보고서 정보
주관연구기관 |
강원대학교 Kangwon National University |
연구책임자 |
임학태
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발행국가 | 대한민국 |
언어 |
한국어
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발행년월 | 1998-04 |
주관부처 |
과학기술부 |
사업 관리 기관 |
강원대학교 Kangwon National University |
등록번호 |
TRKO200200017499 |
DB 구축일자 |
2013-04-18
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키워드 |
감자.반수체.원형질체융합.체세포잡종식물.Potato.Protoplast fusion.Dihaploid.Somatic hybrids.
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초록
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새로운 감자품종을 육종한다는 것이 어려운 점은 유전자가 극도의 이형접합성으로 후대에서 다양한 유전분리가 일어나 선발육종에 의한 품종육종에 많은시간을 소요하게 된다. 반수체를 유기하는데 사용되는 약배양이나 기타 다른 방법은 이러한 이형접합성의 특성을 줄일 수 있다. 그러나 반수체간에 교잡이 어렵고, 성공하더라도유전적 다양성이 존재하여 선발에 많은 시간이 소요된다. 새로운 접근방법은 유기된dihploid 계통간의 원형질체융합방법에 의한 체세포 잡종식물체를 생산하는 것이다. 이는양친이 소유한 우수한 형질을
새로운 감자품종을 육종한다는 것이 어려운 점은 유전자가 극도의 이형접합성으로 후대에서 다양한 유전분리가 일어나 선발육종에 의한 품종육종에 많은시간을 소요하게 된다. 반수체를 유기하는데 사용되는 약배양이나 기타 다른 방법은 이러한 이형접합성의 특성을 줄일 수 있다. 그러나 반수체간에 교잡이 어렵고, 성공하더라도유전적 다양성이 존재하여 선발에 많은 시간이 소요된다. 새로운 접근방법은 유기된dihploid 계통간의 원형질체융합방법에 의한 체세포 잡종식물체를 생산하는 것이다. 이는양친이 소유한 우수한 형질을 한꺼번에 나타낼 수 있으면서도 체세포잡종 상태에서 영양번식이 가능하기 때문에 감자육종에 좋은 도구로 사용될 수 있다. 따라서 본 연구의 목적은dihaploid 계통의 선발과 특성검정, 반수체의 식물체 조직과 원형질체로 부터의 식물체 재분화, 다양한 방법에 의한 체세포잡종식물체 동정 및 선발, 체세포잡종 식물체의 효율적인 선발과 동시에 유전자의 도입을 위한 반수체의 형질전환 및 원형질체 융합에 이용의 가능성을검토하고자 한다.감자반수체는 포장상태에서 4배체 보다 활력이 떨어지고 생산성에 있어서도 훨씬 저조하였다. 그러나 가공성 같은 특성은 지속적으로 유지하고 있었다. 본 과제는 가공용 품종의 육종소재를 만들고자 하였기 때문에 가공성에 있어서 가장 중요한 비중을 중심으로 선발하였다. 선발된 계통을 생장점배양을 통해서 기내에 도입해서 유지하였는데, 조직배양상태에서도 생육이 저조했다. 반수체는 재분화율이 4배체 보다 훨씬 떨어지기 때문에 우선적으로 다양한 배지조성을 시도해 볼 필요가 있었다. 6개의 dihaploid 감자 계통인HIC-20, HW-12, HAT-9, HAT-22, HK-6 and HK-9를 다양한 식물생장조절제인 TDZ,IAA, BAP, GA3 와 zeatin을 사용하였다. 사용된 호르몬 조합을 크게 두가지조합, 즉, (1)TDZ 와 IAA (2) zeatin, IAA, BA, GA3 였다. 줄기 재분화율은 사용된 반수체계통, 절편체종류, 배지조합에 따라서 0에서 100%로 다양했다. 사용된 절편체 중에서 잎보다는 절간조직을 사용했을 때 대체로 재분화율이 높았다. 가장 높은 재분화율은 절편체가 zeatin 2,IAA 0.2, BAP 0.5, GA3 0,2mg/L 가 첨가된 RJM 배지에 치상했을 때 나타났다.몇몇 dihaploid 감자 계통으로부터 원형질체를 분리하였는데, Macerozyme R-10 1.0%,BSA 0.2%, Cellulase RS 0.25% 조건에서 가장 분리가 좋았다. 원형질체 융합을 위해서원형질체 수를 1×106/ml 로 조정한 뒤, 전기융합을 하였다. 원형질체융합에 가장좋은 전기융합조건은 AC 270V, DC 180-24OV 40 us 였다. PEG를 이용한 원형질체융합을 시도하였지만, 원형질체가 심하게 깨어졌고, 세포분열이 잘 일어나지 않았다. 융합된 원형질체를 SKM 배지에 배양하였는데, 배양방법은 40일동안 alginate bead 형태로 했을 때 가장좋았다. 융합된 세포들은 다양한 배지를 걸치면서 작은캘러스가 되었고, 다양한 배지조합에치상되어 줄기분화율을 조사했다. 10 가지 조합의 배지중에서 zeatin 2.Omg/l 이 첨가된RJM 배지에서 캘러스를 배양했을 때가, TDZ(0.1-0.3mg/l) 첨가 배지에서 보다 재분화율이높았다. 기존에 많이 사용되어온 SKM 배지보다 RJM 배지가 훨씬 좋았다. 가장 줄기재분화가 높았던 배지조성은 RJM에 zeatin 2, IAA 0.2, BAP 0.5, GA3 0.2 mg/l를 첨가한 조합이었다. 재분화된 식물체는 잡종강세 효과에 의해서 대부분 잡종식물체였다. 체세포잡종 식물체를 순화시켜서 포장에서 재배중이다. 그 중에서 HK 48 과 HAt9 조합에서 얻어진 체세포잡종식물체의 확인작업을 여러 가지 분석방법이 이용되었다. 기공세포의 엽록체수, Flow cytometry를 이용한 배수성 검정, 단백질, 형태특징, 특히 엽모양에 의한 동정이었다. 현재 포장에 재배중인 식물체의 농업적 특성을 곧 밝히게 될 것이다.원형질체 융합으로 얻어진 많은 개체를 모두 생화학적 또는 분자생물학적 방법으로 검정하는 것은 많은 시간과 비용을 요하기 때문에 항생제 내성 유전자가 도입된 형질전환 식물체를 이용하는 것이 효율적이다. 따라서 본 연구에서도 3가지 dihaploid 계통을Agrobacterium tumerfaciens (LBA4404:pBIB121:GUS)을 이용하여 형질전환에 성공했다.재분화 배지는 MS 기본배지에 zeatin 2mg/l, NAA 0.02mg/l, GA3 0.02mg/l, Kanamycin50mg/l, claforan 500mg/l 이 첨가되었다. PCR 검정에 의해서 확인된 형질전환된 식물체는 포장에서 재배되었고, 그 후대를 검정한 결과 괴경모두에서 GUS 반응이 보였다. 형질전환된 식물체의 원형질체와 GUS 유전자가 도입되지 않은 식물체의 원형질체를 융합시켜서 배양했을 때, 융합된 세포로부터 유래한 캘러스는 GUS 반응을 나타내었다. 따라서 마커 뿐만아니라 유용한 다른 유전자가 각각 도입된 양친을 융합양친으로 사용할 경우 유용한두 개의 유전자를 동시에 도입시키면서 선발효율성도 높일 수 있기 때문에 원형질체융합과형질전환을 동시에 시킬 수 있는 방법으로 활용될 것이다.
Abstract
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Breeding new potato cultivars are not easy task due to thehigh degree of heterozygosity in segregated populations in their offsprings, making itdifficult to selection breeding. Anther culture or any other means to produce haploidscan be used to reduce the heterozygosity. But there is sti
Breeding new potato cultivars are not easy task due to thehigh degree of heterozygosity in segregated populations in their offsprings, making itdifficult to selection breeding. Anther culture or any other means to produce haploidscan be used to reduce the heterozygosity. But there is still problems in this systemsuch as genetic variation in population. An alternative to these approaches can be theprotoplast fusion technique using dihaploid lines. Somatic hybrids, especially resultedfrom protopiast fusions are able to have outstanding traits from both parents. Thistechnique can be a very powerful tool for potato breeding in future. The purposes ofthis study were to select dihaploid clones with good traits, to estabilish the regenerationsystems from tissue and protoplasts of haploid lines, to select somatic hybrids based onvarious methods, and to establish genetic transformation system of dihaploid cloneswhich can be used as protoplast fusion partners.Leaf and internode explants of six dihaploid potato lines, HIC-20, HW-12, HAT-9,HAT-22, HK-6 and HK-9 were cultured on the plant growth regulators such as TDZ,IAA, BAP, GA3 and zeatin. Hormone combination was divided into two large groups(1) TDZ and IAA (2) zeatin, IAA, BA, GA3. Frequency of shoot regeneration wasranged from 0 to 100%, depending on the genotypes, types of the explant, and thehormone compositions. As for the shoot regeneration frequency, internode was a betterexplant in most of the media than leaf segments, but faster and more direct shootinduction was observed on leaf explants. Over 90% of regenerated plants with multipleshoots were observed in all of the genotypes, when cultured in RJM added with zeatin2, IAA 0.2, BAP 0.5, and GA3 0.2 mg/L.Protoplasts of several lines of dihaploid potato were isolated using MacerozymeR-10 1.0%, BSA 0.2%, Cellulase RS 0.25% and adjusted at 1×106/ml for finalconcentration prior to electrofusion (AC 270V, DC 180-240V 40 us). Fused protoplastswere cultured in the SKM medium in alginate bead form for 40 days, and microcalliwere obtained from the six combinations of the dihaploid potato fusion. Thesemicrocalli were cultured in the double layer with RJM and SKM for 30 days and thentested for their regeneration abilities using RJM medium supplemented with ten differenthormone combinations. In general, media supplemented with zeatin 2.Omg/1 weremuch better than those with TDZ (0.1-0.3 mg/l). The best medium for shootregeneration was RJM added with zeatin 2, IAA 0.2, BAP 0.5, and GA3 0.2 mg/l.Somatic bybrids between selected dihaploid clones were obtained and acclimatized topots. Identification of somatic hybrids were confirmed by counting numbers ofchloroplasts in the guard cells, ploidy level based on flow cytometric analysis,morphology, protein, and molecular markers. These somatic hybrids are in the fieldand production and further agricultural characteristics will be evaluated.Internode explants of three dihaploid clones were co-cultivated with Agrobacteriumtumerfaciens containing LBA4404:pBIB121:GUS. These explants were transferred to theMSII medium (zeatin 2mg/l, NAA 0.02mg/l, GA3 0.02mg/l, Kanamycin 50mg/l, claforan500mg/l). Transgenic dihaploid potato plants were confirmed by PCR. Putativelytransgenic plants were acclimatized to field condition, tubers harvested, and marker genewere expressed in all tissues including tubers. Protoplasts isolated from transgenicplants were fused with other non-transgenic potato lines, and somatic cells were shownto be positive in the GUS visible test.
목차 Contents
- 서론...6
- 연구재료 및 방법...9
- 연구결과...11
- 결론 및 고찰...28
- 인용문헌...29
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