보고서 정보
주관연구기관 |
경북대학교 KyungPook National University |
연구책임자 |
강신성
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발행국가 | 대한민국 |
언어 |
한국어
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발행년월 | 1998-04 |
주관부처 |
과학기술부 |
과제관리전문기관 |
경북대학교 KyungPook National University |
등록번호 |
TRKO200200018036 |
DB 구축일자 |
2013-04-18
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키워드 |
Vitamin E-succinate.Nitric oxide.세포분화.세포예정사 Protein Kinase C ?II.Vitamin E-succinate.Nitric oxide.Differentiation.Apoptosis.Protein Kinase C ?II.
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초록
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Nitric Oxide (NO)는 대식세포, 중성구 등의 면역계의 세포에서IFN-γ, LPS, cAMP-acivating agents, UV light, trauma 등에 의하여 발현이 유도되는inducible NOS(iNOS)에 의해 대량으로 생성되어 종양, bacteria, helminths, fungi 및 바이러스에 대한 사멸효과를 갖는 반면, 숙주자신의 조직과 세포에도 영향을 미쳐 endotoxin에 의한 저혈압과 췌장의 islet β세포의 파괴, glomeruli 및 joint 등에서 자가면역성 질환을 유발하는
Nitric Oxide (NO)는 대식세포, 중성구 등의 면역계의 세포에서IFN-γ, LPS, cAMP-acivating agents, UV light, trauma 등에 의하여 발현이 유도되는inducible NOS(iNOS)에 의해 대량으로 생성되어 종양, bacteria, helminths, fungi 및 바이러스에 대한 사멸효과를 갖는 반면, 숙주자신의 조직과 세포에도 영향을 미쳐 endotoxin에 의한 저혈압과 췌장의 islet β세포의 파괴, glomeruli 및 joint 등에서 자가면역성 질환을 유발하는 등의 손상을 초래할 수도 있다. 따라서, NO가 생체내에서 면역방어 분자로서 유효하게 이용되기 위해서는 체내에서 발생되는 NO의 양을 적절히 조절하는 기능이 필요하며,이를 위해서는 NO가 생성되는 신호전달체계의 규명이 필수적인 과정일 것이다.여러 세포에서 분화를 유도하는 인자들에 의해 iNOS 유전자의 발현이 유도될 뿐만 아니라 면역반응도 증강되며, iNOS에 의해 생성되는 NO가 분화를 유도하거나 apopotosis를유발시킨다는 보고도 있다. 그러나 사람의 단핵구세포 및 복강 대식 세포는 현재까지 알려진 LPS, IFN-γ, IL-6 등의 여러 가지 촉진제를 첨가한 배양 조건에서도 소량의 NO를생성하는 것으로 보고되고 있다. Vitamine E-succinate (VES)는 세포증식을 억제할 뿐만아니라 혈구세포의 분화를 조절하는 인자로서 알려지고 있으며 또, 최근에는 VES가 유방암및 백혈암 세포의 증식을 억제하고, apoptosis를 유도하는 것으로 보고되고 있다.따라서, 본 연구에서는 사람의 promonocyte인 U937세포에서 다량의 NO 생성을 유도하고, 그 유도과정에 수반되는 세포내 신호전달계를 분자수준에서 분석하는 것을 목적으로하였다. 혈관계세포의 생장 및 분화조절 인자로 알려지고 있는 VES를 U937 cell에 4일동안 처리하면서 세포의 증식 및 분화에 대한 효과를 분석하였다. 그 결과, VES 처리는 세포의 증식을 현저히 억제하였으며, 3일이후부터는 85% 이상의 증식억제를 나타내었다. 그리고, 이와함께 nitroblue tetrazolium (NBT) 환원능의 증가, 핵구/대식세포 특이 항원인CD11c의 U937 세포표면 발현의 증가 및 세포의 이주에 관여하는 fibronectin (FN)-수용체인 α5와 β1 단백질의 발현 증가 등의 단핵구세포로 분화된 특징을 나타내었다. 이러한결과들은 VES가 U937 세포의 단핵구세포로의 분화를 유도함을 시사하는 것이다. 또한,VES에 의한 U937 cell의 단핵구세포로의 분화 유도 과정 동안에 다량의 nitric oxide (NO)가 생성되었으며, LPS/IFN-γ에 의한 NO 생성에 비해 현저한 증가를 나타내었다. 뿐만아니라 VES의 처리와 함께 NO를 첨가 또는 억제함에 따라 VES에 의한 단핵구세포의 분화 유도가 각각 촉진 또는 억제되었으므로 U937 cell의 단핵구/대식세포로의 분화과정에서NO가 중요한 역할을 할 것으로 시사되었다. 이러한 세포분화의 진행과 더불어 VES 처리가 apoptosis도 함께 유발시킨다는 것을 관찰할 수 있었다. U937 cell에 VES를 처리하여배양한 후, confocal microscope로 형태적인 변화를 관찰하면, apoptotic cell들이 처리시간에따라 점차적으로 증가하는 것을 볼 수 있었으며, 그 수가 배양 4 일째에는 약 58%에 이르렀다. 이와같이 VES에 의해 유도되는 apoptosis 과정에서 PKC II와의 연관성을 알아본결과, 처리시간이 경과함에 따라 PKC-βII의 발현 및 막으로의 translocation이 증가하였으며, PKC의 억제제인 GF109203X를 VES와 함께 처리하여 PKC-βII의 활성을 억제하면apoptosis가 일어나지 않았다. 따라서, VES 처리에 의한 U937 cell의 apoptosis는 PKC-βII를 통해PKC-βII가 매우 중요한 인자로 작용한다는 것을 알 수 있었다.
Abstract
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Nitric oxide (NO) mediates physiological processes in manyorgans including the immune, nervous, cardiovascular, and pulmonary system. Inimmune system, cells produce large amounts of NO for several days by stimulation withIFN-γ, LPS, cAMP-acivating agents, UV light, trauma which induce the
Nitric oxide (NO) mediates physiological processes in manyorgans including the immune, nervous, cardiovascular, and pulmonary system. Inimmune system, cells produce large amounts of NO for several days by stimulation withIFN-γ, LPS, cAMP-acivating agents, UV light, trauma which induce the expression ofinucible nitric oxide synthase (iNOS). Such high-output NO production bymacrophages participates in some instances of cytotoxicity against tumors, bacteria,heliminths, and fungi as well as viruses. On the other hand, high-output NOproduction by macrophages may contribute critically to host autotoxicity, such as thehypotension associated with endotoxin shock, and the destruction of pancreatic islet βcells, glomeruli, and joints. Therfore, it is important to understand the mechanism ofiNOS induction and regulation.The low level of NO production by human monocyte and human peritonealmacrophages has been generally found under numerous different culture conditions andafter stimulation with numerous different agents. Recently, it has been reported thatcertain cells have been shown to be target and source of NO, and that NO inhibits thegrowth and induces the differentiation. Therefore, this project is aimed at the studyingthe regulation and signal transduction pathway for the production of NO frommonocyte using vitamin E-succinate (VES) which has been known for a potentmodulator of hematopoietic differentiation and apoptosis as well as an inhibitor of cellgrowth in vitro and in vivo.Effects of VES on the induction of differentiation and apoptosis of U937 cells, ahuman monocytic leukemia cell line, were examined. VES was found to act as anantiproliferative factor by inhibiting growth of U937 cell in a time-dependent fashion.VES, also induced monocytic differentiation as indicated by the increase in nitrobluetetrazolium reduction activity and the expression of monocyte specific cell surfaceantigen, CD11c and integrins α5 and β1. During VES-induced monocyticdifferentiation of U937 cells, nitrite was detected in culture supernatants. Monocyticdifferentiation was blocked by the treatment of a specific inhibitor for NO synthase,N-G-monomethyl-L-arginine. In contrast, treatment of cells with sodium nitroprusside,a NO generating agent, stimulated monocytic differentiation of U937 cells. Suggestingthat nitric oxide is an intermediator of VES-induced monocytic differentiation of U937cells.VES also induced apoptosis of U937 cells during monocytic differentiation asdetermined by DNA fragmentation and confocal microscopy. VES-induced apoptosiswas detected at day 2 of culture, and the number of apoptotic cells gradually increasedin a time-dependent manner. During VES-induced differentiation and apoptosis ofU937 cells accompanied activation of protein kinase C βII (PKC βII). Treatment ofU937 cells with GF109203X, an inhibitor of PKC, blocked VES-induced apoptosis.These results indicate that activation of PKC βII is involved in the regulation ofVES-induced apoptosis.
목차 Contents
- 1. 서 론...9
- 2. 연구방법...12
- 1) 세포배양...12
- 2) Fibroneotin-coated well의 준비...12
- 3) 세포증식율의 분석...12
- 4) 단핵구의 분화 및 활성화 검정...13
- 5) Western blot analysis...14
- 6) 반응질소 중간물질의 측정...15
- 7) electrophoretic mobility shift assay...15
- 8) DNA fragmentation assay...16
- 3. 결과...17
- 4. 고찰...31
- 5. 결론...35
- 6. 인용문헌...36
- 7. 논문발표 목록서...41
- 8. 자체평가서...42
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