초록 ▼

미생물을 이용한 생분해성고분자의 생산공정을 개발하기 위하여 Alcaligenes eutrophus 균주에서의 PHB 생합성 조절기작, 이를 이용한 PHB 와 공중합체인 P(HB-co-HV) 의 발효생산, 그리고 이의 분리정제에 관한 연구를 수행하였다.Alcaligenes eutrophus 균주를 각기 다른 영양소가 제한된 조건에서 배양하면서 니코틴아마이드 뉴클레오타이드(NAD, NADPH, NADP, 그리고 NADPH)에 의한 PHB 생합성 조절기작을 조사하였다. PHB의 비생성속도는 세포내 NAD(P)H의 농도와 NAD(P)H/N

미생물을 이용한 생분해성고분자의 생산공정을 개발하기 위하여 Alcaligenes eutrophus 균주에서의 PHB 생합성 조절기작, 이를 이용한 PHB 와 공중합체인 P(HB-co-HV) 의 발효생산, 그리고 이의 분리정제에 관한 연구를 수행하였다.Alcaligenes eutrophus 균주를 각기 다른 영양소가 제한된 조건에서 배양하면서 니코틴아마이드 뉴클레오타이드(NAD, NADPH, NADP, 그리고 NADPH)에 의한 PHB 생합성 조절기작을 조사하였다. PHB의 비생성속도는 세포내 NAD(P)H의 농도와 NAD(P)H/NAD(P) 값이 높은 생육조건에서 높았다. 질소원이 고갈되었을 때 NAD(P)H/NAD(P) 값이 가장 높았으며, 이로인하여 세포내 PHB 함량이 크게 증가함을 알 수 있었다. 이러한 뉴클레오타이드의 PHB 생합성에 대한 영향을 효소의 속도론적 측면에서 조사하였다. Citrate synthase 활성이 NADH 에 의하여 크게 저하되었는 데, 이로인하여 acetyl-CoA가 TCA경로 보다 PHB 합성에로의 대사가 촉진됨을 알 수 있었다. 한편, 세포내 NADPH 농도가 매우 낮아 PHB 합성 경로상의 NADPH-linked acetoacetyl-CoA reductase의 제한기질임을 알 수 있었다. 그러므로 PHB 생합성은 세포내 NADH 와 NADPH 농도 또는 NAD(P)H/NAD(P) 값이 가장 높을 때 증가함을 알 수 있었다. 유가식 배양에서 PHB 생산에 대한 연구를 수행하였다. 질소원에 대한 탄소원의 비가 높은 공급조액을 사용하였을 때, 탄소원이 PHB 합성으로 원활하게 사용됨을 알 수 있었다. 질소원으로 암모니아수를 사용하여 배양액내 pH를 7.0으로 조절하도록 공급하였을 때, 배지내 질소원이 고갈되지 않았으며 이때 세포농도는 최고 184 g/l 에 달하였다. PHB를 고농도로 축적하기 위하여 먼저 세포를 충분한 농도로 중식시키고 이어 질소원을 고갈시켜 PHB 축적을 야기하는 이단계 유가식 배양을 수행하였다. 최적조건에서 조업을 한 결과 50 시간 배양후 PHB 축적이 108 g/l 에 달하였으며 이때 세포내 PHB 함량은 80 % 이었다.P(HB-co-HV) 공중합체 생산을 위하여 포도당과 프로피온산 또는 포도당과 발레릴산(valeric acid)을 사용하여 Alcaligenes eutrophus NCIMB l1599 균주를 전술한 이단계 유가식 기법으로 배양하였다. 배양액내 포도당 농도가 충분하게 되거나 프로피오산의 공급이 제한됨에 따라 P(HB-co-HV)의 축적은 증가하였으나 공중합체중의 HV 분율은 감소하였다. 공중합체 생성단계시 프로피온산이 적절한 농도로 존재할 때 HV의 비생성속도는 0.013(g-HV/g-RCM/h)로 증가하였으나 프로피온 산이 축적됨에 따라 급격히 감소하였다. 따라서, HV 분율이 높은 P(HB-co-HV)를 생산하기 위하여는 배양액내 프로피온산 농도를 적절히 조절해야 함을 알 수 있었다. 포도당과 프로피온산을 최적화한 방식으로 공급하였을 때 50 시간 배양시 최대 P(HB-co-HV) 축적은 85.6g/l 이었으며 이때 HV 분율은 11.4 mol % 이었다. 한편 발레릴산을 P(HB-co-HV) 생합성을 위한 공중합체로 사용하였을 때, 공중합체의 비생성속도, 수율 그리고 HV 분율 모두 프로피온산을 사용하였을 때 보다 우수함을 알 수 있었다. 프로피온산을 사용하였을 때와 동일한 방법으로 이단계 유가배양을 수행하였을 때, HV 몰분율이 20.4 %로 높은 공중 합체를 90.4 g/l 축적할 수 있었으며 이때 생산성은 1.8 g/l/h 이었다.세포내 PHB의 분리방법으로 각기 다른 방법을 이용하였다. 유기 용매인 클로로포롬을 사용하였을 때 고순도로 회수가 용이하였던 반면 처리전 세포를 건조시켜야하며 유기용매를 최소 세포중량의 30 배 이상을 사용해야 함을 알 수 있었다. 단백질분해효소를 사용하여 PHB 이외의 세포를 분해하는 방법도 고수율로 PHB를 회수하는 방법이나, 처리전 세포의 열처리, 완충용액의 사용 등?안하였다. 적절한 조건(30℃, 1 h)에서 0.1 N 의 수산화나트륨 용액을 사용하여 40 g/l 의 세포를 처리하였을 때, 세포내 PHB를 손상하지 않고 고순도 (90.8 %), 고수율 (88.8 %)로 손쉽게 PHB를 회수할 수 있었다.

Abstract ▼

Regulatory mechanism of poly(β-hydroxybutyrate) (PHB) biosynthesis by nicotinamide nucleotide was studied. The levels of reduced forms of nicotinamide nucleotide(NADH and NADPH) were found to be high under the PHB accumulating condition. It was also found that NADH and NADPH inhibited citrate syntha

Regulatory mechanism of poly(β-hydroxybutyrate) (PHB) biosynthesis by nicotinamide nucleotide was studied. The levels of reduced forms of nicotinamide nucleotide(NADH and NADPH) were found to be high under the PHB accumulating condition. It was also found that NADH and NADPH inhibited citrate synthase of the TCA cycle while NADPH served as limiting substrate for the PHB synthesis. Their higher concentrations consequently accelerate biosynthesis of PHB. It is strongly suggested that a metabolic control to increase the levels of NADH or NADPH would significantly enhance the PHB biosynthesis since it can facilate the shift of metabolic flux of acetyl-CoA to the PHB synthetic pathway.It was observed that at a high ratio of carbon to nitrogen (C/N), carbon source was more preferably utilized for PHB synthesis, while its consumption for cellular metabolism appeared to be more favored at a low C/N ratio. For the mass production of PHB, two-stage fed-batch operations were carried out where PHB accumulation was stimulated by switching the ammonium feeding mode to the nitrogen limiting condition. A high production of PHB(108 g/l) with its content of 80 % could be obtained in 50 hr of two-stage fed-batch cultivation of Alcaligenes eutrophus. Control of propionic acid concentration in the medium was found to be one of the most important operating parameter for the production of poly(β -hydroxybutyrate-co- β-hydroxyvalerate) [P(HB-co-HV)] from glucose and propionic acid. With an optimally designed feeding strategy of glucose and propionic acid, a high titre of P(HB-co-HV)(85.6 g/l) with HV fraction of 11.4 mol % could be obtained in 50 hr of fed-batch operation. On the other and, valeric acid was found to be an efficient substrate to obtain a high HV fraction in the copolymer with a high yield. With the same fermentation strategy empolyed as with propionic acid, a product titre as high as 90.4 g/l with HV content of 20.4 mol % was obtained in 50 hr of fed-batch operation by feeding valeric acid in the copolymer accumulation stage. Use of organic solvent was found to be efficient method for PHB recovery with a high yield, but a larger quantity of solvent at least 33.3 vol/wt was required. A protelytic enzyme treatment was alternative method to recover cellular PHB efficiently, however, it was also known that, prior to the enzymatic digestion, the suspension should be thermally treated at least 80℃ to denature nucleic acids which otherwise hinder peparation of PHB. A novel and simple purification method for microbial PHB was developed. When 40 g/l of biomass was incubated in 0.1 N NaOH at 30 ℃ for 1 h, PHB of 88.4 % purity could be recovered with a yield of 90.8 %. This method can also offer a significant economic merit from process point of view that only a small amount of NaOH was sufficient to recover the microbial Polyester.

목차 Contents

• 제 1 장 서 론...17
• 제 1 절 총 설...17
• 제 2 절 연구의 목적...27
• 제 2 장 재료 및 방법...35
• 제 1 절 재료...35
• 제 2 절 방법...35
• 2-1. 배지...35
• 2-2. 배양방법...35
• 2-3. 분석방법...37
• 2-4. 세포내 cofactor 분석...40
• 2-5. 변이주 개발...41
• 2-6. PHB 분리...44
• 제 3 장 결과 및 고찰...47
• 제 1 절 Alcaligenes eutrophus 균주에서의 PHB 생합성 기작 연구...47
• 1-1. 세포내 nicotinamide에 의한 PHB 생합성 조절기작...47
• 1-2. 대사중간체와 아미노산 첨가가 세포내 cofactor 농도와 PHB 생합성에 미치는 영향...55
• 1-3. 탄소원의 PHB 축적과 관련 효소 활성에 미치는 영향...60
• 제 2 절 Alcaligenes eutrophus 균주에서의 P(HB-co-HV) 생산...64
• 2-1. 포도당과 프로피온산으로부터 P(HB-co-HV) 생산...64
• 2-2. 포도당과 발레릴산으로부터 P(HB-co-HV) 생산...69
• 2-3. 변이균주를 이용한 P(HB-co-HV) 생산...74
• 제 3 절 세포내 PHB의 분리정제 기술 개발...81
• 3-1. 유기용매를 이용한 PHB 분리정제...83
• 3-2. 단백질 분해효소를 이용한 PHB 분리정제...86
• 3-3. 알카리 용액을 사용한 PHB 분리정제...89
• 제 4 절 경제성 분석...98
• 4-1. 공정 개요...98
• 4-2. 연간 생산비 예측...99
• 4-3. 경제성 분석...105
• 제 5 절 기술정보분석...106
• 제 4 장 결 론...127
• 제 5 장 참고문헌...131
• 제 6 장 별첨자료...145