생존율, 대용량 처리 등 임상적으로 활용 가능한 핵심 기준을 충족시켜야 한다. 기술개발은 크게 물리적 특성(크기, 세포 변형, 전하)과 생물학적 특징(세포 표면 단백질 표지인자 기반 양성, 음성 선별 분리)을 기반으로 하고 있다. 상피세포에서 유래한 순환종양세포는 백혈구에 비해 더 크고, 견고한 것으로 알려져 있다. 이를 기반으로 혈류 속도, 분리 필터 크기 및 견고성을 고려해 필터 방식으로 순환종양세포를 분리한다(그림 3A-b). 크기가 8~20μm로 다양하고 이질적 다양성을 지닌 순환종양세포를 모두 분리하기 힘들다는 단점이 있지만, 운용이 간단하고 순환종양세포군(cluster) 분리 효율이 높은 장점이 있다. 세포와 같이 극성화된 유도체(전기발생물질)는 직류/교류 전기장하에서 유전영동력(di-electrophoresis, DEP)이 발생한다. 세포의 유전영동력은 세포 조성(투과성, 전력용적, 전도율), 세포막 형태, 세포 유형, 크기, 생리 상태 등에 따라 달라지는데, 이를 이용하여 분리하기도 한다(그림 3A-b). 상피간엽이행(EMT)을 거친 암세포와 상피성 암세포는 모두 혈관 내 침투를 통해 순환종양세포로서 혈류를 순환한다. 순환종양세포는 종양 혈소판(TEP, tumor educated platelet), 대식세포, 활성 기질세포, 백혈구와 융합하여 다양한 표현형으로 나타난다[3]. 순환종양세포 자체의 손상, 사멸 상태 및 군집(circulating tumor microemboli)에 따라 다양한 비균질적 성향을 보인다[5]. 이러한 비균질적인 생물학적 성질을 포착하기 위해 다양한 상피성 암 표지인자(EpCAM, cytokeratin), 암 줄기세포 표지인자(CD44, CD133, ALDH)[11], 간엽성 표지인자(Vimentin, N-cadherin, Cadherin11), 상피-간엽성 표지인자(plastin3)[12]와 같이 표면 단백질 발현에 따른 양성 선별, 혈구 세포의 음성 선별을 통해 분리한다(그림 3A-a). 최근에는 크기, 밀도와 같은 물리적 성질과 세포 표면 단백질 발현 유무 등 다양한 특성을 병용/융합하는 방법이 개발되고 있고(그림 3A-c)[13], 미세유체시스템을 통해 순환종양세포 농축 효율을 높이기 위해 다양한 미세유체 칩이 고안되고 있다(그림 3B).
Veridex와 J&J사가 개발한 CellSearchTM system은 혈중 순환종양세포를 EpCAM 발현 기반으로 포획하는 기술로, FDA 승인을 받은 표준시험법이다. EpCAM 기반 CellSearch 기법으로 분리한 환자 혈중 순환종양세포와 종양 조직 크기 이미지 반응 평가 결과가 강한 상관관계를 보였으며, 전이가 일어난 전립선암, 유방암, 대장암 환자들의 진단과 모니터링에 활용되고 있다(그림 3B-a). 실리콘 기반 수천 개의 마이크로포스트를 미세가공하여 EpCAM 항체와 떠다니는 혈중 순환종양세포가 더 잘 결합할 수 있도록 CTC-Chip이 고안되었다(그림 3B-b). 이후 분리 효율을 높이기 위해 나노혼합기 및 나노물질을 활용한 수많은 미세유체 칩 기기들이 개발되었다[15]. Mehmet Toner 그룹이 개발한 헤링본(herringbone) 무늬 칩(CTC-HB Chip)은 항체가 코팅된 표면에 순환종양세포가 더 잘 포획되도록 개발한 시스템이다(그림 3B-c). CTC-vortex Chip은 마이크로 단위 회오리-관성집중 현상을 이용한 크기 기반 분리 방식의 미세유체 칩으로, 57~94%의 순도로 순환종양세포를 분리하였다(그림 3B-d). Mehmet Toner 그룹에서 고안한 CTC-iChip(그림 3B-e)은 크기 기반으로 백혈구(WBC)와 순환종양세포가 포함된 말초혈액단핵구(peripheral blood mononucleated cell, PBMC)를 분리 후, 관성집중 현상을 이용, 세포를 일렬로 배열한 다음 미세유체 채널을 통과시키면서 백혈구 표면 표지인자 CD45 항체 코팅 자성비드로 백혈구를 제거하는 음성 선별 방식으로 순환종양세포를 분리했다[16]. CTC-HB Chip과 CTC-iChip은 순환종양세포 군집, 혈소판이 부착된 순환종양세포군(CTC cluster)을 분리하는 데 유용하게 활용되었다[17, 18]. Cluster-Chip(그림 3B-f)은 여러 순환종양세포가 혼재되어 있는 순환종양세포 군집을 분리하기 위해 전단응력을 낮춘 트랩을 고안하였고 유체를 역방향으로 흘려줌으로써 회수하는 방식을 취했다[19].
그림 3. 순환종양세포 분리, 농축 기술 비교 분석[5, 13, 14]. A. 순환종양세포 분리, 농축 기술 원리. 비균질적 다양성을 지닌 순환종양세포는 물리적 특성(크기, 변형, 밀도, 전하)과 생물학적 성질(특이적 세포 표면 단백질 발현)을 기반으로 분리, 농축함. 이 성질들을 병용하여 활용함으로써 수득율을 높이기도 함. B. 순환종양세포 농축 효율을 높이기 위해 고안된 미세유체 칩. EpCAM 발현 기반 CellSearch system 개발을 기점으로 EpCAM 항체와 혈중 순환종양세포가 더 잘 결합할 수 있도록 다양한 Chip이 고안되었음. CTC-chip과 CTC-HB Chip이 대표적임. 유체 회오리 현상을 통해 크기 기반으로 분리한 CTC-vortex Chip, 모든 순환종양세포를 다 포획하기 위해 PBMC를 모두 분리한 후 백혈구만 음성 선별하여 제거하도록 고안된 CTC-iChip, CTC-Cluster를 포획하기 위해 고안된 Cluster-Chip이 있음. C. 암의 비정상적 대사작용 기반 순환종양세포 순환종양세포 농축 효율을 높이기 위해 고안된 미세유체 칩.
임상적으로 소량의 혈액 시료는 다양한 비균질성을 지닌 순환종양세포를 분석하기에 한계가 있을 수 있다. 이를 보완하기 위해 팔 정맥에, EpCAM 항체가 코팅된 GLUPI 나노검출기를 사용하여 생체 내 혈중 순환종양세포를 검출하기도 하였다. 백혈구성분채집술(Leukaphresis)을 응용하여 순환종양세포를 분리하는 시도도 있었지만, 매우 침습적인 방법이다[20]. 순환종양세포의 세포생물학적 특성 분석은 대개 세포 분석으로 이루어진다. 하지만 순환종양세포의 이질적 세포 구성은 세포 분석 시 문제가 된다. 폐암 환자의 혈액과 흉수에서 순환종양세포(전이성 악성 암세포) 검출 시, 중피세포(mesothelial cell), 신생세포 및 여러 활성세포와 순환종양세포를 세포 분석으로 분별하는 것이 쉽지 않다. 암세포는 호기성 해당작용을 통해, 미토콘드리아의 포도당 산화보다 비효율적이지만 빠른 속도로 ATP를 생산하면서 생존에 유리하게 대사활동을 조절한다. 이처럼 비정상적으로 증진된 암세포의 대사활동을 이용하여 순환종양세포를 분리함으로써 이 문제를 해결하였다. 형광으로 표지된 포도당 유사체(2-NBDG) 흡수가 증가된 세포를 선별하여 순환종양세포로 분리하였다. 200,000개의 마이크로웰이 가공된 칩으로 비소세포폐암 환자의 혈액과 흉수에서 2-NBDG(+)/CD45(-)/EthD-1(-)를 기준(CD45: 백혈구 표지인자; EthD-1: 사멸세포 표지인자)으로 고용량 처리 방식으로 순환종양세포를 분리하고 단일세포 염기서열 분석법으로 EGFR, KRAS, PI3CA 변이를 확인하였다[14]. 앞서 언급한 것처럼, 물리적 특성 차이 기반 분리 방식은 순환종양세포를 백혈구와 효과적으로 분리하는 데 있어 어려움이 있고, 세포 표면 단백질 발현 기반 방식은 암 유형별, 병 진행 상태, 치료 과정 동안 다양한 표현형으로 나타나는 모든 순환종양세포를 포괄적으로 다룰 수 없다는 한계를 안고 있다. 핵심은 임상 현장에서 손쉽게 확보할 수 있는 제한된 양의 혈액으로부터 다양한 표현형의 모든 순환종양세포를 포획할 수 있는 기술의 개발이다. 전이성암의 위험성 예측, 약물반응 및 질병 진행의 실시간 모니터링 등 임상 진단의 기준으로 활용하기 위해 통계적으로 유의미한 기준을 충족시킬 수 있도록 순환종양세포를 농축할 수 있어야 한다. 이를 구현하기 위해서는 미세유체시스템을 통해 분리 효율을 극대화하고, 백혈구를 음성 선별로 제거하는 방식이 이상적인 접근법이라 할 수 있다. 그리고 현재 기술 수준에서는 조기진단, 예후, 예측 진단의 목적에 맞게끔 순환종양세포 분리, 농축 기술을 적절히 운용하는 전략이 필요하다.
2.3. 폐암 순환종양세포
2.3.1. 폐암 환자 순환종양세포의 임상적 활용
폐암은 악성종양으로 발전될 위험성이 두 번째로 높은 암으로, 남녀 구분 없이 사망률이 높다. 현재, 폐암의 병기별 진단은 주로 컴퓨터단층촬영(computed tomography, CT)과 양전자방출단층촬영(positron emission tomography, PET)으로 확인한 영상판독 및 해부병리학적 진단으로 이루어진다. 하지만 이미지 해상도와 진단의 정확성 면에서 한계가 있다. 폐암 환자의 액체생검 내 순환종양세포의 분리, 농축 기술을 통해 진단과 치료의 새로운 가능성을 보여준 주요 사례들은 다음과 같다(표 2). 이 결과들은 진단과 치료 표적을 위한 새로운 바이오마커에 대한 필요성을 시사하고, 순환종양세포가 그 대안이 될 수 있음을 말해준다.
표 2. 폐암 환자 순환종양세포의 임상적 활용
폐암 유형
특징
순환종양세포
분리 기술
순환종양세포 분석 및 임상적 활용과 가치
비소세포폐암
NSC L C
선암 (Adenocarcinoma)
(40%)
비흡연자 공통 유형
1. CellSearch
NSCLC 환자 78%(N=41)에서 CTC 검출, 치료 후 CTC 감소, 생존율과 연관[21]
여성, 45세 미만 젊은층 호발
2. CellSearch
CTC와 전이암의 복제수 변이가 유사한 양상[22]
EGFR, ALK, ROS1, BRAF 유전자변이
3. CellSearch/ISET
ALK 재배열 변이 확인, ALK 변이 NSCLC 환자 모니터링, crizotinib 약물 반응 시험
편평세포(Squamous cell)
(25~30%)
흡연 연관성
4. CellSearch
NSCLC 환자 84%(N=37)에서 CTC에서 암 조직과 유사한 EGFR 변이 확인[23]
대세포암 (Large cell carcinoma)
(10~15%)
선암과 유사
5. HB-Chip/ CellSearch
헤링본 패턴으로 EpCAM 항체의 CTC 포획 확률을 향상시킨 미세유체 칩. 조직생검과 유사한 유전체 변이(T790M) 확인[24]
6. NanoVelcro Chip/CellSearch
온도로 조절하는 나노벨크로(NanoVelcro) 기반 CTC 분리, 조직생검과 유사한 EGFR L858R 변이 및 T790M 변이 확인[25]
소세포폐암(SCLC)
(10~15%)
흡연 연관성, 빠른 세포 성장, 전이 위험성
1. CellSearch
환자 85%에서 CTC, CTC microemboli 확인[26]
2.3.2. 폐암 환자 순환종양세포의 분석, 임상적 활용 및 질병 모델링
앞의 주요 연구 사례처럼, 폐암 환자의 순환종양세포는 개수를 산정하여 전이성암의 조기진단과 실시간 질병 모니터링으로 활용 가능하다(그림 4A).
폐암 특이적인 순환종양세포의 특성 분석은 표현형이 다양한 폐암 순환종양세포의 분리 기준과 정확한 임상적 활용을 위해 필수적이다. 순환종양세포는 전이성암의 씨앗으로 줄기세포의 특성을 띤 경우가 많고, 상피간엽이행 정도에 따라 다양하기 때문에 상피성/간엽성 표지인자로 검증해야 한다. 혈액과 더불어 폐암의 주요 액체생검으로서 흉수 내 악성종양세포(순환종양세포)는 검체로서 임상적 가치가 높다. 하지만 환자별 흉수 시료의 이질성, 순환종양세포와 중피세포(mesothelial cell) 및 백혈구 음성 분별 기술의 한계 등, 임상적 활용 기준을 충족시키기 위해 극복해야 할 과제가 많다. 폐암 특이적 순환종양세포를 분리하고 분석하기 위해 특이성이 높은 폐암 줄기세포 표지인자[11], 폐암 표지인자, 상피성/간엽성/상피-간엽성 표지인자, 음성 선택 분리 제거를 위한 중피세포[27, 28] 및 백혈구 표지인자들에 대한 검증 시험이 필요하다(그림 4B).
그림 4. 폐암 환자 순환종양세포의 분리, 특성 분석 및 유전체 분석을 통한 임상적 활용 및 폐암 질병 모델링. 폐암 환자의 혈액과 흉수 순환종양세포의 분석을 통해 질병 진단, 예후, 예측, 치료 전략의 근거로 활용 가능하고, 체외배양을 통해 질병 모델링 및 항암제 스크리닝 플랫폼으로 활용 가능함.
폐암 환자 순환종양세포는 유전체 분석을 통해 폐암 발암 유전자 및 항암제 내성 변이를 확인할 수 있다. 약물 반응에 대한 암세포 클론 진화를 모니터링함으로써 내성 기전을 파악하고 항암치료 효과를 높일 수 있다(그림 4C). 비소세포폐암 환자의 순환종양세포 실시간 모니터링을 통해 암세포 클론 진화에 대응한 항암치료 전략을 모델링해보았다(그림 4C). 엑손 21의 EGFR(L858R) 및 엑손 19 EGFR 결손 변이가 확인된 폐암 환자의 경우, 클론 1의 변이를 표적으로 1세대 타이로신 인산화효소 저해제(TKI)인 얼로티닙(erlotinib), 제피티닙(gefitinib), 아파티닙(afatinib)을 처방한다. 암세포 클론 1은 사멸하지만 이 항암제 내성을 지닌 EGFR(T790M) 변이가 있는 클론 2가 증식하게 된다. 치료 2단계에서는 이 변이를 표적으로 한 오시머티닙(osimertinib)이 처방된다. 클론 2에 대한 치료 반응성이 나타나지만, BRAF(V600E) 변이를 지닌 클론 3이 다시 증식한다. 순환종양세포의 실시간 모니터링을 통해 이 변이를 표적으로 하는 다브라파닙(dabrafanib)과 트라메티닙(trametinib)의 병용 치료를 감행할 수 있다. 최근 다양한 암에서 항암 면역치료가 제한된 동반진단 범주에서 뛰어난 치료 효과를 보여주고 있다. 비소세포폐암의 경우, 면역 체크포인트 단백질(PD-L1) 과발현이 확인된 환자의 경우, 펨브롤리주맙(pembrolizumab), 니볼루맙(nivolumab)과 같은 면역 체크포인트 저해제를 병용할 수 있다[29, 30].
분리 검출한 순환종양세포는 진단과 예후, 예측의 도구로서 매우 중요한 시료이지만, 체외배양한 폐암 스페로이드 및 폐암 오가노이드를 통해 전이성암 질병 모델링이 가능하다는 점에서, 또 미세유체시스템과 융합되어 랩온어칩(Lab-on-a-chip, 생체모방 장기 칩)으로 활용 가능하기 때문에 더욱 가치가 높다. 생체모방 폐 칩(Lung-on-chip), 폐암 칩(lung cancer-on-a-chip)은 폐암 질병 모델링을 통해 질병의 병리생리학적 분자 기작 연구, 항암제 내성 기전 연구, 항암제 스크리닝 등 다양한 임상적 활용을 가능하게 한다(그림 4D).
3. 결론 및 전망
암 치료의 난제는 전이성암 공략이 쉽지 않다는 것이다. 암의 전이는 줄기세포능을 지닌 암 클론의 혈관 내 침투, 면역체계 극복, 암 친화적 니치 리모델링 등 전신반응을 통해 발생하고 진화한다. 원발암과 멀리 떨어진 여러 장기에 전이되는 특이성은 다양한 유전자와 신호전달체계의 비균질적 다양성과 얽혀 있고 항암제 내성 효과도 고려해야 한다. 순환종양세포를 통해 원발암의 특성을 재현하고, 전이성암의 특성과 진화 과정을 모니터링함으로써 전이암의 생물학을 이해할 수 있고, 이를 표적으로 하는 치료 전략이 가능해질 것이다. 폐암 환자에 처방되는 백금 항암치료[Platinum-based chemotherapy: 항암제 시스플라틴(cisplatin), 카보플라틴(carboplatin), 옥살리플라틴(oxaliplatin) 화학치료)와 같은 약물의 병용 치료보다 폐암 유전자변이를 표적으로 한 타이로신 인산화효소 저해제(타세바, 이레사) 및 면역 체크포인트 항암제(키트루다, 옵디보)에 의한 치료 효과가 더 좋은 것으로 보인다. 백금 항암치료에 의해 흔히 발생하는 말초신경병증(peripheral neuropathy) 부작용에 대한 우려도 적다. 표적치료와 면역항암치료의 효과적인 병용 전략은 폐암의 유형별 조기진단, 병기별 병리생리학적 특성 분석, 질병 진행과 약물치료 반응 실시간 모니터링에 기반할 때 이상적이다. 또한 환자의 암 검체로부터 질병 모델링과 모델 암 기반 약물 스크리닝 플랫폼이 구현되어야 한다. 새로운 항암제 개발 및 유효성 검증 결과가 실제 임상 현장에서 유용하게 활용될 수 있도록 해야한다. 이러한 필수 요구조건을 충족시킬 수 있는 검체가 환자 액체생검 내 순환종양세포이다.
이러한 중요성에도 불구하고 다양한 표현형의 모든 순환종양세포를 분리, 농축하는 기술 개발은 쉽지 않다. 실제로, 원발암에서 떨어져 나온 순환종양세포는 종양 혈소판, 대식세포, 활성 기질세포, 백혈구 등과 혼재되어 있고, 다양한 순환종양세포군(CTC cluster)으로도 존재한다. 또한 항암치료에 따라 다양한 표현형이 추가된다. 때문에, 순환종양세포의 특징적 표현형이 가려지게 되고, 분리 분석법 개발의 걸림돌로 작용한다. 순환종양세포의 물리적 성질은 상대적으로 크게 변하지 않기 때문에, 양성 선별 방식보다는 물리적 특성 기반 미세유체시스템 기술을 통해 분리 효율을 높이고, 음성 선별 방식을 병용하는 접근이 합리적이다. 순환종양세포가 원발암의 특성을 충분히 대변할 수 있지만, 유전체, 후성유전체, 단백체, 대사체 변이 면에서 원발암과 차이가 있다는 점도 고려해야 할 사항이다. 순환종양세포의 복제수 변이는 원발암, 전이암과 유사한 반면, 점 변이는 상당히 다른 양상을 보이기도 하였다[22]. 분리한 순환종양세포의 정확한 특성 규명을 위해 단일세포의 유전체 및 전사체 염기서열분석과 후성유전체, 단백체, 대사체 분석이 필요하다. 이를 위해서 백혈구에 의한 노이즈 백그라운드를 줄이기 위해 순환종양세포 분리 순도를 높이는 것이 중요하다. 순환종양세포의 분자 특성 분석 정보를 실제 임상 현장에서 손쉽게 활용하기 위해서 순환종양세포 분리 기술 및 과정의 자동화 플랫폼도 중요한 이슈가 될 것이다. 암 유형별 순환종양세포의 체외배양 기술 개발과 각 장기별 발달 니치 및 암 친화적 니치 신호에 대한 이해를 통해 인체 생리활성이 재현된 암 오가노이드의 확립 또한 필요하다. 직면하고 있는 기술적 한계들이 다양한 접근과 활발한 연구개발을 통해 빠르게 극복되고 있다. 머지않아 전이성암의 조기진단, 예후, 예측의 핵심 액체생검으로서 순환종양세포의 가치가 더 높아질 것이다.
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