초록 ▼

I. 제 목 재조합 혈전 관련 단백질의 생산공정개발 II. 연구개발의 목적 및 필요성 혈관질환의 주를 이루는 Atherosclerosis(동맥경화증)와 Thrombosis(혈전증)는 혈관의 비후 및 혈전의 형성으로 생명현상의 유지에 필요한 중요 영양 대사물질과 산소를 운반해야 하는 혈액의 흐름을 억제하여 그 vital한 기능을 저해함으로써 21세기에 있어 암, 교통사고 등과 함께 생명을 위협하는 주요 사망원인이 되고 있고, 또한 날로 그 사망률이 증가추세에 있는 중요 연구대상 질환이다. 인간이 건강한 생활을

I. 제 목 재조합 혈전 관련 단백질의 생산공정개발 II. 연구개발의 목적 및 필요성 혈관질환의 주를 이루는 Atherosclerosis(동맥경화증)와 Thrombosis(혈전증)는 혈관의 비후 및 혈전의 형성으로 생명현상의 유지에 필요한 중요 영양 대사물질과 산소를 운반해야 하는 혈액의 흐름을 억제하여 그 vital한 기능을 저해함으로써 21세기에 있어 암, 교통사고 등과 함께 생명을 위협하는 주요 사망원인이 되고 있고, 또한 날로 그 사망률이 증가추세에 있는 중요 연구대상 질환이다. 인간이 건강한 생활을 영위하기 위해서는 순환계의 원활한 유통이 매우 중요하다. 신체 내에서 혈액은 혈관을 통하여 각 조직에 영양물질이나 산소를 공급하므로서 생명을 유지해 나가는 것이다 평상시에 혈액으로부터 생성되는 혈전은 과다 생성되면 혈류를 방해하는 요인이 되며 혈관 벽에 부착ㆍ누적은 미세혈관에 침입하여 이를 폐쇄하므로써 고혈압, 뇌졸중, 동맥경화, 협심증, 심근경색, 폐경색 등의 각종 순환계 성인병을 유발하게 된다. 현재 국내에서 혈류 개선제로서 몇몇 알려져 있는 물질이 있으나 혈전에 직접 작용하기보다는 간접적으로 작용하는 것이 대부분이다. 뿐만 아니라 이들 거의가 동물이나 식물 유래의 물질이기 때문에 대량 생산하기에 매우 어렵고, 생산비가 높은 단점이 있다. 예를 들어 경구투여용 혈전용해제로 시판되고 있는 명심(신풍제약)과 용심(대도제약)은 모두 지렁이의 체단백질 유래의 물질로 약의 원료인 지렁이를 대량 생육하는 것이 용이하지 않으므로 고가로 지렁이의 가루를 일본으로부터 대량 수입하는 것으로 알려져 있다. 따라서 혈전용해제를 생산하는 미생물을 개발하고 물질을 대량 생산하여 생산비를 낮출 수 있다면 제품의 가격을 낮추는 것은 물론, 수입에 따른 외화의 소모를 줄일 수 있다. 한편, 혈전성 성인병은 병의 징후가 나타나기 시작한 후에는 치료가 매우 어려운 한계가 있다. 그러므로 혈전을 감소시키는 식품이나 약품을 상시 섭취하여 혈전에 의한 성인병을 미리 예방하는 것이 최선이다. 식품에 의한 성인병 예방에는 이미 몇몇 알려진 사례가 있다. 유산균을 이용한 유제품인 요구르트를 매일 식품으로 섭취하여 소화기계의 정장작용과 변비의 치료에 이용하는 것이나 기능성 올리고당을 식품에 첨가하여 비만방지를 위한 식품을 개발하는 것 등이 그 좋은 예이다. 이러한 예들을 참고해 볼 때 혈전용해효소를 생산하는 미생물을 이용하여 성인병의 예방과 이용 차원에서 식품화하는 것이 매우 바람직하다고 사료된다. III. 연구개발의 내용 및 범위 본 연구개발의 최종목표는 혈액응고와 혈전용해에 관련된 단백질의 기능을 규명하고 이를 토대로 진단 및 치료목적의 단백질 제재를 개발하는 것이다. 혈액응고에 관련된 주요 인자의 유전자로 형질전환시켜 얻어진 대장균 변이 균주와 변이 동물 세포주로부터 유용 활성단백질의 대량 생산 체계와 공정의 확립으로 혈액응고계 결핍환자의 진단시약, 치료제 등의 단백질 제재를 개발하고자 한다. 또한 혈전용해에 관련된 분야로는, 이미 확보된 혈전용해 활성을 지닌 균주로부터 단백질을 정제하여 생화학적 특성과 제반 성질을 규명하고 효소의 대량생산 공정을 통하여 뇌졸증, 뇌출혈과 같은 국지적 혈액응고 관련 질환이나 혈관 질환의 치료제를 개발하고자 한다. 본 연구의 목표를 달성하기 위한 방법으로서 재조합 단백질뿐만 아니라 혈액응고계 결핍환자의 진단 및 치료제의 대량 생산을 위한 방법으로서 전통식품 및 버섯 등으로부터 혈전용해효소를 분리하고 이를 이용이 가능하도록 개발하는 것이다. 이 목표를 달성하기 위하여 수행하여야 하는 세부 목표는 다음과 같다. 첫째, 경제적인 대량생산 방법을 확립하여야 한다. 본 혈전용해효소는 미생물을 배양하면 체외로 분비하는 효소이므로 물질의 회수는 그만큼 용이하다 할 수 있겠다. 그러므로 바이오리엑타를 이용하여 미생물을 대량 배양하면서 혈전용해효소를 대량생산할 수 있는 방법을 확립하여 효소의 생화학적 특성 및 동물 실험을 통한 유효성을 타진한다. 발효탱? 수 있으므로 이 과정에서 효율적인 대량정제 방법을 개발하여야 한다. 그리고 약제나 식품첨가제로 이용하기 위해서는 효소의 안정성이 뛰어나고 생체의 혈관내세서 혈전용해능을 발휘할 수 있어야 한다. 셋째, 정제된 효소를 식품으로 이용하기 위한 형태를 개발하고 이와 동시에 개발된 식품에 대해 풍미를 개선한다. 넷째, 대량생산 및 정제를 용이하게 할 수 있도록 유전자를 확보하고 재조합 균주를 얻는다. IV. 연구개발 결과 1. Tissue factor 유전자 발현 혈전 관련인자 Tissue factor유전자를 발현시키기 위하여 발현 vector인 pRSET에 cloning된 tissue factor를 E. coli, DH10B에 형질전환하고 재조합 plasmid를 함유하고 있는 clone을 선별하여 DNA를 분리한 후, 발현 균주인 BL21 DE3 균주에 형질전환시켜 발현을 유도하였으며, 선별된 균주가 자라고 있는 배양액에 IPTG를 첨가하여 발현을 유도하고, 3 시간동안 배양하여 각각의 균주에서 tissue factor의 발현여부를 확인 한 결과, tissue factor에 상응하는 약 37 kD의 단백질이 과량으로 유도되고 있음을 확인하였다. 발현된 Tissue factor 단백질을 세포에서 분리하여 활성을 가질 수 있도록 refolding 조작을 시행한 결과 활성을 나타내었다. 2. Factor VII 유전자 발현 사람의 혈액응고에 관련된 factor 중에 중요한 기능을 수행하는 factor VII을 동물세포에서 과량으로 발현시키기 위한 목적으로 사람의 간세포 세포주인 HepG2와 Hep3B 세포주로부터, total RNA를 분리하였다. 상기의 RNA로부터 cDNA library를 합성한 cDNA를 template로 하고 factor VII에 관한 특정 부위의 염기서열을 합성한 primer로 PCR을 수행하여 tissue factor에 대한 cDNA를 증폭하였다. 각각의 세포주에서 합성한 cDNA로 수행한 RT-PCR의 결과에서, factor VII의 full length에 관한 cDNA를 증폭시키지는 못하였으나, 3‘의 부위에 해당하는 light chain에 해당하는 부위는 증폭하여 cloning을 성공하였다. 위의 결과로부터, 간세포주에서 factor VII에 대한 mRNA가 상당히 적은 양으로 발현되고 있음을 알 수 있었고, 상대적으로 full length의 cDNA를 합성하는데는 어려움이 있는 것으로 사료되었다. 따라서 현재, 각각의 세포주와 사람의 간조직으로부터 추출한 mRNA로 cDNA library를 합성하고, 위 시료로부터 factor VII에 관한 cDNA를 증폭하여 동물세포에 대한 발현 vector에 cloning하여 상기 어려움을 해결하였다. 3. Fibrin zymography assay 방법 개발 Zymography 기술은 gel 상에서 활성을 지닌 효소를 직접 확인이 가능한 방법으로서 SDS gel 상에 단백질 기질을 직접 첨가하는 것으로 기존에는 casein 이나 gelatin을 이용한 기술이 많이 알려져 있다. 본 실험실에서는 기질로서 이들 대신 fibrin을 첨가하여 활성을 측정하는 방법을 새롭게 고안하였는데, 이 fibrin zymography 기술은 기존의 gelatin 이나 casein 보다 효소에 대한 특이성이 높을 뿐만 아니라 gelatin 이나 casein의 단점을 많이 보완한 기술이다. 뿐만 아니라 아주 미량의 단백질 (nanogram 수준) 로도 활성을 확인할 수 있어 효소 활성측정에 매우 유익하다. SDS-fibrin zymography 활성확인법은 본 연구실에서 최초로 개발한 것으로 fibrinogen의 농도가 0.12% (w/v)가 되게 polyacrylamide 용액에 혼합한 후 곧바로 thrombin (1 NIH unit/mL)을 첨가하여 fibrin-gel을 만든후 10mA의 일정한 전류를 걸어 전기영동을 실시하였다. 전기영동을 실시한 후 SDS에 의해 불활성화된 효소를 재활성화 시키기 위해 gel을 2.5% Triton X-100를 포함한 Tris 완충용액 (50 mM, pH 7.4)에 30분간 방치하여 SDS를 제거한 후단백질의 혈전용해활성은 활성반응 완충용액 (200 mM NaCl, 10 mM CaCl2, 0.02% NaN3가 포함된 30 mM Tris 완충용액, pH 7.4)에 gel을 침적하여 37℃ 배양기에서 12시간 반응을 시켰다. Fibrin 분해능을 지닌 단백질 분획은 활성염색법에 의해 gel 상의 fibrin을 분해하여 Coomassie blue 염색 결과 투명대를 형성하게 하여 활성을 확인하였다. 체내에 존재하는 fibrin 분해효소인 plasmin을 이용하여 fibrin zymography를 실시하였다. 60 kDa (plasmin 분자량)에서 아주 선명한 활성을 확인할 수 있었다. 특히 6.3 ng 이상의 단백질 농도에서도 활성측정이 가능한 것을 알 수 있었다. 더 나아가 본 실험실에서는 fibrin zymography 기술을 이용하여 균뿐만 아니라 여러 가지 물질에서 활성을 지닌 효소를 탐색하고자 이 기술을 이용하였다. 한국의 전통 된장에서 분리한 2종의 Bacillus sp. 균주로 부터 분비되는 수많은 단백질 중에서 활성을 지닌 4-5개의 단백질을 fibrin zymography와 reverse fibrin zymography를 통해 확인할 수 있었다. 기존에 많이 사용되고 있는 reverse fibrin zymography (fibrin indicator film을 사용) 보다 본 실험실에서 새로 고안한 fibrin zymography 기술이 훨씬 뛰어나다는 것을 입증해 준다. 그리고 버섯에서도 혈전용해효소가 존재한다는 것을 fibrin zymography gel 상에서 검증하였다. 4. 혈전용해 효소의 분리 및 정제 4-1. 균주의 선별 한국의 전통재래식 된장으로부터 fibrin plate 상에서 활성을 지닌 5종의 균주를 분리하여 동정한 결과 Bacillus sp. (B. subtilis DJ-1, B. atrophaeus DJ-2, B. licheniformis DJ-3, B. amyloliquefaciens DJ-4 그리고 B. pantothenticus DJ-5)로 밝혀졌다. 이중 활성이 높은 균주 (Bacillus atrophaeus DJ-2)를 선별하여 이 균주에 의해 분비되는 혈전 용해효소를 분리 정제를 시도하였다. 4-2. 혈전용해효소의 분리 및 정제 한국의 전통 재래식 된장으로부터 분리한 Bacillus atrophaeus DJ-2에 의해 분비되는 혈전용해효소를 분리 정제하기 위해 B. DJ-2를 1L tryptic soybean broth (TSB) 배지에 배양한 후, ion exchange chromatography (DEAE cellulose)와 gel filtration (Toyopeal HW 55F)을 거쳐 분자량 42kDa의 활성을 지닌 단백질을 순수 분리하였다. 정제된 단백질의 N-terminal 아미노산 서열을 알아본 결과, Bacillus subtilis에 의해 분비되는 bacillopeptidase F(bpf)와 N 말단 18 아미노산 서열이 100%의 상동성을 보였다. 따라서 B. atrophaeus DJ-2에 의해 분비되는 bpf를 bacillopeptidase DJ-2로 명명하였다. 4-3. Bacillopeptidase DJ-2의 효소특성화에 대한 연구 bpf DJ-2의 효소특성화를 연구한 결과 60℃에서 40% 이상의 열안정성을 보였으며, pH의 경우 10-11에서 아주 안정성을 나타내었다. 그리고 효소저해제에 대해서는 serine protease inhibitor인 PMSF에 의해 bpf DJ-2가 저해되었으며, EDTA나 leupeptin의 경우 거의 효소활성에 영향을 주지 않았다. 5. Amplification of genomic bpf Bacillus subtilis의 Bacillopeptidase F(bpf) 구조 유전자에 대한 유전자 체제가 Wu (1990)등에 의하여 밝혀져 있으나 이 bpf가 지니고 있는 효소 단백질로서의 활성에 대해서는 잘 밝혀지지 않은 기전으로 분자량의 크기로서만 말해지고 있는 상황이다. 본 연구팀의 연구결과에 의하여 특이적으로 fibrin을 가수분해시킬 뿐만 아니라 효소 활성면에서 매우 우수하다는 사실이 밝혀졌다. 따라서 본 연구에서는 Bacillus subtilis와 관련되는 균주로부터 상기의 bpf 유전자를 비교하고, cloning하여 발현되는 효소단백질 수준에서 나타나고 있는 processing을 규명하고, 이들의 효소 단백질은 즉시 산업적 응용이 매우 높은 것으로 판명되어 이들 단백질에 대한 연구 수행으로서 우선 위 유전자를 PCR로 증폭하여 cloning하고자 하였다. 각각의 균주로부터 추출한 gemonic DNA로 수행한 PCR의 결과는 그림 4에 나타내었다. bpful-5'과 bpful-3'의 primer로 수행한 PCR의 결과는 Bacillus atrophaeus에서는 특이적인 산물(2834 bp)이 증폭되었으나, Bacillus subtillis에서는 특이적 산물이 증폭되지 않음을 볼 수 있었다. 그러나 각각의 균주에서 분리한 genomic DNA를 bpf 유전자 내에 존재하는 특이적 염기서열로 합성한 primer에서는 각각의 크기 (1975 bp)에 해당하는 산물이 증폭되고 있음을 알 수 있었다. 위의 결과로부터 bpf 유전자의 구조는 각각의 균주에 동일한 염기서열을 갖는 것으로 추정 할 수 있었다. 그러나, 실험 결과로 각각의 균주에서 bpf 유전자에 대한 genomic 구조가 다름을 암시해 주고 있었다. Bacillus 균주로부터 증폭된 산물을 bpf-N/bpf-C, 혹은 bpf-mN/bpf-C의 primer로 수행한 PCR 증폭의 결과 각각 2548 bp와 1975 bp에 상응하는 산물이 증폭되었다. 위의 결과로부터, bpful-5'과 bpful-3'으로 수행하여 증폭시킨 산물이 bpf 유전자임을 간접적으로 확인 할 수 있었다. 6. Construction of expression plasmids containing bpf gene PCR을 수행하여 증폭된 각각의 DNA 절편에 대한 bpf 유전자의 발현을 E. coli, BL21 DE3 균주에서 과량으로 유도하기 위하여 E. coli 발현 vector인 pET22b에 codon을 맞추어 cloning 하였다. 각각 PCR 산물의 말단에 존재하는 제한 효소부위를 제한효소로 절단하여 insert 절편으로 삼았고, pET22b에 존재하는 BamHI과 XhoI 부위를 제한 효소를 처리하여 vector로 삼았다. 각각을 ligation시킨 DNA를 competent 균주인 E. coli, DH10B에 형질전환시켰다. Ampicillin이 함유된 배지에서 선별된 clone을 배양하여 DNA를 추출한 후, pET22b에 cloning된 bpf 유전자는 제한 효소의 처리로 확인하였다. 7. Expression of bpf gene in E. coli, BL21 DE3 재조합된 발현 plasmid를 발현용 균주인 E. coli, BL21 DE3 균주에 형질전환시키고, 각각의 clon으로부터 DNA를 추출하여 각각의 primer로 PCR을 수행하여 재조합된 bpf 유전자의 유무를 확인하였다. 선별된 균주가 자라고 있는 배양액에 IPTG를 첨가하여 발현을 유도하고 2 시간동안 배양한 후, 각각의 균주를 수거하여 SDS-PAGE를 수행하였다. 첫 번째 codon인 Met을 함유한 clone에서는 약 90 kD 단백질의 발현이 유도되고 있음을 보여주었고, 기존에 밝혀진 mature form을 함유하는 clone에서는 약 70 kD 단백질의 발현이 유도되고 있음을 확인할 수 있었다. 8. 우리나라의 전통 발효식품인 김치에서 혈전용해효소를 생산하는 미생물을 분리하고 그 중 Bacillus amyloiquefaciens, Bacillus brevis , Micrococcus luteus의 세가지 종을 Bergey's Manual of Systematic Bacteriology 등에 의하여 동정하였다. 분리된 미생물을 효소 유도 배지에서 배양한 결과 Bacillus amyloiquefaciens는 2.58 plasmin unit/mL, B. brevis는 1.48 plasmin unit/mL, 그리고 M. luteus는 2.03 plasmin unit/mL의서 생산된 세포외 단백질을 SDS-PAGE와 fibrin zymography assay에 의해 분석한 결과 B. brevis와 M. luteus에서는 서로 다른 분자량을 가진 3～4개의 혈전용해 효소가 존재하였으며 Bacillus amyloiquefaciens에서는 분자량이 약 29kDa인 단일 band의 혈전용해효소가 생산되었음을 확인하였다. 9. 우리 나라의 전통대두 발효식품인 된장으로부터 혈전용해능을 가진 5종의 미생물 균주를 분리하여 Bergey's manual of systematic bateriology에 준하여 동정한 결과 Bacillus sp.로 밝혀졌다. 이 중 Bacillus amyloliqrefaciens를 효소유도배지에서 배양한 결과 fibrin plate상에서 세포성장 초기 18 시간 대에서 가장 높은 효소활성(2.84 plasmin unit)을 보였고, plasmin의 기질(N-p-Tosyl-Gly-Pro-Lys-p-nitroanilide)에 대해서는 60 시간 대에서 가장 높은 specificity (0.21 plasmin uint)를 나타내었다. 이 균주에 의해 분비된 몇 종류의 세포외 단백질을 SDS-PAGE 분석과 fibrin zymography 활성확인법을 통해 7～8개의 혈전용해능을 가진 단백질을 확인하였다. 10. 혈전용해능을 가진 균류(버섯류) 5종 Daedaleopsis styracina, Trichaptum abietium, Coriolus versicolor, Pisolithus tinctorius 그리고 Tricholomopsis decora 등을 선발하여 혈전용해효소 활성을 측정하였고, 기질특이성을 조사하였다. 버섯 추출액을 조제하여 혈전용해도를 측정한 결과 plasmin 1.0 unit 보다 3～4배의 높은 활성을 보였으며, 그 중 Pisolithus tinctorius가 가장 높은 활성(4.71 plasmin unit)을 나타내었고, Tricholomopsis decora가 Plasmin에 대한 기질 N-p-Tosyl-Gly-Pro-Lys p-nitroanilide에 대해 가장 높은 특이성(1.32 plasmin unit)을 보였다. 버섯의 균사체로부터 추출한 효소를 SDS-fibrin zymography 활성확인법에 의해 분석한 결과 분자량이 54와 61 kDa의 공통된 활성을 가지는 단백질을 확인하였으며, Trichaptum abietium은 100 kDa의 그리고 Tricholomopsis decora 는 84 kDa의 강한 활성을 가지는 혈전용해효소를 확인하였다. 11. 전통 한국식품 된장으로부터 extracellular protease를 생산하는 Bacillus sp. strain DJ-4를 분리하였고 통상의 chromatographic technique을 이용하여 fibrinolytic enzyme (subtilisin DJ-4)를 동정하였다. 이 분리단백질을 SDS-PAGE와 fibrin zymography assay로 상대적 분자량이 29 kDa임을 밝혀냈다. 이 enzyme은 fibrin zymography상의 inhibitor assay와 chromogenic substrate를 사용한 amidolytic assay에 의해 serine protease로 확인되었다. 이 enzyme은 PMSF에 의해 억제되나 EDTA나 leupeptin에 의해서는 억제되지 않았다. 처음 14개의 amino acid들의 N-terminal sequence는 subtilisin BPN'과 같은 것으로 판명되었으나 이 subtilisin DJ-4의 효소활성은 subtilisin BPN'나 subtilisin Carlsberg의 활성보다 각각 2.2에서 4.3배 높은 것으로 나타났다. V. 사업수행 (연구개발) 결과의 활용계획 혈전성 성인병은 병징이 나타나기 시작한 후에는 치료가 매우 어려운 한계가 있다. 그러므로 혈전을 감소시키는 식품이나 약품을 상시 섭취하여 혈전에 의한 성인병을 미리 예방하는 것이 최선이다. 식품에 의한 성인병 예방에는 이미 몇몇 알려진 사례가 있다. 한가지 예로 유산균을 이용한 유제품 중 요구르트는 매일 식품으로 섭취하면 소화기계의 정장작용과 변비의 치료에 매우 좋은 효과를 거둘 수 있다. 최근에는 기능성 oligo당을 식품에 첨가하여 비만방지를 위한 식품을 개발하고 있다. 이러한 성인병의 예방과 이용차원에서 식품화하는 것이 매우 바람직하다고 사료된다.성인병 관련 식품으로 혈전 용해 기능을 갖는 제품은 국내는 물론 전세계적으로 존재하고 있지 않다. 그만큼 시장 잠재력도 크다고 할 수 있다. 따라서 혈전용해 기능을 갖는 새로운 식품을 개발하게 되면 위에서 예를 든 바 있는 유산균을 이용한 유제품(요구르트 등)이나 올리고당을 이용한 식품 못지 않은 높은 사업성이 예상된다. 식품 첨가제로 활용하여 발효 유제품, 청량제 음료 등 다양한 식품과 혼합하여 새로운 건강식품으로 기능성을 부여하거나, 기존의 드링크제에 첨가하여 차별화된 음료로 개발할 수 있다. 그러나 상품화는 제품에 대한 행정적 승인, 마켓팅 전략, 기업의 의지 등과 밀접한 관계가 있으며 제품화를 위한 연구에 기업의 주도적 역할이 필요하다.

Abstract ▼

Various bacterial strains that secret extracellular fibrinolytic enzyme were screened from Doen-Jang, a Korean traditional fermented food made by soybean. Five microbes of the screened were identified to be Bacillus sp. strains according to Bergey's manual of systematic bacteriology. The cultured fi

Various bacterial strains that secret extracellular fibrinolytic enzyme were screened from Doen-Jang, a Korean traditional fermented food made by soybean. Five microbes of the screened were identified to be Bacillus sp. strains according to Bergey's manual of systematic bacteriology. The cultured filtrates of B. amyloliquefaciens (2.46 plasmin unit/ml) and B. pantotheticus (3.82 plasmin unit/ml) showed a level of fibrinolytic activity that was about three times higher than that of plasmin 1.0 unit and Bacillus subtilis showed the highest fibrinolytic activity (4.94 plasmin unit/ml). All of the extracellular proteases showing the fibrinolytic activity are confirmed by SDS-PAGE followed by reverse fibrin zymogram activity assay and we proposed that some of the fibrinolytic enzymes from this work are novel enzymes. From the screened Bacillus sp. strain DJ-4, a fibrinolytic enzyme (subtilisin DJ-4) was purified. The relative molecular mass of the isolated protein was 29 kDa by SDS-PAGE and fibrin zymography assay. The enzyme was characterized as a serine protease by an inhibitor assay on the fibrin zymography gel and by an amidolytic assay using chromogenic substrate. The enzyme was inhited by PMSF, but not by EDTA or leupeptin. The first 14 amino acids of the N-terminal sequence were identical to that of subtilisin BPN', but the activity of subtilisin DJ-4 was 2.2 and 4.3 times higher than those of subtilisin BPN' and subtilisin Carlsberg, respectively. Same as Doen-Jang, various bacterial strains that secret extracellular fibrinolytic enzymes were screened from kimchi. Three microbes of the above strains were identified to be Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus brevis and Micrococcus lutues strains according to Bergey's Manual of Systematic Bacteriology. It was found that B. amyloliquefaciens, B. brevis and M. luteus produced 2.58, 1.48 and 2.03 plasmin unit/ml of fibrinolytic enzymes, respectively. All the extracellur proteases showing the fibrinolytic activity were confirmed by SDS-PAGE and fibrin zymography assay and we propose that some of the fibrinolytic enzymes from this work are novel enzymes. Five fungi (mushrooms), Daedaleopsis styracina, Trichaptum abietum, Coriolus versicolor, Pisolithus tinctorius and Tricholomopsis decora, were screened and examined the fibrinolytic activity and specificity. The extracts of mushrooms showed a level of fibrinolytic activity that was about 3-4 times higher than that of plasmin 1.0 unit. In particular, Pisolithus tinctorius showed the greatest enzyme activity (4.71 plasmin unit/ml) by fibrin plate assay, and the highest specificity (1.32 plasmin unit/ml) using chromogenic substrate (N-p-Tosyl-Gly-Pro-Lys-p-nitroanilide) by Tricholomopsis decora. And the same molecular mass 54 and 61 kDa showing the fibrinolytic activity obtained from all fruiting bodies were confirmed, and it was found that Trichaptum abietum and Tricholomopsis decora have a strong fibrinolytic enzyme with an apparent size of 100kDa and 84 kDa, respectively on SDS-fibrin zymography activity assay.

목차 Contents

• 제1장 서 론...21
• 제2장 국내 외 기술개발 현황...25
• 제3장 연구개발 수행 내용 및 결과...31
• 제4장 연구개발 목표 달성도 및 대외기여도...74
• 제5장 연구개발결과의 활용계획...79
• 제6장 참고문헌...80