초록 ▼

I. 제목
해양미생물 유래 바이오폴리머 실용화 연구
II. 연구개발의 목적 및 중요성
최종목표: 해양미생물로부터 고부가가치의 신규 생명공학소재 및 제품으로 바이오 폴리머의 개발
해양미생물자원을 대상으로 유용성 평가, 특성분석, 대량생산 기술을 이용하여 신기능의 생체물질인 바이오폴리머의 산업적 이용기술개발을 통하여 해양생물자원의 지속가능한 이용 및 생물산업의 국가 경쟁력 강화를 도모한다.
해양 미생물은 해양 생태계의 물질순환에 있어 최종분해자로 해양환경의 주요 인자이며, 육상환경과의 상이성으로 의해

I. 제목
해양미생물 유래 바이오폴리머 실용화 연구
II. 연구개발의 목적 및 중요성
최종목표: 해양미생물로부터 고부가가치의 신규 생명공학소재 및 제품으로 바이오 폴리머의 개발
해양미생물자원을 대상으로 유용성 평가, 특성분석, 대량생산 기술을 이용하여 신기능의 생체물질인 바이오폴리머의 산업적 이용기술개발을 통하여 해양생물자원의 지속가능한 이용 및 생물산업의 국가 경쟁력 강화를 도모한다.
해양 미생물은 해양 생태계의 물질순환에 있어 최종분해자로 해양환경의 주요 인자이며, 육상환경과의 상이성으로 의해 다양한 물질의 생산이 이루어지고 있다. 특히 지구상의 생물종 중 80%가 해양에 서식하고 있으며 진행된 연구에서 해양동식물의 생리활성 물질중 대부분이 이들과 공생하는 미생물에 의하여 생성되고 있는 것으로 보고되는바, 해양미생물을 이용한 생리활성 물질, 고분자 물질의 생산과 이용에 대한 연구가 절실히 요구된 바, 미생물 유래의 다당류를 산업적으로 이용하려는 시도가 이루어져 왔으며, 특히 새로운 생물자원으로서 해양미생물에 의한 물질생산에 연구가 진행중에 있다.
미생물이 형성하는 바이오 폴리머는 중금속 흡착능, 유화안정능, 겔 형성능, 물흡수능, 접착능, 윤활능 및 필름 형성능 등의 광범위한 기능성을 가지고 있으며 이를 이용하여 화장품, 연마제, 접착제, 잉크, 페인트, 종이제조 등의 산업에 광범위하게 이용되고 있으며 이외 항암성 및 면역촉진 기능에 의하여 의약품의 고부가가치의 물질로 산업화의 잠재력이 크다. 특히 미생물 유래 바이오 폴리머 개발에 있어 호염성 세균이 생산하는 폴리머는 점도가 높고 조형성이 우수하며 극한 pH, 온도, 염분에 내성이 강하다고 보고된 바와 같이 호염성 또는 내염성의 해양미생물이 새로운 폴리머의 탐색원으로 관심이 집중되고 있다.
따라서 해양미생물을 이용한 바이오 폴리머 연구 및 실용화 기술개발은 화학산업을 대체하는 생합성 고분자물질의 개발을 통하여 국내 해양자원의 보전과 국가 생물산업의 경쟁력 재고를 위하여 필요하다.
III. 연구개발의 내용 및 범위
1. 바이오폴리머 생산 신규 미생물 확보
바이오필름, 해수 등에서 분리, 보존
2. 바이오필름 생성균주의 특성 규명
바이오필름 생성세균 동정
기질이용능 조사
생산능 조사
3. 바이오폴리머 생산능이 우수한 균주의 선별
바이오폴리머 분리 정제
바이오폴리머의 생산능 조사
응집활성 조사
유화안정능 조사
4. 바이오폴리머의 특성조사
Hahella chejuensis가 생산하는 EPS-R의 물성조사
IV. 연구개발 결과
1. Exopolysaccharide(EPS, 세포외다당류) 생성 세균의 분리 및 보전
다양한 EPS 해양미생물을 확보하기 위하여 시화호, 남해안지역, 황해 및 제주도 해역등에서 미생물 시료를 채취하였다.
가. 채취한 시료는 해양세균의 경우 biopolymer 생성균주의 비교분리를 위하여 Zobell, SZobell, DZobell 배지에 도말 한 후 3일간 25℃, 암배양하여 형성된 colony에서 육안관찰을 통하여 EPS 형성이 양호한 균주를 비교 선발하였다. 해양남조류의 경우 시료에서 균주 생존을 높이기 위하여 5 ㎛ cellulose membrane에 감압부착시켜 ASN-III 고체배지에 치상하여 20℃, 3,000 Lux, 16/8h 명조건에서 3주간 배양한 후 형성된 colony에서 육안 관찰을 통하여 EPS 형성이 있는 균주를 선발하였다.
나. 시화호 지역은 2000. 7. 20에서 2000. 7. 23까지 대부도 선착장에서 해수내 2 m 아래에 유리슬라이드를 설치하고 슬라이드에 biofilm을 형성하는 미생물을 대상으로 시료채취를 하여 해양세균 77 균주와 해양남조류 4 균주, 총 81 균주를 분리하였다.
다. 남해안지역은 2000. 8. 15에서 2000. 8. 24까지 생활하수 및 기타 오염물질의 유입이?성된 biofilm을 육안관찰한 후에 시료채취하여 해양 세균 678 균주와 해양남조류 603 균주, 총 1,281 균주를 분리하였다.
라. 황해 및 제주남서해역은 8, 9월에는 황해남부는 황해냉수가 형성되어 표층수가 빈영양 상태이고 저염 및 상대적인 부영양 상태의 양자강의 희석수와 고온과 고염의 대마난류와 전선지역을 형성하는 해역으로 2000. 9. 2에서 2000. 9. 8까지 12개 조사정점을 정하고 CTD를 이용하여 SCM을 기준으로 깊이별 시료를 채취하여 해양세균 332 균주와 해양남조류 4 균주, 총 336 균주를 분리하였다.
마. 분리한 균주는 보관을 위하여 해양세균의 경우 20% glycerol을 함유한 저장배지에 분리된 colony를 분산 후 영하 80℃에 보관하였다. 해양남조류는 5% DMSO를 이용, 영하 80℃에 보관하였다. 해양남조류의 경우 해양세균에 비하여 세포체계가 고도화되어 있어 균주보관 후 시료의 생존율이 매우 미약한 경우가 있으므로 보존후 생존율이 낮은 균주에 대해서는 다시 ASN-III 액체배지에 계대배양하면서 균주 보관하였다.
2. 바이오 필름 생성 세균의 분리, 동정 및 다당류 생성세균의 선별
가. 대호방조제에서 분리한 해양세균 139종을 대상으로 바이오필름 형성 여부를 조사하였다. 바이오 필름 형성이 우수한 해양세균으로 8 균주(98TH11316, 98TH11317, 98TH11318, 98TH11319, 98TH11320, 98TH11321, 98TH11322, 98TH11323)를 선별하였다.
나. 대호방조제에서 분리한 해양세균 균주동정 실험을 통하여 8 균주 중 4 균주 (98TH11318, 98TH11319, 98TH11321, 98TH11322)는 Micrococcus luteus와 가장 유사하였으며, 다른 4 균주는 각각 Bacillus megaterium (98TH11316), Bacillus thuringensis (98TH11323), Staphylococcus subsp. saprophyticus (98TH11317), Sulfidabacter pontiacus (98TH11320)과 유사한 것으로 확인되었다.
다. 대호방조제에서 분리한 해양세균을 대상으로 세포외 다당류의 생성 여부를 조사하였다. 선발된 98TH11316 (Bacillus megaterium)을 대상으로 세포외 다당류 생상을 조사한 결과 2 D.C.W(g/l)의 EPS를 생산하였다.
3. EPS 생성능이 우수한 균주의 선별
가. 1차 선별
분리한 균주는 해부현미경을 이용하여 세포외 다당류 생성이 양호한 해양 세균과 해양남조류를 1차 선별하였다. Colony의 점성여부를 해부현미경을 사용하여 육안관찰한 결과 남해안 지역 분리 균주에서 35 균주, 제주 및 황해해역에서 57 균주를 1차 선별 하였다. 해앙 남조류의 경우 남해안 분리균주에서 39 균주를 1차 선별하였다.
나. 2차 선별
1차 선별한 해양세균 92 균주, 해양남조류 39 균주를 대상으로 EPS생산에 대한 실험 결과 해양 세균의 경우 CJ12321이 6.95 EPS D.C.W.(g/l)로 가장 많이 EPS를 생산하였고 생산력지수로는 CJ 12244가 25.19로 가장 우수한 생산력을 보였다. 해양남조의 경우 CY25가 2.59 EPS D.C.W.(g/l)로 가장 양호하게 EPS를 생산을 하였고 생산력지수 또한 14.73으로 가장 우수한 생산력을 보였다.
4. 응집활성능 조사
1차 분리한 균주를 대상으로 응집활성을 조사한 결과 분리한 해양세균의 경우 CJ12364이 3.11(1/OD)로 가장 우수한 응집활성을 보였고 이 균주의 EPS생산은 6.59 D.C.W.(g/l)이었으며, 해양남조의 경우 CY5가 5.59(1/OD)로 가장 우수한 응집활성을 보였고 이 균주의 EPS생산은 1.86 D.C.W.(g/l)이었다.
5. 유화안정능 조사
1차 분리한 균주를 대상으로 유화안정능을 조사한 결과 분리한 해양세균의 경우 CJ12414이 가장 우수한 유화안정능을 보였고 이 균주의 EPS생산은 5.71 D.C.W.(g/l)이었으며, 해양남조? 균주의 EPS생산은 2.4 D.C.W.(g/l)이었다.
6. Hahella chejuensis가 생산하는 EPS-R의 물성
가. EPS-R의 0.25%에서 1.0%까지 농도에 의한 겉보기 점도의 변화는 농도가 증가할수록 겉보기 점도는 증가하였다.
나. 0.25 - 5.0% NaCl과 0.25 - 2.0% CaCl₂를 첨가하여 염농도에 의한 EPS-R의 겉보기 점도의 변화를 조사한 결과 NaCl의 경우 농도가 증가할수록 겉보기 점도가 감소하였고 CaCl₂의 경우 농도가 증가할수록 겉보기 점도는 증가하였다.
다. pH에 의한 EPS-R의 겉보기 점도의 변화를 pH2 - pH12에서 관찰한 결과, 산성조건하에서는 겉보기 점도가 감소하는 경향이 있었으며, pH10 이상에서 겉보기 점도가 급격히 증가하였다.
라. 열처리에 의한 EPS-R의 겉보기 점도의 변화를 조사한 결과, 60, 80℃에서는 겉보기 점도가 증가하는 것으로 보였으나, 100℃이상에서는 겉보기 점도가 급격히 감소하였다.
마. CaCl₂에 의한 EPS-R의 열안정성을 겉보기 점도로 조사한 결과, 겉보기 점도는 감소하였다.
바. 혼합 적합성 판단을 위한 gallan gum과 EPS-R과의 혼합에 의한 겉보기 점도의 변화를 조사한 결과, 혼합에 의한 겉보기 점도의 변화는 관찰되지 않았다.
V. 연구개발결과의 활용계획
분리선별한 다양한 바이오폴리머 생산균주의 특성규명 및 이용성을 조사하여 산업적 활용을 위한 연구를 수행한다. 해양미생물 정보시스템의 구축하여 분리된 해양미생물의 생물산업과의 연계를 위한 정보의 원활한 제공을 도모하며 관련분야의 지속적인 연구의 수행을 위하여 해양미생물의 분리, 보존체계를 D/B 화에 제공할 계획이다. 본 연구의 결과는 향후 해양미생물과 바이오폴리머와의 관계, 화학생태학연구에 대한 기초자료와 바이오필름 형성기작, 바이오폴리머 생산 미생물과 바이오 필름 성분분석기술이 축적될 것이다. 바이오폴리머의 응용성 연구를 위한 국내 연구진의 네트웍을 통하여 올리고머당 생리활성물질의 생산을 위한 목표물질로 활용할 계획이다.

Abstract ▼

I. Title
Application and development of biopolymer from marine microorganisms
II. Objectives and Significance
The final goal of this research is development of novel biopolymer from marine microorganisms and application technologies for its industrialization.
Marine microorganisms ar

I. Title
Application and development of biopolymer from marine microorganisms
II. Objectives and Significance
The final goal of this research is development of novel biopolymer from marine microorganisms and application technologies for its industrialization.
Marine microorganisms are important factors of the marine environment as they function as the degradative agents that converts organic material back to inorganic and mineral compounds. But they produce diverse materials different from those of terrestrial organisms by the specificity of marine ecological environment. Especially 80% of the organism families on the earth live in the marine and recent studies are showing that most of the bioactive compounds from marine animals and plants are produced by symbiotic microorganisms with them. So the study of bioactive compounds and macro molecules from marine microorganisms is being desperately required.
The biopolymer produced by microorganisms has been used in a wide range of industries due to its functions such as gel formation, emulsifying, absorption of heavy metal, cohesion, and film formation. In industry, it is used for making cosmetics, ink, paint, glues, etc, and has big industrialization potential for having high value adds in medical supplies such as anti-cancer and immune-enhancing agent. In the development of microbial biopolymers, halophile or halo-tolerant marine microorganisms are getting attractions as origin of a new polymer, as it has been reported that polymer produced by halophile bacteria have high viscosity and plasticity and exhibited strong tolerance with pH, temperature and salt.
Therefore, development of screening and utilization technologies for novel biopolymer using marine microorganisms are being seen to be necessary for sustainable use and conservation of marine resources and reconsideration of domestic competition for high molecular weight substances taking place of the chemical industry.
Ⅲ. Contents and Scope
1. Isolation of biopolymer-producing microroganisms
Isolation of microoganisms from biofilm matrix, seawater and preservation of the isolates
2. Characteriaztion of biofilm-forming bacteria
Identification of biofilm-forming bacteria
Investigation of substrate utilization
Investigation of productivity for biopolymer
3. Selection of microorganisms with high biopolymer-productivity
Isolation and purification of biopolymer
Investigation of substrate utilization
Investigation of flocculation activity
Investigation of emulsion-formation stability
4. Characterization of biopolymer
Investigation of rheological properties EPS-R produced by Hahella
IV. Results
1. Isolation and preservation of exopolysaccharide(EPS)-producing micro-organisms
We isolated various EPS-producing microorganisms from samples collected in Lake Shi-hwa, seashores of South sea, Yellow sea and Cheju Island, etc.
A. The samples were inoculated onto Zobell, SZobell and DZobell agar medium and incubated at a 25℃ for 3 days in the dark. We noticed the colonies with naked eyes and isolated EPS forming bacterial strains. For enhancing the viability of the marine cyanobacteria, the samples were filtered and fixe on a 5 ㎛ cellulose membrane filter and cultured on the ASN-Ⅲ solid medium for 3 weeks at 20℃, 3,000Lux, 16/8h light condition. The EPS-forming colonies were investigated by the naked eye.
B. We set up cleaned slide glasses 2 m beneath the surface of the Lake Shi-Hwa at the pier of Dae-Bu Island from July 20th to 23th in 2000 and collected samples that formed biofilms on the slides. We isolated 77 strains of marine bacteria and 4 strains of marine cyanobacteria for a total of 81 strains.
C. During August 15th to 24th in 2000, we investigated biofilms with the naked eye and collected samples from 32 points from coastal area of the South Sea with much inflows of domestic sewage and other pollutants carried by 4 major rivers. We isolated 678 strains of marine bacteria and 608 strains of cyanobacteria for a total of 1,281 strains.
D. In August and September, the surface water of southern Yellow Sea is oligotrophic due to the formed thermocline and the inflows of Yangtze River is low in salt and relatively eutrophic. It is formed a front line with warmer and salty Kurosio current. We picked 12 points between September 2nd and 8th in 2000 and collected samples by depths using CTD and taking SCM as a standard. We isolated 332 strains of marine bacteria and 4 strains of cyanobacteria for a total of 336 strains.
E. For the storage of the isolated marine bacterial atrains, we dispersed the colonies in a 20% glycerol solution and stored at a -80℃. The marine cyanobacteria were stored at a -80℃ temperature after mixing with DMSO. Since the cell system of the marine cyanobacteria is highly evoluted compared with the marine bacteria, the survival rate of cyanobacteria is somtimes low after storage. Therefore, cyanobacterial strains were stored by subculture in a ASN-Ⅲ liquid medium.
2. Isolation and identification of biofilm-producing bacteria and selection of exopolysaccharide-producing bacteria.
A. We investigated biofilm-forming ability with 139 strains of marine bacterial strains isolated from the Dae-Ho Dike and stored already. The seledted strains were the followings. (98TH11316, 98TH11317, 98TH11318, 98TH11319, 98TH11320, 98TH11321, 98TH11321, 98TH11322, 98TH11323)
B. The eight selected biofilm-forming bacterial strains isolated from the Dae-Ho Dike were identified. We found out that 4 strains(98TH11318, 98TH11319, 98TH11321, 98TH11322) were most similar to Micrococcus luteus, and that the other 4 strains were similar to Bacillus megaterium (98TH11316), Bacillus thuringensis (98TH11323), Staphylococcus subsp. saprophyticus (98TH11317), Sulfidabacter pontiacus (98TH11320), respectively.
C. We investigated the production of EPS by the bacterial strains isolated from the Dae-Ho Dike. Among the selected strains, strain 98TH11316, identified as Bacillus megaterium, produced 2 D.C.W.(g/l) of EPS.
3. Selection of strains with high EPS-production
A. The EPS-forming strains were firstly assorted by the miscroscope(x40). We selected 35 bacterial strains isolated from the South sea area and 57 strains of the Cheju Island and Yellow sea area. 39 strains of cyanobacteria isolated from the South sea area were selected.
B. Among the 92 bacterial strains and 39 cyanobacterial strains selected after 1st step, strain CJ12321 produced 6.95 EPS D.C.W.(g/l) that had the best production of EPS and the CJ12244 had the best productivity with the value of 25.19. For the marine cyanobacteria, strain CY25 reavealed as the best EPS producer with 2.59 EPS D.C.W.(g/l) and also the best productivity with the rate of 14.73.
4. After investigating the flocculation activity of the first assorted strains, bacterial strain CJ12364 showed the best flocculation activity of 3.11(l/OD). This strain had a 6.59 D.C.W.(g/l) of EPS production. From the marine cyanobacteria, strain CY5 showed flocculation activity of 5.59(l/OD) and its production of EPS was 1.86 D.C.W.(g.l)
5. After investigating the emulsion-formation stability of the first selected strains, marine bactrerial strain CJ12414 had the best emulsion-formation stability and its EPS production of this strain was 5.71 D.C.W.(g/l). Marine cyanobacteria strain CY22 had the best emulsion-formation stability with the EPS production of 2.4 D.C.W. (g/l).
6. The rheological properties EPS-R produced by Hahella chejuensis
A. In the concentration of EPS-R between 0.25% and 1.0%, the viscosity of EPS-R was increased following the concentration.
B. The addition of NaCl and CaCl₂in a concentration of 0.25-5.0% and 0.25-2.0%, respectively, influenced the viscosity of EPS-R. As the NaCl concentration increased, viscosity of EPS-R was decreased. In contrast, as the concentration of CaCl₂increased, viscosity of EPS-R increased.
C. The effects of pH were investigated between pH2-pH12. In the acid condition the viscosity of EPS-R tended to decrease and at pH value over than 10, it steeply increased.
D. The heat treatment at 60℃ and 80℃ seemed to increase the viscosity of EPS-R, but at the temperature over 100℃, it steeply decreased.
E. The addition of CaCl₂revealed to decrease the viscosity of EPS-R.
F. The mixture of gellan gum did not show any change in the viscosity.
Ⅴ. Application of this Research
The isolated strains and selected biopolymers will be further studied for the characterization and industrial applications. The construction of D/B system for isolated and conserved microorganisms will help making the continuance of research in related fields and offer for connections between marine microorganisms and bio-industries. This research accumulates fundamental data of the relationship between marine microorganisms and biopolymer plus chemical ecology. Also the analytical technologies will be applied to community analysis of biofilm, biochemistry of biofilm matrix and biofilm-forming mechanism. Through networking of domestic specialists for the application of biopolymer, the screened biopolymer also will be used as target materials for the production of bioactive oligopolysaccharide compounds.

목차 Contents

• 제1장 서론
  제1절 EPS의 구성
  제2절 EPS의 합성
  제3절 EPS의 분비
  제4절 EPS의 물리학적 성질
  제5절 EPS의 생산
  제6절 EPS의 산업적 이용
  제7절 전망
  제2장 국내외 기술개발 현황
  제1절 실용화된 미생물 유래 다당류
  제2절 국외의 EPS 개발 동향
  제3절 국내의 EPS 개발 동향
  제3장 연구개발수행 내용 및 결과
  제1절 연구수행방법
  1. 시료채취 및 해양미생물 분리
  2. 생물막 생성 균주의 선별 및 동정
  3. EPS 생성 균주의 1차 선별
  4. EPS 생성능 측정
  5. 응집활성능 측정
  6. 유화 안정능 측정
  7. Hahella chejuensis 생성 EPS-R의 물성조사
  제2절 연구수행 결과
  1. 시료채취 및 미생물 분리
  2. 생물막 생성 세균의 분리, 동정 및 다당류 생성세균의 선별
  3. 1차 선별된 EPS 생성 균주
  4. EPS 생성능이 우수한 균주의 선별
  5. 응집활